用于酶抑制的化合物的制作方法
【專利說明】用于酶抑制的化合物
[0001] 本申請是以下申請的分案申請：申請日：2006年11月9日；【申請號】 200680050739. 7 (PCT/US2006/043503);發明名稱："用于酶抑制的化合物"。
[0002] 發明背景
[0003] 在真核生物中，蛋白質的降解主要是通過泛蛋白途徑介導的，其中需要破壞的靶 蛋白與76個氨基酸的多肽泛蛋白相連接。一旦與靶蛋白連接，泛蛋白化蛋白質就充當26S 蛋白酶體的底物，26S蛋白酶體是一種多催化功能蛋白酶，通過其三種主要的蛋白水解活性 將蛋白質切割成為短肽。盡管蛋白酶體介導的降解在胞內蛋白質更新中具有基本功能，但 是它在I類主要組織相容性復合體（MHC)呈遞、細胞凋亡、細胞分裂和NF-κB激活等許多 過程中都具有關鍵性作用。
[0004] 20S蛋白酶體是一種700kDa圓柱形多催化功能蛋白酶復合體，由28個亞基組成， 這28個亞基構成4個環，其在細胞生長調節、I類主要組織相容性復合體呈遞、細胞凋亡、抗 原加工、NF-κB激活以及促炎信號轉導中都具有重要作用。在酵母和其它真核生物中，7個 不同的α亞基構成外環，7個不同的β亞基構成內環。亞基作為19S(PA700)和11S(PA28) 調節復合體的結合位點，也是2個β亞基環構成的內部蛋白水解腔的物理屏障。因此，一 般認為蛋白酶體在體內以26S顆粒（"26S蛋白酶體"）存在。體內實驗已經證明，抑制20S 形式的蛋白酶體，很容易與抑制26S蛋白酶體聯系起來。在顆粒形成期間，切割β亞基氨 基端前序列后，用作催化親核基團的氨基端蘇氨酸殘基被暴露出來。因此，蛋白酶體中負 責催化活性的亞基具有氨基端親核殘基，這些亞基屬于Ν端親核（Ntn)水解酶家族（例如， 親核N端殘基為Cys、Ser、Thr和其它親核部分）。該家族包括例如青霉素G酰基轉移酶 (PGA)、青霉素V酰基轉移酶（PVA)、谷氨酰胺PRPP酰胺轉移酶（GAT)和細菌糖基天冬酰胺 酶。高等脊椎動物除了具有普遍表達的β亞基以外，還具有三種γ-干擾素-誘導性β 亞基（LMP7、LMP2和MECL1)，它們分別替代其正常對應物X、Υ和Ζ，由此改變蛋白酶體的催 化活性。通過利用不同的肽底物，已定義了真核生物20S蛋白酶體的三種主要蛋白水解活 性：胰凝乳蛋白酶樣活性（CT-L)，它在大的疏水殘基后切割；胰蛋白酶樣活性（T-L)，它在 堿性殘基后切割；肽基谷氨酰肽水解活性（PGPH)，它在酸性殘基后切割。蛋白酶體還有另 外兩個次要的特征性活性：BrAAP活性，它在支鏈氨基酸后切割；SNAAP活性，它在小的中性 氨基酸后切割。蛋白酶體的主要蛋白水解活性似乎是受益于不同的催化位點，因為抑制劑、 β亞基中的點突變以及γ干擾素誘導性β亞基互換使這些活性發生不同程度的變化。
[0005] 近年來，蛋白酶體已成為吸引人的治療干預癌癥、免疫和自免疫疾病、炎癥、局部 缺血疾病、神經變性疾病和其他疾病的靶點。到目前為止，FDA批準的唯一蛋白酶體抑制劑 為硼替佐米（VELCADE?)，然而，目前正在對其他幾種蛋白酶體抑制劑進行臨床評價。到現 在為止，所有這些治療的蛋白酶體抑制劑目前均通過IV給藥。蛋白酶體抑制劑在治療血液 惡性腫瘤（例如骨髓瘤和淋巴瘤）中的臨床應用部分受限于通常需要IV給藥，其將通過口 月艮（Ρ0)給藥得到改善。然而，由于這些分子的肽本性，Ρ0給藥后這些抑制劑的系統暴露取 決于多個因素，這些因素包括胃的ΡΗ、胃腸肽酶、外排栗、膽汁排泄以及腸和肝的代謝活性。
[0006] 用于克服肽被酶降解和增強從消化道至血液的吸收的方法包括制備結構上更不 象肽同時分子量變小的類似物。當所述肽類似物口服給藥后獲得了令人滿意的血液濃度 時，或者在蛋白酶體抑制劑的情況，當蛋白酶體在血液中的活性令人滿意地降低時，認為此 類方法取得了成功。
