抗嗜酸細胞活化趨化因子抗體在治療炎癥性腸病中的應用
【專利說明】抗嗜酸細胞活化趨化因子抗體在治療炎癥性腸病中的應用 發明領域
[0001] 本發明提供了非天然抗體構架區中CAT-212-213VH和/或VL結構域的一或多個 互補決定區（CDR)或者完整的VH、VL、CAT-212或CAT-213抗體在治療對象炎癥性疾病如炎 癥性腸病中的應用。
[0002] 發明背景
[0003] 人嗜酸細胞活化趨化因子是趨化因子CC(Cys-Cys)亞家族的快速擴展組的一個 成員。這組分子特征在于存在4個保守半胱氨酸，前兩個是相鄰的，并呈現序列相同性在 20-75 %之間。這個家族的成員包括嗜酸細胞活化趨化因子-2、嗜酸細胞活化趨化因子-3、 單核細胞趨化蛋白（MCP)-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP)-1、 MBP-13、TARC、LARC、1309 和 R ANTES。
[0004] 嗜酸細胞活化趨化因子可以通過多種正常細胞類型產生，包括上皮細胞、成纖維 細胞、內皮細胞、T-淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞。嗜酸細胞活化趨化因子表達可以從不 同細胞類型中通過許多促炎介質誘導，如腫瘤壞死因子-α、干擾素和白細胞介素-1。
[0005] 嗜酸細胞活化趨化因子-1是一種趨化蛋白，其結合特異性受體CCR3,其主要在嗜 酸性粒細胞上表達并將嗜酸性粒細胞募集至組織。在結合嗜酸性粒細胞上CCR3時，嗜酸細 胞活化趨化因子導致細胞內鈣動員、起始細胞內肌動蛋白聚合化、上調整聯蛋白表達及誘 導氧自由基產生。
[0006] 嗜酸性粒細胞是促炎白細胞，其組成小百分比的循環血細胞。在健康狀態，大多數 這些細胞位于胃腸道中，在胃和腸道的固有層內。
[0007] 嗜酸性粒細胞分泌毒性炎癥介質，其貯存于預先形成的小泡中，也是在細胞激活 后重新合成。由嗜酸性粒細胞分泌的主要蛋白質是嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、主要堿性蛋 白、嗜酸性粒細胞蛋白X、嗜酸性粒細胞衍生的神經內毒素以及嗜酸性粒細胞過氧化物酶。 這些導致對組織的傷害，在靶細胞膜上插入空，及通過產生毒性氧自由基增加平滑肌反應 性。
[0008] 嗜酸性粒細胞在胃腸道炎癥性疾病如炎癥性腸病（IBD)中起作用。
[0009] 術語炎癥性腸病（"1BD")描述了未知因素導致的一組慢性炎癥性病變，其中腸道 (腸）發炎，通常導致反復發生的腹痛和腹瀉。IBD -般分為潰瘍性結腸炎（UC)和克羅恩 病。這些腸道疾病中的炎癥過程包括許多炎癥性細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中 性粒細胞和嗜酸性粒細胞。嗜酸性粒細胞在IBD中所起的兩個最重要的作用似乎是作為促 炎和促胃腸動力劑，因此產生如腹瀉、炎癥、組織破壞、纖維化和狹窄以及最近提示的甚至 修復的形成。
[0010] 在UC中，炎癥性反應受限于結腸的黏膜層和黏膜下層，具有清晰的界限；在克羅 恩病中，全部的胃腸道均可涉及，炎癥可以通過腸壁從黏膜層擴展至漿膜。炎癥區域可以散 在相對正常的黏膜層。在克羅恩病中，主要癥狀是腹瀉、腹痛和體重降低，而在UC中，腹瀉 是主要癥狀，通常伴隨直腸出血。這兩種疾病在工業化國家很常見，在北美和北歐發病率最 高。這兩種疾病發生的高峰年齡是15-30歲，第二個稍弱高峰年齡是55-80歲。克羅恩病 在女性比男性中示出更高的發病率。
[0011] IBD的滿意治療不符合醫療要求，因為現有的治療劑未成功治愈疾病和防止手術 治療。接近全部潰瘍性結腸炎患者的40 %經歷手術，這典型包括由于大量出血、慢性衰弱性 病癥、結腸穿孔或者癌癥危險而除去部分大腸或者進行完全的結腸造口術。這種手術不能 治愈克羅恩病，因為全部患者的75%在其生命中經歷至少一次手術，接近90%的這些患者 需要另外手術。因此，可以成功治療炎癥性腸病的治療劑將具有改善患者生活質量的益處， 同時潛在地節省與侵入性手術方法相關的醫療保健系統的千百萬美元的花費。
[0012] 發明概述
[0013] 在一個實施方案中，本發明提供了治療對象中炎癥性腸病的方法，包括給予所述 對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。
[0014] 在一個實施方案中，所述結合成員包含抗體VH結構域，其包含VH⑶RU VH⑶R2 和VHCDR3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分別由SEQIDN0:5、SEQIDN0:6和 SEQ ID N0:7的氨基酸序列組成。
[0015] 在另一個實施方案中，抗體VH結構域包含SEQ ID NO: 2序列。
[0016] 在另一個實施方案中，結合成員包含抗體VL結構域，其包含VL⑶RU VL⑶R2和 VL CDR3〇
