一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種誘使干細胞團聚后，使用MET激動劑處理該細胞團，達到高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法。
【背景技術】
[0002]I型糖尿病是由于分泌胰島素的β細胞因中毒或自體免疫攻擊等情況下收到損傷，導致的胰島素分泌不足而引起的。糖尿病人都承受著肥胖，高血糖，肢體運動失調，腎損傷和眼睛病變的痛苦。多年來，為根除糖尿病，人們一直尋找基于組織和細胞的再生替代治療方法。其中，干細胞治療近年來備受矚目。人們認為，將干細胞誘導成為胰島素分泌性細胞，并進行移植是干細胞治療糖尿病的可靠途徑。目前已經有很多方法誘導干細胞向胰島β樣細胞分化。但是絕大部分方法都面臨了分化效率低，分化后細胞活性差的問題。這些問題阻礙了干細胞治療糖尿病的應用。
[0003]干細胞在體外培養分化所面臨的主要問題是，體外環境不能像體內環境一樣提供干細胞正常生長所需要的全部必要條件。干細胞在體內的分化也是通過與其所在位置的信號分子相互作用以后，才能夠正確的進行分化程序。干細胞的體內環境由各種細胞因子，糖蛋白、脂蛋白等多種細胞外基質成分，以及各種激素等調節分子構成。顯然體外環境難以完全模擬體內干細胞生存環境。這導致了干細胞提早衰亡，分化效率低和分化之后細胞活力不佳等現象。干細胞團聚結構是干細胞集中并形成的三維立體結構，它給干細胞提供了一個相對自然的支持環境，并造成了局部低氧的環境。研究證明，在這種結構下，干細胞表達了更高的干細胞標記物比如Met，具有更大的分化潛力。研究表明，Met能夠調控干細胞的生長，自我更新和分化。Met在肝細胞分化過程中是必須的。Met基因敲除的β細胞對地塞米松的刺激極為敏感，同時阻礙了 β細胞對葡萄糖刺激的響應。我們的研究證明，激活MET通路，有利于促使間充質干細胞向胰島細胞分化。但是，細胞團聚后無疑提供了更加天然的分化環境，對于使用MET激動劑，有效刺激干細胞團向胰島β樣細胞分化，目前并無報道。
[0004]基于以上原理，本發明通過誘使干細胞團聚，應用MET激動劑處理該細胞團，達到高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化。

【發明內容】

[0005]發明目的:本發明的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法通過誘使干細胞團聚后，使用MET激動劑激活MET/HGF信號通路，能夠高效誘導干細胞向胰島β樣細胞，并能提尚其活力。
[0006]技術方案:為了解決上述技術問題，本發明提供了一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，該方法包括以下步驟:步驟a:通過誘使細胞團聚；
步驟b:應用MET激動劑激活處理細胞團，高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化。
[0007]其中，上述干細胞為胚胎干細胞，脂肪間充干細胞，臍帶血間充質干細胞或臍帶間充質干細胞中的一種或幾種。
[0008]其中，上述步驟a誘使細胞團聚采取的方法，是指在明膠包被的培養板上進行懸浮培養，從而使細胞團聚。
[0009]其中，上述的MET激動劑是指各種可以激活MET蛋白的分子，包括HGF，活性肽，化學分子或基因工程蛋白質分子中的一種或幾種。
[0010]一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，具體步驟如下:
1)臍帶血間充質干細胞培養于2%明膠包被的培養板，在含有20%胎牛血清的DMEM懸浮培養7天后，細胞球平均直徑達100微米時即開始誘導；
2)細胞用PBS清洗兩次，使用培養基I培養24小時；
3)24小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基II，繼續培養48小時；
4)48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基III，繼續培養48小時；
5)48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基IV，繼續培養24小時；
6)經ELISA免疫定量測定；
7)對7周齡小鼠腹腔注射160mg/kg鏈脲霉素來誘導產生糖尿病；
8)血糖濃度達到16.7 mmol/L時，每只小鼠腹腔肝內注射2.5X 16胰島β樣細胞之后每兩周檢測血糖濃度。
[0011 ] 所述培養基I的成分為:DMEM/F12、ImM 丁酸鈉和50ng/mL激活素A。
[0012]所述培養基II的成分為:DMEM/F12、0.1-0.2%胎牛血清和50ng/mL Activin A0
[0013]所述培養基III 的成分為:DMEM/F12、50ng/mL KGF/FGF、10ng/mL RA、10ng/mL HGF和1%胎牛血清。
[0014]所述培養基IV的成分為:DMEM/F12、10ng/mL HGF、1% B27和2%胎牛血清。
[0015]有益效果:相對于現有技術，本發明具有以下優點:本發明通過誘使干細胞團聚后，使用MET激動劑處理干細胞團，能夠高效誘導干細胞向胰島β樣細胞，并能提高其活力，實現了本發明。
【附圖說明】
[0016]圖1經ELISA定量測定，分化成功后細胞內(Α，B)和細胞外(C，D)外胰島素和C-肽(C-p印tide)的含量顯著增加；
圖2應用分化成功的胰島β樣細胞可以使高血糖小鼠模型的高血糖癥得到緩解。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，該方法包括以下步驟:
1、臍帶血間充質干細胞培養于2%明膠包被的培養板，在含有20%胎牛血清(Ultrapureagarose，Invitrogen，Carlsbad，CA)的 DMEM (Life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)懸浮培養7天后，細胞球平均直徑達100微米時即開始誘導。
