建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法
【專利摘要】本發明涉及一種建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，屬于動物細胞（組織）工程領域。膠原酶消化成年大鼠胰腺組織，手工挑取胰島，RPMI1640有血清培養，大鼠胰島原代上皮樣干細胞貼壁生長，克隆環篩選，上皮樣干細胞純化，胰蛋白酶消化液消化傳代，建立細胞系；采用該方法建立的一例大鼠胰島上皮樣干細胞系的特征是細胞貼壁呈多角形上皮樣，克隆性生長，是正常的二倍體細胞，在蛋白水平表達八聚體轉錄因子4、配對基因盒4、配對基因盒6、神經源性因子3和巢蛋白，具有多分化潛能，無致瘤性。
【專利說明】建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及建立人類和其它哺乳動物胰島干細胞系的方法，特別涉及一種建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，屬于動物細胞(組織)工程領域。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人類健康的重大疾病之一，據統計目前全世界糖尿病患者已達3.46億(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而傳統的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫治該病。近十年來，隨著移植技術的發展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效(N Engl J Med 2000，343 (4):230-238.Diabetes.2005, 54(7):2060-2069.Am J Transplant.2008, 8(11):2463-2470.1mmuneNetw.2013, 13(6):235-239.)。但是，由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術的應用受到制約。胰島干細胞是存在于胰腺內分泌組織胰島中的成體干細胞，能自我更新并具有多分化潛能。體外分離克隆胰島干細胞，誘導其分化形成功能性胰島，并移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰島干細胞系，研究胰島干細胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點。國外，Zulewski等(Diabetes.2001，50(3):521-533.Endocrinology.2002, 143(8):3152-3161.Stem Cells.2004，22 (7): 1134-1141.)首先報道膠原酶消化大鼠或成人胰腺組織分離獲得單個細胞和胰島，RPMI1640+10%FBS+lmmol/LNaHC03+71.5umol β -巰基乙醇+抗生素培養液懸浮培養，96h后,挑出懸浮胰島,培養液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF貼壁培養，上皮樣胰島干細胞克隆性生長。其中，大鼠胰島干細胞8.5個月擴增了 10倍，人胰島干細胞8個月擴增了 7倍。免疫化學反應檢測胰島干細胞表達巢蛋白(nestin),不表達insulin、glucagon、somatostatin和CK19。體外定向誘導，胰島干細胞分化形成胰腺導管細胞，表達CK19 ;分化形成胰島細胞，表達insulin、glucagon等；分化形成肝臟細胞,表達α-甲胎蛋白；分化形成神經細胞,表達神經細胞特異性粘附分子。移植在小鼠肝臟內，人源性胰島干細胞分化形成人肝臟細胞。Maria-Engler等(J Endocrinol.2004, 183(3):455-467.)膠原酶HI灌注消化成年人胰腺主胰管，分離獲得細胞和細胞團，密度梯度離心，雙硫腙(dithizon，DTZ)活性染色檢測，篩選出直徑大于150 μ m胰島，CMRL1066+10%FCS培養。共聚焦熒光顯微觀察和RT-PCR檢測，培養24h，胰島細胞團中僅有少量細胞表達nestin ;培養60d，nestin+表達量顯著增多。采用含10%FBS培養液培養nestin+細胞30d，表達insulin ;而采用含1%FBS培養液培養nestin+細胞30d,則表達insulin、glucagon和somatostatin。因此，作者認為體外長期培養，人胰島中的 nestin+細胞具有干細胞特性。Humphrey 等(Diabetes.2003, 52(10):2519-2525.)膠原酶消化人胎兒早期胰腺組織，獲得胰島細胞團，懸浮培養4d，置入鋪有HTB-9的培養皿中，RPMIl640+10%FBS+10ng/mL HGF培養液貼壁培養，上皮樣細胞擴增形成單層。構建nestin-GFP質粒，腺病毒轉染，418篩選，純化出nestin+細胞。RT-PCR檢測，nestin+細胞共表達波形蛋白。采用煙酰胺、HGF等體外定向誘導，nestin+細胞卻不能分化形成表達Pdxl、insulin的β細胞，移植在無胸腺小鼠體內也不能分化形成功能性β細胞，分泌insulin。這表明nestin不是β細胞祖細胞的特異性標記物。Sugiyama等(Proc NatlAcad Sci USA.2007, 104(I): 175-180.)胰蛋白酶消化小鼠胎兒胰腺組織，分離獲得單個細胞，流式細胞術分選，獲得共表達Ngn3、CD 133和CD45f的胰島干細胞。體外定向誘導，胰島干細胞分化形成 β 細胞，分泌 insulin。Ta 等(Stem Cells.2006, 24(7): 1738-1749.)的研究表明在培養液中添加成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth facter,bFGF)、白細胞抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)和骨形態發生蛋白4 (bonemorphogenetic protein-4, BMP4),均能促進成年小鼠胰島干細胞擴增。Jin等(Proc NatlAcad Sci USA.2013，110 (10): 3907-3912.)膠原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺組織獲得單個細胞，CD133標記，流式細胞術分選，DMEM++5%FCS+0.lnmol/Lexendin4+10ng/mLactivin β +lng/mLVEGF+100 μ g/mLLN+1%MC+1OmmoI/L 尼克酰胺 +50% 條件培養基培養，3w后，細胞克隆形成細胞團，RT-PCR檢測克隆細胞表達⑶133。培養液中添加RSP01定向誘導，CD133+細胞分化形成表達Ngn3的胰島干細胞和腺泡細胞。流式細胞術進一步分選出Ngn3+胰島干細胞,體外定向誘導,分化形成β細胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。