[0007] 上述方法已用于制備肽環氧酮蛋白酶體抑制劑類似物，從而使其可口服。
[0008] 發明概述
[0009]本發明涉及通常稱為肽α'，β'-環氧化物和肽α'，β'-氮丙啶的分子。我們 認為母體分子可有效地、不可逆地、選擇性地與Ν端親核（Ntn)水解酶結合，并且可以特異 性地抑制具有多催化活性的酶的某些特殊活性。
[0010] 曾經認為，蛋白酶體僅僅負責破壞變性蛋白和錯折疊蛋白，但是現在認為蛋白酶 體是組成型蛋白水解機器，通過信號依賴性方式的降解作用來調節各種胞內蛋白水平。因 此，非常有益的是，鑒定出能夠特異性干擾蛋白酶體活性和其它Ntn水解酶活性的試劑，從 而用作探針以研究這些酶在生物過程中的作用。本文描述、合成并研究了靶向Ntn水解酶 的化合物。本文公開了能夠有效地、選擇性地、不可逆地抑制特定蛋白酶體活性的肽環氧化 物和肽氮丙啶，并且要求保護這些化合物。
[0011]與其它幾種基于肽的抑制劑不同，本文描述的肽環氧化物和肽氮丙啶在高達 50μΜ的濃度下不會明顯抑制非蛋白酶體的蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋 白酶Β、木瓜蛋白酶和f丐蛋白酶。在更高濃度時，可能會觀察到抑制作用，但是如果所述抑 制劑僅僅與底物競爭，將是競爭性的且可逆的抑制。新的肽環氧化物和肽氮丙啶還可抑制 NF-kB激活以及穩定細胞培養物中的p53水平。此外，這些化合物具有抗炎活性。因而，這 些化合物可以是獨特的多功能分子探針，用于研究Ntn酶在正常生物過程及病理過程中的 功能。
[0012] -方面，本發明提供含有含雜原子三元環的抑制劑。這些抑制劑在約50μΜ以下 的濃度時，可以抑制Ν端親核水解酶（例如20S蛋白酶體或26S蛋白酶體）的催化活性。就 20S蛋白酶體而言，特定的水解酶抑制劑在約5μΜ以下的濃度時，抑制20S蛋白酶體的胰凝 乳蛋白酶樣活性，而不會抑制20S蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性或PGPH活性。所述水解酶抑 制劑可以是例如肽α'，β'-環氧酮或α'，β'-氮丙啶酮，所述肽可以是四肽。所述 肽可以包含支鏈或直鏈的側鏈，例如氫、Q6烷基、Ci6羥基烷基、Ci6烷氧基烷基、芳基、Ci6 芳烷基、Q6烷基酰胺、Ci6烷基胺、Ci6羧酸、Ci6羧基酯、Ci6烷基硫醇或Ci6烷基硫醚，例 如異丁基、1-萘基、苯基甲基和2-苯基乙基。α'，β' -環氧酮或α'，β' -氮丙啶酮的 α 碳可以為手性碳原子，例如（R)或β構型的碳，如本文定義的手性碳原子。
[0013]另一方面，本發明提供藥物組合物，其中包含藥物可接受載體和藥物有效量的水 解酶抑制劑，它改善神經變性疾病（例如阿爾茨海默病）、肌肉萎縮病、癌癥、慢性傳染病、 發熱、肌肉廢用、去神經、神經損傷、禁食以及免疫相關性疾病等的影響。
[0014] 另一方面，本發明提供可口服的化合物和藥物組合物。
[0015] 另一方面，本發明提供抗炎組合物。
[0016] 另一方面，本發明提供以下的方法：抑制或減輕患者的HIV感染；影響患者的病毒 基因表達水平；改變生物體中蛋白酶體產生的各種抗原肽；測定生物體的細胞、發育或生 理過程或輸出量是否由特定Ntn水解酶的蛋白水解活性調節；治療患者的阿爾茨海默病； 降低細胞的肌肉蛋白降解速率；降低細胞的胞內蛋白降解速率；降低細胞的P53蛋白降解 速率；抑制患者的P53相關性癌生長；抑制細胞的抗原呈遞；抑制患者的免疫系統；抑制生 物體的IκΒ-α降解；減少細胞、肌肉、器官或患者中NF-κB含量；影響細胞周期蛋白依 賴性真核細胞周期；治療患者的增殖性疾病；影響細胞的癌基因蛋白的蛋白酶體依賴性調 節；治療患者的癌生長；治療患者的Ρ53相關性細胞凋亡；篩選細胞的Ν端親核水解酶加工 的蛋白。所有上述方法都包括給予患者、細胞、組織、器官或生物體或使其接觸有效量的含 有本文公開水解酶抑制劑的組合物。
