一種生物活性多肽pihnsl及其制備與應用
【技術領域】
[0001]本發明設及蛋白領域，具體設及一種生物活性多膚PIHN化及其制備與應用。
【背景技術】
[0002] 由于生物活性膚作為促進健康的生物活性成分，具有傳遞生理信息，調節生理功 能的作用，對于人體的神經、消化、生殖、生長、運動、代謝、循環等系統的正常生理活動的維 持非常重要。它們不僅具有抗病毒、細菌、抗高血壓、降膽固醇等作用，而且作為免疫調節劑 具有調節免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效，是當前國際食品 界最熱口的研究課題和極具發展前景的功能因子。各種活性膚常作為功能食品添加成分用 于食品的實踐生產，特別是在乳飲料、食品添加劑的應用方面已經取得良好效果。乳源性生 物活性膚的功能及對消費者的健康的影響正備受重視。
[0003]近年來，越來越多的科學研究表明很多來源于生物蛋白的小膚具有多種生物學活 性，如激素作用、免疫調節、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同時， 研究發現小膚可W被人體更好地吸收和利用，改變了傳統的蛋白質只能被降解成氨基酸才 能被吸收利用的觀點。在眾多生物蛋白中各種牛乳蛋白是非常重要的生物活性多膚來源之 一，它們被乳酸菌分解利用，并發生了一系列生理生化反應，使蛋白質變為多膚或者游離的 氨基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉運直接進入人體的血液循環， 發揮其生物活性作用。
[0004] 因此，運些生物活性小膚不僅成為篩選藥物的天然資源寶庫，也是功能性食品工 業的主要原料成分。目前，生物活性膚的制備及其應用開發已經成為世界范圍內研究的熱 點。 陽〇化]免疫活性膚是繼阿片膚發現后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生 物活性膚。1981年，化lies等人首次發現，利用膜蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中 得到一種免疫活性膚段，其氨基酸序列為Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，該短膚被證明在 體外實驗中能夠增強小鼠腹腔巨隧細胞對綿羊血紅細胞的吞隧作用，靜脈注射，則能 增強小鼠對肺炎克氏桿感染的抵抗能力。Elitsur等人經胃蛋白酶處理酪蛋白得到 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu和Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu，研究證明該兩短膚不僅具 有阿片樣活性，也具有免疫調節活性，可增強淋己細胞增殖，提高自然殺傷細胞（NK)能力， 促進隧中性白細胞的移動。張少輝等人利用瑞±乳桿菌發酵脫脂乳獲得了生物活性多膚 犯P化及其降解產物犯PV，經過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進實驗，驗證了多膚犯PV 具有較好的抗氧化生物學活性和促進細胞免疫的活性，一方面能夠清除機體內的自由基， 減少自由基對人體的傷害；另一方面，生物活性多膚犯WL和犯PV還能夠增強機體免疫力， 增強淋己細胞、巨隧細胞的增殖能力，使巨隧細胞一氧化氮誘生量增加，并促巨隧細胞分泌 細胞因子。
[0006]盡管牛乳蛋白內隱含有許多具有生物活性的膚序列，但運些生物活性膚序列只有 通過一定的手段將其釋放出來才能發揮作用。獲取乳蛋白源活性膚的主要手段有兩種：發 酵，利用微生物（乳酸菌）發酵乳源蛋白獲取；酶解，包括來自動物的消化道酶和來自植物 和微生物的蛋白酶。
[0007] 研究結果表明乳源性生物活性膚作為一類小分子物質，W其分子量低、活性強、用 量少的獨特優勢，已越來越多的引起人們的重視。所W它們不僅僅作為功能性食品原料用 于各種功能性食品的制造，而且作為免疫調節劑具有調節免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清 除自由基具有延緩衰老的功效。此外，多數乳源性生物活性膚能夠抵抗胃腸道的消化，在小 腸內W完整的形式被機體吸收，而不必被分解成單個氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性 極高。因此乳源性生物活性膚的能夠提高機體抵御外界不良因素的刺激、降低機體發病率 等功能特性備受重視，有望成為具有清除自由基、減少患癌幾率和延緩衰老的非藥物性物 質原料，在功能性食品和醫藥領域具有非常廣闊的應用前景，今后必將成為國際食品界和 生物醫藥產業界的最熱口的研究課題，為提高人類健康水平、不得病或者說少得病、延緩衰 老、延長壽命發揮重要的作用。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種分離的生物活性多膚PIHN化及其制備與應用。
