重組聚多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及可以篩選構建各種長度的重組聚多肽和包含該重組聚多肽的藥物組 合物。
【背景技術】
[0002] 生物活性大分子，一般是不穩定的多肽或者蛋白質，大部分半衰期都較短，為了維 持一定的療效需要大劑量頻繁給藥，長期的反復注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發一 系列副反應。另外，許多生物活性肽和蛋白質只具有有限的溶解度，或者在重組生產過程中 易聚集，需要復雜的溶解和重折疊過程。多種化學聚合物可以連接到這些蛋白質上以改變 其性質。特別有意義的是具有柔性構象并且在水溶液中良好水合的親水性聚合物。一種常 用的聚合物是聚乙二醇(PEG)，目前已用于多種蛋白質藥物或非蛋白質藥物的修飾，在國外 已經上市的PEG化藥物已達11種，并且國內外有多種PEG化藥物在研或者已經進入臨床。這 些聚合物常常具有依賴于它們分子量的較大的流體動力學半徑，并且會顯著增強藥代動力 學性質。但PEG修飾蛋白質類藥物需要額外的下游工藝和純化步驟，從而會降低產量、增加 成本;并且，常用的PEG化修飾位點是賴氨酸和蛋白質的N-端氨基酸殘基，這種隨機性的修 飾方式會形成多種結構，影響PEG修飾后的蛋白質純化，這種不均一性也會影響修飾后的蛋 白質活性，因此需要開發PEG的定點修飾技術；同時現在大量臨床實驗發現反復長期給予 PEG化的藥用蛋白后，可能會形成抗PEG的抗體介導機體對藥用蛋白的清除；在動物實驗中 發現PEG還可能在組織中蓄積，嚴重時可對腎臟造成損傷。
[0003] 白蛋白和免疫球蛋白片段如Fc區也已經用于偶聯其它生物活性蛋白質，但在半衰 期或免疫原性提高方面具有不可預測的結果。遺憾的是，Fc融合或者白蛋白融合都需要在 真核重組表達系統中進行。這是一個耗時的、昂貴的過程。因此，仍然非常需要能夠提高生 物活性多肽或蛋白質安全性和藥學性質的聚合物和方法。
[0004] 近年來研究，為了解決PEG修飾的問題，開發了模擬PEG的聚多肽融合技術。模擬 PEG的聚多肽融合技術經過了多年的發展，從一開始的天然來源的聚多肽、明膠樣蛋白聚多 肽、彈性蛋白樣聚多肽、多聚谷氨酸、多聚甘氨酸到現在的最新的XTEN技術（如專利 102348715A記載）。聚多肽XTEN技術已經可以解決原有聚多肽免疫原性高、易聚集、不能顯 著增加半衰期等問題。目前，聚多肽融合技術雖還在發展的初期，但XTEN修飾的長效rhGH已 經進入了臨床Phase II期，XTEN修飾的Exendin-4也進入臨床Phase I期，我們相信聚多肽 技術將會為多肽和蛋白質類藥物長效化提供更好的選擇。現有模擬PEG的聚多肽融合技術 具有以下諸多優點：1.通過基因工程技術構建，可與藥用蛋白融合表達，避免了體外PEG化 學偶聯和修飾后的純化步驟;2.區別于PEG修飾技術融合表達的聚多肽鏈是完全可生物降 解的；3 .動物實驗結果表明，這些PEG模擬肽都是安全和低免疫原性的；4.多肽鏈有確切的 長度和氨基酸組成，可通過調節多肽鏈長度，調節融合蛋白的半衰期；5.適用范圍廣泛，原 核、真核系統都可以表達。與PEG修飾相比，聚多肽在下游純化、免疫原性、安全性等方面都 具有明顯的優勢。但新型聚多肽XTEN融合技術并沒有完全模擬PEG。XTEN帶有顯著的負電荷 (Schellenberger，Volker，et al .Nature biotechnology27.12(2009): 1186-1190.)，區別 與傳統的PEG修飾技術，顯著負電荷存在著一些缺點：1.影響藥物的組織分布;2.減低與革巴 受體的親和力，降低生物活性;并且XTEN基本是由非重復基序組成，篩選過程復雜且龐大。 因此，仍然需要建立篩選過程相對簡單的模擬PEG的聚多肽分子用于提高生物活性蛋白質 的藥用性質。

【發明內容】

[0005] 本發明涉及能夠用于提高生物活性蛋白質的生物學、藥學、安全性和治療性質的 組合物和方法。該組合物和方法可用于提高藥代動力學性質，如半衰期，延長生物活性蛋白 質治療窗內停留的時間，以及簡化這種生物活性蛋白質的生產過程和藥學性質，如溶解性。