[0017] 根據下面的發明詳述和權利要求書，本發明的其它特征和優點將會是顯而易見 的。
[0018] 發明詳述
[0019] 本發明涉及可用作酶抑制劑的化合物。這些化合物通常可用于抑制在Ν端具有親 核基團的酶。例如，含有在側鏈具有親核基團的Ν端氨基酸（例如蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨 酸）的酶或酶亞基的活性，可以被本文描述的酶抑制劑成功地抑制。在Ν端具有非氨基酸 親核基團（例如保護基或糖基）的酶或酶亞基的活性，也可被本文描述的酶抑制劑成功地 抑制。
[0020] 雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是認為Ntn的Ν端親核基團與本文所述酶 抑制劑的環氧官能團構成共價加合物。例如，在20S蛋白酶體的0 5/Pre2亞基中，一般認 為，N端蘇氨酸在與下文描述的肽環氧化物或肽氮丙啶反應后，不可逆地形成嗎啉代或哌嗪 基加合物。以上加合物形成過程將涉及環氧化物或氮丙啶的開環裂解。
[0021] 在含有連接至α'碳的這種基團的實施方案中，α碳（構成環氧環或氮丙啶 環部分的碳）的立體化學構型可以是（R)或（S)。本發明在某種程度上基于本文公開的結 構-功能信息，這些信息表明了下述的優選立體化學關系。注意，優選的化合物可能含有多 個立體中心，這些立體中心具有所指出的上-下關系（或者β-α關系，其中圖示的β在 紙平面以上）或（R)-(S)關系（即不需要化合物中所有立體中心都符合指出的優選狀態）。 在某些優選實施方案中，α'碳的立體化學結構是（R)，即X原子為β或在分子平面以上。
[0022] 關于立體化學結構，遵循測定絕對立體化學結構的Cahn-Ingold-Prelog規則。 例如OrganicChemistry(Fox和Whitesell;JonesandBartlettPublishers，Boston， MA(1994);第5-6節，pl77-178,該節內容通過引用結合到本文中）介紹了這些規則。肽類 可以具有重復的主鏈結構，側鏈從主鏈單元延伸出來。通常，每個主鏈單元都有與其連接的 側鏈，雖然在某些情況下，側鏈是氫原子。在其它實施方案中，并不是所有主鏈單元都連接 有側鏈。可用于肽環氧化物或肽氮丙啶的肽具有兩個或以上的主鏈單元。在某些可用于抑 制蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣（CT-L)活性的實施方案中，存在2-4個主鏈單元，而在某些 可用于CT-L抑制的優選實施方案中，存在3個主鏈單元。
[0023] 從主鏈單元延伸的側鏈可包括天然脂族或芳族氨基酸側鏈，例如氫（甘氨酸）、甲 基（丙氨酸）、異丙基（纈氨酸）、仲丁基（異亮氨酸）、異丁基（亮氨酸）、苯基甲基（苯丙 氨酸）以及構成氨基酸脯氨酸的側鏈。側鏈還可以是其它支鏈或直鏈的脂族或芳族基團， 例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生基團，例如1-苯基乙基、2-苯基乙基、 (1 _蔡基）甲基、（2_蔡基）甲基、1_(1_蔡基）乙基、1_(2_蔡基）乙基、2_(1_蔡基）乙基、 2-(2-萘基）乙基和類似組合基團。所述芳基可以被以下基團進一步取代：支鏈或直鏈C16 烷基、取代的烷基、乙酰基等，或者其它芳基或取代的芳基（例如苯甲酰基等）。雜芳基和雜 環基也可用作側鏈取代基。雜芳基包括含氮、氧和硫的芳基，例如噻吩基、苯并噻吩基、萘并 噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、異苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶 基、吡嗪基、吲哚基、嘌呤基、喹啉基等。雜環基包括四氫呋喃、哌啶、哌嗪、吡咯烷、嗎啉、內 酯和內酰胺等。