[0009] 為了實現上述目的及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] 本發明的第一方面，提供了一種分離的生物活性多膚PIHN化，其包括
[0011] (a)由Pr〇-Ile-His-Asn-Ser-Leu(SEQIDNO:1)所示的氨基酸組成的多膚；
[0012] 化）或在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基 酸且具有同等活性的由（a)衍生的多膚。
[0013] 較優的，所述生物活性多膚的來源為乳源性。
[0014] 本發明的生物活性多膚PIHN化為乳源性，具體來源于β-酪蛋白（gen.var.C)，并 且為β-酪蛋白（gen.var.C)(沈QIDNO:2)第65~70位的氨基酸殘基。
[0015] 所述β-酪蛋白（gen.var.C)的氨基酸序列為既有技術，序列如SEQIDNO:2所 示：

[0027] 較優的，所述生物活性多膚PIHN化具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功 能。
[0028] 本發明的生物活性多膚PIHN化可W通過基因工程的方法和化學方法人工合成， 也可W從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。
[0029] 本發明還公開了編碼前述生物活性多膚PIHN化的核巧酸片段。
[0030] β-酪蛋白（gen.var.C)的氨基酸序列W及核巧酸序列為既有技術，編碼β-酪蛋 白（gen.var.C)(SEQIDNO:2)第65~70位的氨基酸殘基的核巧酸片段能編碼成熟的生 物活性多膚PIHN化。
[0031] 本發明第二方面，提供了前述生物活性多膚的制備方法，包括如下步驟： 陽〇巧 1)發酵：將瑞±乳桿菌添加到脫脂乳中進行厭氧發酵，獲得瑞±乳桿菌發酵乳； [003引。破壁：對發酵乳離屯、后得到的菌體進行超聲，破碎菌壁使胞內膚游離，獲得菌 膚混合液；
[0034] 3)多膚的粗提：對步驟2)中的菌膚混合液的進行低溫離屯、分離，取上清液； 陽0對 4)多膚的純化：
[0036]a.對步驟3)的上清液進行超濾處理，收集濾液；
[0037] b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用WatersS巧-pakC18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多膚混合物；
[0038] 5)多膚的消化及穩定性：采用兩步酶解法酶解步驟4)的生物活性多膚混合物，獲 得被消化后的生物活性多膚混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采 用的酶為膜酶。
[0039] 本發明所述脫脂乳為經過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0.1%。 |；0040]較優的，步驟1)中，瑞：t乳桿菌為瑞：t乳桿菌（Xactobacillus helveticus,CICC6024)〇
[0041] 較優的，步驟1)中，所述厭氧發酵的條件為：發酵溫度36~38°C，發酵培養6~ 她；更優選發酵溫度37 °C，發酵培養化。
[0042] 較優的，步驟2)所述離屯、的條件為20°C，4000~5000巧m，離屯、15min.。
[0043] 較優的，步驟2)所述破壁的條件為菌體濃度0. 0238g/ml，破碎功率300W，破碎總 時間26min(超聲3s,間隔5s)。
[0044] 較優的，步驟3)中，所述低溫離屯、的條件為：4°C，8000~10000巧m，離屯、15~ 30min〇
[0045] 較優的，步驟4) a中，所述超濾處理所采用的是截留分子量分別