[0017] 在另一個實施方案中，VL⑶Rl由氨基酸序列SEQ ID NO:8組成。
[0018] 在另一個實施方案中，VL⑶R2由氨基酸序列SEQ ID NO:9組成。
[0019] 在另一個實施方案中，VL⑶R3由氨基酸序列SEQ ID NO: 10組成。
[0020] 在另一個實施方案中，抗體VL結構域包含SEQ ID NO:4。
[0021] 在一個實施方案中，炎癥性腸病是潰瘍性結腸炎。
[0022] 在另一個實施方案中，炎癥性腸病是克羅恩病。
[0023] 在另一個實施方案中，炎癥性腸病是膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結 腸炎、改道性結腸炎（Diversion colitis)、貝切特病（Behget'S disease)或者未定型結 腸炎。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖1示出用抗嗜酸細胞活化趨化因子-1抗體與對照抗體治療相比，DSS-誘導的 結腸炎小鼠的疾病活性指數。
[0026] 圖2示出用抗嗜酸細胞活化趨化因子-1抗體與對照抗體治療相比，DSS-誘導的 結腸炎小鼠體重與其注射前體重相比的改變百分比（％ )。
[0027] 圖3示出用抗嗜酸細胞活化趨化因子-1抗體⑶與對照IgG (A)治療相比，DSS誘 導的結腸炎小鼠的體重隨著時間的改變。
[0028] 圖4示出用抗嗜酸細胞活化趨化因子-1抗體⑶與對照抗體㈧相比治療的 DSS-誘導的結腸炎小鼠的代表性實例。出血和腹瀉癥狀減輕。
[0029] 圖5示出用抗嗜酸細胞活化趨化因子-1抗體與對照抗體相比治療的DSS-誘導的 結腸炎小鼠中結腸的重量/長度比率（A)。圖（B)和（C)示出接受抗嗜酸細胞活化趨化因 子-I(C)或對照抗體（B)的DSS-處理的小鼠中結腸長度的實例。
[0030] 發明詳述
[0031] 在一個實施方案中，本發明提供了治療或預防對象中炎癥性腸病的方法，包括給 予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。
[0032] 在另一個實施方案中，本發明提供了抑制或阻抑對象中炎癥性腸病的方法，包括 給予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。
[0033] 在另一實施方案中，本發明提供了降低對象中炎癥性腸病發生率的方法，包括給 予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。
[0034] 在另一個實施方案中，本發明提供了抑制或中和對象中嗜酸細胞活化趨化因子的 方法，包括給予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合 物。
[0035] 在另一個實施方案中，本發明提供了與嗜酸細胞活化趨化因子激活物競爭結合嗜 酸細胞活化趨化因子的方法，包括給予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的 特異性結合成員的組合物。在另一實施方案中，本發明提供了與嗜酸細胞活化趨化因子受 體競爭嗜酸細胞活化趨化因子結合位點的方法，包括給予所述對象施用包含結合人嗜酸細 胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。
[0036] 在另一個實施方案中，本發明提供了阻斷結合嗜酸細胞活化趨化因子的方法，包 括給予所述對象施用包含結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員的組合物。在一 個實施方案中，所述結合成員阻斷嗜酸細胞活化趨化因子激活物的結合。在另一個實施方 案中，所述結合成員阻斷嗜酸細胞活化趨化因子受體的結合。
[0037] 在一個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述的結合人嗜酸細胞活化趨化因 子的特異性結合成員的組合物的方法和應用。在一個實施方案中，所述組合物包含至少一 種額外成分，如藥物可接受的賦形劑。
[0038] 在一個實施方案中，本發明提供了結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成 員的方法和應用。在一個實施方案中，所述結合成員包含CAT-212VH結構域：
[0039] QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHffVRQA PGKGLEffVAV ISYDGSIKHY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRTDD TAVYYCAGDT DYGDIDPffGQ GTMVTVSS(SEQ ID N0:2)〇