[0024] 在某些實施方案中，極性或帶電殘基可以被引入肽環氧化物或肽氮丙啶。舉例來 講，可以引入天然氨基酸，例如含羥基（Thr、Tyr、Ser)或硫（Met、Cys)的氨基酸，以及非必 需的氨基酸，例如氨基乙磺酸、肉毒堿、瓜氨酸、胱氨酸、鳥氨酸和正亮氨酸等。也可以包含 非天然的含帶電或極性部分的側鏈取代基，例如含一個或多個羥基、短鏈烷氧基、硫基、硫 代、羧基、酯基、二氧磷基、酰胺基或氨基的Q6烷基或C6 12芳基，或者被一個或多個鹵原子 取代的上述取代基。在某些優選實施方案中，在肽部分的側鏈上存在至少一個芳基。
[0025]在部分實施方案中，主鏈單元為酰胺單元[-NH-CHR-C( = 0) _]，其中R為側鏈。這 樣的標示沒有排除天然的氨基酸脯氨酸或其它非天然的環狀仲氨基酸，本領域技術人員能 夠理解這一點。
[0026] 在其它實施方案中，主鏈單元為N-烷基化酰胺單元（例如N-甲基等）、烯烴類 似物（其中一個或多個酰胺鍵被烯鍵替代）、四唑類似物（其中四唑環使主鏈呈順式構 型）、或者這些主鏈鍵的組合。在另外一些實施方案中，氨基酸α-碳被α-烷基取代修 飾，例如氨基異丁酸。在另外一些實施方案中，側鏈被局部修飾，例如通過4￡或△ Ζ脫氫 修飾，其中雙鍵位于側鏈的α和β原子之間，或者例如通過△ζ環丙基修飾，其中 環丙基位于側鏈的α和β原子之間。在另外一些利用氨基酸基團的實施方案中，可以 使用D-氨基酸。其它實施方案可以包括側鏈與主鏈環化、形成二硫鍵、形成內酰胺、形成 偶氮鍵以及下述文獻闡述的其它修飾：Hruby和Boteju:"PeptidesandMimics，Design ofConformationallyConstrained'，，RobertA.Meyers主編：''MolecularBiologyand Biotechnology：AComprehensiveDeskReference'，，VCHPublishers(1995)，p. 658-664， 通過引用結合到本文中。
[0027] 本發明一方面涉及具有式（I)結構的化合物或其藥學可接受的鹽：
[0028]
[0029] 其中
[0030]L選自C= 0、C=S和S02，優選C= 0;
[0031]X選自 0、S、NH和N-C! 6烷基；
[0032]Z表示不存在、Q6烷基或Ci6烷氧基，優選不存在；
[0033]R1、R2和R3各自獨立選自氫、C i6烷基、C i6烯基、C i6炔基、C i6羥基烷基、C i6烷氧 基烷基、芳基、Ci6芳烷基、雜芳基、雜環基、ci6雜環烷基、ci6雜芳烷基、碳環基和ci6碳環 烷基；
[0034] R4選自氫、C i6芳烷基和C i6烷基；
[0035] R5為雜芳基；和
[0036] R6和R7獨立選自氫、C i6烷基和C i6芳烷基。