[0006] 部分上，本發明涉及包含融合蛋白的藥物組合物及其在治療疾病、障礙或病癥中 的應用。可以治療的具體的疾病取決于生物活性蛋白質的選擇。
[0007] 本發明提供聚多肽的組合物，當重組聚多肽連接到生物活性蛋白質時提高藥代動 力學性質，和/或治療活性。這樣的組合物可以用于治療某些疾病、障礙或病癥。得到的融合 蛋白可以表現出更好的安全性性質，并且允許頻率較低的給藥，這又導致了更好的患者依 從性。本發明也提供了編碼聚多肽與聚多肽連接的生物活性蛋白質的融合蛋白的多聚核苷 酸序列。
[0008] 本發明提供分離的聚多肽，其包含超過大約100至大約5000個氨基酸殘基，其中該 聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)和賴氨酸(K) 六種氨基酸殘基的總和占聚多肽總氨基酸序列的超過大約95%以上;聚多肽序列是可重復 的;通過G0R算法確定，該聚多肽序列至少具有95 %的無規則卷曲形成;通過Chou-Fasman算 法確定，該聚多肽序列具有α螺旋和β折疊的總和小于2%。
[0009] 作為優化方案，本發明提供包含超過大約100至大約5000個氨基酸殘基的聚多肽， 其中該聚多肽的特征在于由短序列組成，重復的短序列可以占到總序列大約30%以上，其 中每個短序列具有大約8至24個氨基酸殘基，其中任意一種氨基酸在序列中都不會連續出 現，該序列由甘氨酸(G)、丙氨酸(Α)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(Τ)、脯氨酸(Ρ)和賴氨酸(Κ)中的3-6種類型的氨基酸組成。該聚多肽當連接到生物活性蛋白質時增強生物活性蛋白質的藥代 動力學性質，其中藥代動力學性質通過測定施用于受試者的生物活性蛋白質的血漿半衰期 與連接到生物活性蛋白質并以相當的劑量施用于受試者的聚多肽融合蛋白來確定。
[0010] 在上述實施方案的一些情況中，沒有一種類型的氨基酸占聚多肽序列的50%以 上，沒有任何一種類型的氨基酸會連續出現。
[0011] 在一些情況中，分離的具有上述實施方案的聚多肽的融合蛋白包括胰島素、胰島 血糖素樣肽-1、胰高血糖素、蜥外泌肽-4、生長激素、促卵泡激素、甲狀腺激素、降鈣素、促紅 細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、胰島素樣生長因子-1、干擾素_α、干擾素_β、干擾素-γ、 人成纖維細胞因子-21、白介素-IRa、白介素-2、凝血因子Vila、天冬酰胺酶、凝血因子VIII、 凝血因子IX及其他蛋白類或多肽藥物。
[0012] 在一些實施方案中，所得融合蛋白的增強的藥代動力學性質包括血漿半衰期提高 至至少5倍。
[0013] 在一個實施方案中，分離的融合蛋白與未連接到聚多肽的生物活性蛋白質相比可 以具有較低的免疫原性，其中通過在給受試者施用相當劑量后測定選擇性結合生物活性蛋 白質的IgG抗體的產生確定免疫原性。
[0014] 在一個實施方案中，本發明提供一種分離的融合蛋白，與聚多肽進行融合的蛋白 其表現出與表24的序列至少大約90 %的序列同一性。其中聚多肽包含超過大約100至大約 5000個氨基酸殘基，其中該聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸 (T)、脯氨酸（P)和賴氨酸(K)六種氨基酸殘基的總和占聚多肽總氨基酸序列的超過大約 95%以上;通過G0R算法確定，該聚多肽序列至少具有95 %的無規則卷曲形成;通過Chou-Fa s ma η算法確定，該聚多肽序列具有α螺旋和β折疊的總和小于2 %。
[0015] 在一個實施方案中，本發明提供的分離的融合蛋白與含有大量谷氨酸殘基的帶有 顯著負電荷的聚多肽的融合蛋白相比，具有較高的對相應靶受體的結合親和力。在一個實 施方案中，該聚多肽融合蛋白表現出與靶受體的結合，其范圍為帶有負電荷的聚多肽的融 合蛋白的相應靶受體的結合能力的大約120%_150%。