[0040] 在一個實施方案中，所述結合成員包含CAT-212VL結構域：
[0041] DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQDIS SffLAffYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ASSFPSITFG QGTRLEIKR(SEQ ID N0:4)〇
[0042] 在另一個實施方案中，結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員是本領域 已知的結合成員。在一個實施方案中，所述結合成員是本領域已知的人抗嗜酸細胞活化趨 化因子-1抗體。
[0043] 通常，VH結構域與VL結構域配對以提供抗體抗原結合位點，但是VH結構域單獨 可用于結合抗原。在一個優選實施方案中，CAT-212VH結構域（SEQ ID N0:2)與CAT-212VL 結構域（SEQ ID N0:4)配對，以便形成包含CAT-212VH和VL這兩個結構域的抗體抗原結合 位點。在其它實施方案中，CAT-212VH與除了 CAT-212VL之外的VL結構域配對。輕鏈混雜 性（promiscuity)在本領域充分確立。
[0044] 本文描述的結合人嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員在美國專利號 6, 946, 546 ;7, 323, 311 ;8, 067, 564以及美國專利申請公開號US 中更詳細描 述，所述專利以其全部內容并入本文做參考，包括產生這種結合成員和相關變體的方法以 及結合成員的結合及其它特性。
[0045] 簡而言之，已經示出中和人嗜酸細胞活化趨化因子1的人單鏈片段可變抗 體（CAT-212)通過使用抗體噬菌體展示技術產生，并將其轉變為完整抗體IgG4形式 (CAT-213)。可變重鏈互補決定區3的長度減少一個氨基酸，導致與親代抗嗜酸細胞活化趨 化因子1抗體相比效力增加>1000-倍。該優化的抗體結合嗜酸細胞活化趨化因子1，具有 高親和性（80. 4pM)和特異性。CAT-213和CAT-212不結合或中和許多其它人蛋白質，包括 人單核細胞趨化蛋白-1，這是一種結構相似的趨化因子。CAT-213中和嗜酸細胞活化趨化 因子1的導致細胞內鈣信號傳導增加（IC(50)值為2. 86nM)、表達CCR3的LI. 2細胞迀移 (IC(50)值為0. 48nM)以及抑制嗜酸細胞活化趨化因子1誘發的在體外人嗜酸性粒細胞形 態的改變（IC(50)為0. 71nM)的能力。將CAT-213局部給予小鼠（1-lOOmicrog kg(-l)) 減弱由人嗜酸細胞活化趨化因子1誘導的皮膚嗜酸細胞增多癥，達到>90%的嗜酸性粒細 胞流入抑制。CAT-213因此在抑制其中嗜酸細胞活化趨化因子1和嗜酸性粒細胞起主要作 用的疾病如嚴重哮喘中可具有治療價值。
[0046] 在一個實施方案中，一或多個⑶R可取自CAT-212VH或VL結構域，并摻入合適的 構架中。CAT-212VH包括 CDR 1(SYGMH，SEQ ID N0:5)、CDR 2(VISYDGSIKH YADSVKG，SEQ ID N0:6)和 CDR 3(DTDYGDIDP，SEQ ID N0:7)。CAT-212VL 包括 CDR 1(RASQDISSWLA，SEQ ID N0:8)、CDR 2(AASSLQS，SEQ ID N0:9)和 CDR 3(QQASSFPSIT，SEQ ID N0:10)。
[0047] 序列在本文示出及可用于嗜酸細胞活化趨化因子的特異性結合成員中的VH和VL 結構域及CDR的變體可以通過序列改變或突變及篩選方法獲得。本發明也提供了這種方 法。
[0048] 其序列在本文特別揭示的任何VH和VL結構域的可變結構域氨基酸序列變體可根 據本發明使用，如本文論述。特定變體可包括一或多個氨基酸序列改變（添加、缺失、取代 和/或插入氨基酸殘基），可以少于大約20個改變、少于大約15個改變、少于大約10個改 變或者少于大約4、3、2或1個改變。改變可以在一或多個構架區和/或一或多個CDR中產 生。
[0049] 除了抗體序列之外，本發明的特異性結合成員可包含其它氨基酸，例如形成肽或 多肽，如折疊的結構域，或者賦予分子除了結合抗原之外的另外功能特性。本發明的特異性 結合成員可攜帶可檢測標記，或者可以與毒素或酶綴合（例如通過肽鍵或接頭）。
[0050] 在進一步的方面，本發明提供了分離的核酸，其包含編碼本發明的特異性結合成 員、VH或VL結構域的序列，及提供了制備本發明的特異性結合成員、VH和/或VL結構域的 方法，包括在使得所述特異性結合成員、VH結構域和/或VL結構域產生的條件下表達所述 核酸并回收其。
[0051] 攜帶本發明CDR的結構通常是抗體重鏈或輕鏈序列或者其主要部分，其中CDR 位于相應于由重排的免疫球蛋白基因編碼的天然發生的VH和VL抗體可變