[0037]在某些實施方案中，R1、R2和R3獨立選自氫、Ci6烷基、Ci6羥基烷基、Ci6烷氧基烷 基、Q6芳烷基、Ci6雜環烷基、Ci6雜芳烷基和Ci6碳環烷基。在某些實施方案中，R\R2和 R3中的任個獨立為選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基和異丁基的Ci6烷基。在 某些實施方案中，R\R2和R3中的任一個獨立為Ci6羥基烷基。在某些優選的此類實施方案 中，R\R2和R3中的任一個獨立選自羥甲基和羥乙基，優選羥甲基。在某些實施方案中，R1、 R2和R3中的任一個獨立為Ci6烷氧基烷基。在某些此類實施方案中，R1、R2和R3中的任一 個獨立選自甲氧基甲基和甲氧基乙基，優選甲氧基甲基。在某些實施方案中，R\R2和R3中 的任一個獨立為Q6雜芳烷基。在某些此類實施方案中，R1、R2和R3中的任一個獨立選自咪 唑基甲基、吡唑基甲基、噻唑基甲基和吡啶基甲基，優選咪唑-4-基甲基、噻唑-4-基甲基、 2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基或4-吡啶基甲基。在某些實施方案中，R\R2和R3中的任一 個獨立為C16芳烷基。在某些此類實施方案中，R\R2和R3中的任一個獨立選自苯基甲基 (芐基）和苯基乙基，優選苯基甲基。在某些實施方案中，R\R2和R3中的任一個獨立為C16 碳環烷基。在某些此類實施方案中，R1為環己基甲基。在某些實施方案中，R\R2和R3均不 同。在某些實施方案中，R\R2和R3中的任兩項相同。在某些實施方案中，R\R2和R3均相 同。
[0038] 在某些實施方案中，R1和R2中的至少一個選自C i6羥基烷基和C i6烷氧基烷基。 在某些此類實施方案中，R1和R2中的至少一個為烷氧基烷基。在某些此類實施方案中，R1 和R2中的至少一個選自甲氧基甲基和甲氧基乙基。
[0039]在某些實施方案中，R3選自C i6烷基和C i6芳烷基，優選C i6烷基。在某些此類實 施方案中，R3選自甲基、乙基、異丙基、仲丁基和異丁基。在某些此類實施方案中，R3為異丁 基。在某些可供選擇的實施方案中，R3選自苯基甲基和苯基乙基，優選苯基甲基。
[0040] 在某些實施方案中，R4、R6和R7獨立選自氫和甲基，優選氫。
[0041]在某些實施方案中，R5為5-或6-元雜芳基。在某些此類實施方案中，R5選自異 II唑、異噻唑、呋喃、噻吩、囉唑、噻唑、吡唑或咪唑，優選異囉唑、呋喃或噻唑。
[0042] 在某些實施方案中，R5為雙環雜芳基。在某些此類實施方案中，雙環雜芳基選自苯 并異嘯:唑、苯并fl:唑、苯并噻唑或苯并異噻唑。
[0043] 在某些實施方案中，L為C= 0，Z不存在，R5為異輕;唑-3-基或異囉唑-5-基。在 某些優選的此類實施方案中，當異_唑-3-基被取代時，其至少在5-位被取代。在某些優 選實施方案中，當異曝唑-5-基被取代時，其至少在3-位被取代。
[0044]在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為未取代的異噁唑-3-基。
[0045] 在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為取代的異_唑-3_基。在 某些此類實施方案中，R5為被選自C16烷基、C16烷氧基、C16烷氧基烷基、C16羥基烷 基、羧基（carboxylicacid)、氨基甲酰基（aminocarboxylate)、C16烷基氨基甲酰基 (Q6alkylaminocarboxylate)、（Q6烷基）2氨基甲酰基（（C丄 6alkyl)2aminocarboxylate)、 Q6烷氧基羰基（Ci6alkylCarb〇Xylate)、Q6雜芳烷基、Ci6芳烷基、Ci6雜環烷基和Ci6碳 環烷基的取代基取代的異嗯唑-3-基。在某些優選的此類實施方案中，R5為被選自甲基、 乙基、異丙基和環丙基甲基的取代基取代的異曝唑-3-基。