[0018]2、細胞用PBS清洗兩次，使用培養基I培養24小時，培養基I的成分為:DMEM/F12 (Life Technologies)，ImM 丁酸鈉(Sigma, St.Louis, MO，USA),50ng/mL ActivinA (Sigma)。
[0019]3、24小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基II，繼續培養48小時，培養基II的成分為:DMEM/F12，0.1-0.2% 胎牛血清，50ng/mL Activin A0
[0020]4、48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基III，繼續培養48小時，培養基III 的成分為:DMEM/F12，50ng/mL KGF/FGF (Life Technologies)，lOng/mL RA (LifeTechnologies)，lOng/mL HGF, 1% 胎牛血清。
[0021]5、48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基IV，繼續培養24小時，培養基IV的成分為:DMEM/F12,10ng/mL HGF (Life Technologies)，1% B27(Life Technologies)，2%胎牛血清。
[0022]6、經 ELISA 免疫定量測定(Ultrasensitive ELISA kits ；Merocodia, Uppsala,Sweden))，分化成功后細胞內和細胞外的外胰島素和C-肽的含量顯著增加(圖1)。
[0023]7、對 7 周齡小鼠腹腔注射 160 mg/kg 鏈脲霉素(STZ，Sigma, St-Louis, MO，USA)來誘導產生糖尿病。
[0024]8、血糖濃度達到16.7 mmol/L時，每只小鼠腹腔肝內注射2.5X106胰島β樣細胞后每兩周檢測血糖濃度。
[0025]9、應用分化成功的胰島β樣細胞可以使高血糖小鼠模型的高血糖癥得到緩解(圖 2)。
[0026]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本技術領域的技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:步驟a:通過誘使細胞團聚； 步驟b:應用MET激動劑激活處理細胞團，高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化。2.根據權利要求1所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述干細胞為胚胎干細胞，脂肪間充干細胞，臍帶血間充質干細胞或臍帶間充質干細胞中的一種或幾種。3.根據權利要求1所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述步驟a誘使細胞團聚采取的方法，是指在明膠包被的培養板上進行懸浮培養，從而使細胞團聚。4.根據權利要求1所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述的MET激動劑是指各種可以激活MET蛋白的分子，包括HGF，活性肽，化學分子或基因工程蛋白質分子中的一種或幾種。5.根據權利要求1所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)臍帶血間充質干細胞培養于2%明膠包被的培養板，在含有20%胎牛血清的DMEM懸浮培養7天后，細胞球平均直徑達100微米時即開始誘導； 2)細胞用PBS清洗兩次，使用培養基I培養24小時； 3)24小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基II，繼續培養48小時； 4)48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基III，繼續培養48小時； 5)48小時后，PBS清洗細胞，并更換為培養基IV，繼續培養24小時； 6)經ELISA免疫定量測定； 7)對7周齡小鼠腹腔注射160mg/kg鏈脲霉素來誘導產生糖尿病； 8)血糖濃度達到16.7mmol/L時，每只小鼠腹腔肝內注射2.5X106胰島β樣細胞之后每兩周檢測血糖濃度。6.根據權利要求5所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述培養基I的成分為:DMEM/F12、lmM 丁酸鈉和50ng/mL激活素A。7.根據權利要求5所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述培養基II的成分為:DMEM/F12、0.1-0.2%胎牛血清和50ng/mL Activin A08.根據權利要求5所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述培養基 III 的成分為:DMEM/F12、50ng/mL KGF/FGF、10ng/mL RA、10ng/mL HGF 和1%胎牛血清。9.根據權利要求5所述的一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法，其特征在于，所述培養基IV的成分為:DMEM/F12、10ng/mL HGF, 1% B27和2%胎牛血清。
【專利摘要】本發明公開了一種高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法。該方法包括：首先在誘使細胞團聚的前提下，應用MET激動劑處理該細胞團，達到高效誘導干細胞向胰島β樣細胞分化的方法。該方法有助于提高干細胞向胰島素分泌性細胞分化的效率和活力，進而治療因β細胞受損，胰島素分泌絕對量減少而導致的高血糖癥。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105087468
【申請號】CN201510553190
【發明人】孫博, 肖忠黨
【申請人】東南大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月1日