國內，效梅等(中國科學C輯:生命科學.2008，38(8):699-707.Science in China Series C: LifeScience.2008, 51 (9): 779-788.分子細胞生物學報.2008, 41 (6):450-457.分子細胞生物學報.2008，4U6):457-464.解剖學報.2009，40(2):55-58.中國獸醫學報.2009，29 (2): 191-195.)報道IV型膠原酶消化人胎兒胰腺組織20~40min，收集單個細胞和細胞團，低糖DMEM+3.7g/LNaHC03+10%FBS+0.08g/L青霉素+0.lg/L鏈霉素培養液培養。當原代上皮樣胰腺干細胞長出后，0.25%胰蛋白酶+0.0496EDTA消化液消化，傳代。在傳代中逐漸消除成纖維樣細胞和其他細胞，純化上皮樣胰腺干細胞。采用克隆環篩選出典型的單克隆人胰腺干細胞，培養液中添加10ng/mLEGF擴增培養，建立人胎兒胰腺干細胞系。免疫化學反應、RT-PCR檢測該干細胞表達Pdxl、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表達insulin、Q)34、⑶44及⑶45。β-巰基乙醇誘導，分化形成神經細胞，表達NF蛋白。煙酰胺誘導，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將單克隆人胰腺干細胞體外誘導胰島移植在STZ制備的糖尿病大鼠腎囊內，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。閻志風等(中國組織工程研究與臨床.2008, 12(3): 485-489.)無菌取人胎兒胰腺組織，0.5g/L V型膠原酶消化，分離得到胰島樣細胞團，RPMI1640+ 0.l%FBS+lmmol/L丙酮酸鈉+lmmol/L谷氨酰胺+71.5 μ mo I/L β -巰基乙醇+100U/mL青霉素+100mg/L鏈霉素培養液懸浮培養。72h后，挑出懸浮胰島樣細胞團貼壁培養，上皮樣干細胞克隆性生長至單層，傳代。生長曲線顯示人胎兒胰島上皮樣干細胞傳代第3d進入對數生長期，第6d進入平臺期，細胞生長曲線呈“S”形。熒光免疫反應檢測人胎兒胰島原代上皮樣干細胞表達PCNA、PdxU nestin、CK19、insulin、glucagon和0)29,傳代后，胰島干細胞則不表達insulin、glucagon和0)29。白日星等(中國普通外科雜志.2004, 13(10):746-749)膠原酶消化新生大鼠胰腺組織，組織碎片采用無血清RPMI1640培養液培養。培養36h，nestin+細胞貼壁生長。添加bFGF、EGF、N2,nestin+細胞快速增長。培養18~24d, nestin+細胞分化形成類胰島樣細胞團,胰島素釋放實驗檢測，分泌insulin。馮若鵬等(中國農業科學.2007, (3).582-587.農業生物技術學報，2011.19(1): 9-17.)膠原酶 消化胎豬胰腺組織分離獲得胰島，貼壁培養，胰島干細胞快速增殖，傳18代，建系。免疫化學反應顯示胰島干細胞表達CK19和α-actin，不表達nestin。無血清誘導培養,2w后,胰島干細胞分化形成DTZ染色陽性的胰島樣細胞團,表達insulin和Glut2等胰島素分泌細胞功能相關的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。將誘導細胞移植到糖尿病裸鼠腹腔內，可緩解其高血糖狀況。目前，國內尚無建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的報道，建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法還不成熟。本發明建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，將為進一步建立人類和其它哺乳動物胰島干細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對于研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，為進一步建立人類和其它哺乳動物胰島干細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對于研究人類和哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官移植治療糖尿病具有重要的意義。
[0004]為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是:
建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，包括如下步驟:1.大鼠胰島原代上皮樣干細胞分離培養無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37°C消化25min ；DTZ染色，手工挑取DTZ著色單個胰島(圖1 )，置于鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，大鼠胰島原代上皮樣干細胞貼壁生長(圖2)；
2.大鼠胰島上皮樣干細胞純化
打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置于大鼠胰島上皮樣干細胞區域內，在克隆環孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min ;收集克隆環中的細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，純化的大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長(圖3); 生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣(圖4)；
3.大鼠胰島上皮樣干細胞傳代培養
當純化的大鼠胰島上皮樣干細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS+ IOng/mLbFGF細胞培養液擴增培養；1例大鼠胰島上皮樣干細胞已傳50代；
4.大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍保存
冷凍:80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS細胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣干細胞至IX IO6個/mL，分裝于冷凍管，4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存；
解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰島上皮樣干細胞解凍成活率約為93% ；
5.大鼠胰島上皮樣干細胞形態特征
H.E染色，大鼠胰島上皮樣干細胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖5) ；Giemsa染色，細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖6)；