[0046]在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為被4-至6-元含氮C16雜環烷基 取代的異丨唑-3-基。在某些此類實施方案中，R5為被氮雜環丁基甲基（優選氮雜環丁 烷-1-基甲基）取代的異曙唑-3-基。在某些可供選擇的此類實施方案中，L為C= 0,Z 不存在，R5為t
取代的異囉唑-3-基，其中W為0、NR或CH2,R為Η或Q6烷 基。在某些此關頭施力菜甲，W為0。
[0047]在某些實施方案中，L為C= 0,Ζ不存在，R5為被5-元含氮Ci6雜芳烷基（例如 吡唑基甲基、咪唑基甲基或三唑-5-基甲基，優選1，2,4-三唑-5-基甲基）取代的異_ 唑-3-基。
[0048]在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為被Ci6烷氧基或Ci6烷氧基烷基 (優選甲氧基、乙氧基、甲氧基甲基或甲氧基乙基）取代的異囉唑-3-基。
[0049]在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為被Ci6羥基烷基（優選羥甲基或羥 乙基）取代的異囉唑-3-基。
[0050] 在某些實施方案中，L為C= 0，Z不存在，R5為被羧基、氨基甲酰基、q6烷基氨基 甲酰基、6烷基）2氨基甲酰基或Ci6烷氧基羰基取代的異螺唑-3-基。在某些此類實施 方案中，R5為甲氧基羰基或乙氧基羰基，優選甲氧基羰基取代。
[0051]在某些實施方案中，L為C= 0，Z不存在，R5為未取代的異唑-5-基。
[0052] 在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為取代的異罐唑-5-基。在某些此 類實施方案中，R5為被選自Ci6烷基、Ci6烷氧基、Ci6烷氧基烷基、Ci6羥基烷基、羧基、氨基 甲酰基、Q6烷基氨基甲酰基、（Ci6烷基）2氨基甲酰基、Ci6烷氧基羰基、Ci6雜芳烷基、Ci6 芳烷基、Q6雜環烷基和Ci6碳環烷基的取代基取代的異:囉唑-5-基。在某些優選的此類 實施方案中，R5為被選自甲基、乙基、異丙基和環丙基甲基的取代基取代的異:囉唑-3-基。
[0053] 在某些實施方案中L為C= 0,Z不存在，R5為被4-至6-元含氮Ci6雜環烷基取代 的異囉唑-3-基。在某些此類實施方案中，R5為被氮雜環丁基甲基（優選氮雜環丁烷-1-基 甲基）取代的異嚼唑-5-基。在某些可供選擇的此類實施方案中，L為C= 0，Z不存在，R5 為I
Z代的異_唑-3-基，其中W為0、NR或CH2,R為Η或Q6烷基。在某 些此類實施方案中，W為0。
[0054]在某些實施方案中，L為C= 0,Ζ不存在，R5為被5-元含氮Ci6雜芳烷基（例如 吡唑基甲基、咪唑基甲基或三唑-5-基甲基，優選1，2,4-三唑-5-基甲基）取代的異囉 唑-5-基。
[0055]在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為被Ci6烷氧基或Ci6烷氧基烷基 (優選甲氧基、乙氧基、甲氧基甲基或甲氧基乙基）取代的異喔唑-5-基。
[0056] 在某些實施方案中，L為C= 0,Z不存在，R5為被Ci6羥基烷基（優選羥甲基或羥 乙基）取代的異囉唑-5-基。
[0057] 在某些實施方案中，L為C= 0，Z不存在，R5為被羧基、氨基甲酰基、q6烷基氨基 甲酰基、6烷基）2氨基甲酰基或Ci6烷氧基羰基取代的異囉唑-3-基。在某些此類實施 方案中，R5為甲氧基羰基或乙氧基羰基，優選甲氧基羰基取代。
[0058] 在某些實施方案中，式I化合物選自以下化合物：
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]