[0016] 其中，與該聚多肽進行融合的蛋白可以設計為具有不同的融合方式，可以在生物 活性蛋白質的Ν端或者C端融合，可以根據不同的需求，選擇不同的融合位置。
[0017] 其中，與該聚多肽進行融合的蛋白可以融合不止一個的生物活性蛋白質；融合蛋 白中也可以含有不止一個聚多肽序列。
[0018] 本發明提供分離的核酸，其包含選自以下的多核苷酸序列：（a)編碼上述任一實施 方案的融合蛋白的多核苷酸及其多核苷酸的互補序列；（b)上述表達的任一表達載體進一 步包含連接到多核苷酸序列的重組調節序列。
[0019] -種改善生物活性蛋白質的性質的方法，包括將生物活性蛋白質連接到該聚多肽 以實現一種性質的步驟，該性質的特征在于：（a)連接到聚多肽的生物活性蛋白質的血漿半 衰期比未連接到聚多肽的生物活性蛋白質的血漿半衰期長；（b)因聚多肽本身完全不帶電 荷的性質，連接到聚多肽的生物活性蛋白質與未連接到聚多肽的生物活性蛋白質相比，生 物活性并未有顯著改變；（c)連接到聚多肽的生物活性蛋白質在生理條件下的溶解度比未 連接到聚多肽的生物活性蛋白質的溶解度提高；（d)當施用于受試者時選擇性結合連接到 聚多肽的生物活性蛋白質的IgG抗體的產生比當以相當的劑量向受試者施用未連接到聚多 肽的生物活性蛋白質時IgG的產生減少；（e)連接到聚多肽的生物活性蛋白質當比未連接到 聚多肽的生物活性蛋白質施用于受試者時只需要更低的給藥頻率。
[0020] 有益效果
[0021] 1.本發明首次利用建庫篩選的方法得到穩定的、無結構的、低免疫原性的由甘氨 酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和賴氨酸中的3-6種類型的氨基酸構成的各種長度的聚 多肽，并且因為聚多肽序列是可重復的，相較于基本非重復序列可以利用構建的篩選系統 進行快速的篩選，即降低了篩選工作量又保證了聚多肽優越的性質。
[0022] 2.本發明構建的聚多肽模擬PEG修飾技術，可以通過顯著的增加流體動力學體積 從而顯著延長半衰期，此新型聚多肽隨著序列長度的增加，融合蛋白的半衰期會出現高于 比例的延長;并且該聚多肽克服了原有帶顯著負電荷聚多肽易降低與靶受體親和力的缺 點。
[0023] 3.本發明構建并表達了多種聚多肽與生物活性蛋白質的融合蛋白，具有增強穩定 性、延長半衰期、降低免疫原性、不改變生物活性等諸多優點，其有望成為生物活性分子的 新型改造策略。
【附圖說明】
[0024]本發明的特征和優點可以參考以下詳細說明和闡述說明性實施方案的附圖進一 步解釋。
[0025]圖1顯示聚多肽融合蛋白的原理示意圖。FGF21為示意分子，聚多肽可以和任意多 肽或蛋白質藥物融合表達。圖中顯示的表達載體，可以為真核表達載體或者為原核表達載 體。聚多肽可以連接在生物活性大分子藥物的N端或者C端，這取決于生物活性分子的活性 中心而定。圖中的聚多肽長度可以為多種長度，長度可按照對于融合蛋白的半衰期的要求 而定。
[0026] 圖2是聚多肽基因的示例性多核苷酸構建體的示意圖。各氨基酸序列（如9氨基酸 或10氨基酸序列)通過自連接反應連接得到更長的序列，將聚多肽插入GFP篩選載體的BspQ I位點。BspQ I位點始終位于插入片段的5'端，可根據需求不斷插入序列，從而達到我們需 要的長度，進行篩選。
[0027] 圖3是聚多肽裝配、生產和評價的典型步驟的示意流程圖。短序列文庫的裝配是隨 機的過程，必然會出現短序列的連續重復出現，因此聚多肽序列中短序列是可重復的，并且 會有一定的比值。
[0028] 圖4是改造的篩選質粒DMT-GFP示意圖及酶切鑒定圖。圖B中顯示一種篩選載體，來 自于多點突變pET28a( + )載體而得。通過單酶切鑒定，該載體只含有一個BspQ I位點。圖A瓊 脂糖核酸電泳中1泳道為pET28a-GFP質粒，2泳道為pET28a-GFP質粒BspQ I單酶切，3泳道為 DMT-GFP質粒，4泳道為DMT-GFP質粒BspQ I單酶切。
[0029] 圖5是短序列自連接反應瓊脂糖電泳圖。
[0030] 圖6顯示包含GFP和聚多肽序列的所示構建圖的表達實驗的結果。使用