6.大鼠胰島上皮樣干細胞生長特性
大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長，當細胞生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣；生長曲線表明細胞接種第Id生長緩慢，第2~4d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7d增殖能力下降(圖7);
7.大鼠胰島上皮樣干細胞染色體數目染色體標本顯示大鼠胰島上皮樣干細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42 (圖
8)；
8.大鼠胰島上皮樣干細胞表達特征
流式細胞術檢測和熒光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣干細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、配對基因盒4 (Paired box 4, Pax4,圖 10)、配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 11)、神經源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 13)和巢蛋白(nestin,圖 14),不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin ;圖12是流式細胞術檢測陰性對照，圖15是突光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照；
9.大鼠胰島上皮樣干細胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣干細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞；
9.1分化形成神經細胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖16)，熒光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖17);
9.2分化形成脂肪細胞:采用DMEM+10%NBS+1 umo I /L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導，誘導7d，大鼠胰島多角形上皮樣干細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一 ；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽性(圖 18)；
9.3分化形成成骨細胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞出現皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性(圖19)，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖20)；
10.大鼠胰島上皮樣干細胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣干細胞無致瘤性；大鼠胰島上皮樣干細胞接種在裸鼠背部皮下30d，剖解，眼觀未見瘤狀物。
[0005]建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法建立的大鼠胰導上皮樣干細胞系保藏號為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心，地址:武漢大學中國典型培養物保藏中心。
[0006]本發明的有益效果是:建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，將為進一步建立人類和其它哺乳動物胰島干細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對于研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]本說明書共有20幅附圖，其中:
圖1大鼠胰島DTZ染色陽性(X100);
圖2大鼠胰島原代上皮樣干細胞貼壁生長(X50);圖3純化的大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長(XlOO)；
圖4大鼠胰島上皮樣干細胞生長至80%融合，呈“鋪路石”樣(X100)；
圖5大鼠胰島上皮樣干細胞H.E染色形態特征(X 200);
圖6大鼠胰島上皮樣干細胞Giemsa染色形態特征(X 400)；
圖7大鼠胰島上皮樣干細胞生長曲線；
圖8大鼠胰島上皮樣干細胞染色體數目2n=42 ；
圖9流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣干細胞表達0ct4 ；
圖10流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣干細胞表達Pax4 ;
圖11流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣干細胞表達Pax6 ；
圖12流式細胞術檢測陰性對照；
圖13熒光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣干細胞表達Ngn3 (X400)；
圖14熒光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣干細胞表達nestin (X400)；
圖15熒光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照(X 200)；
圖16體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成有突觸的神經細胞(X200)；
圖17熒光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成的神經細胞表達NSE(X200)；
圖18體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成脂肪細胞，油紅O染色陽性(X200)；
圖19體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成成骨細胞，茜素紅染色陽性(X100)；
圖20大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成成骨細胞，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(X100)。
【具體實施方式】
[0008]下面通過實例對本發明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。
[0009]實施例1
1.大鼠胰島原代上皮樣干細胞分離培養
無菌取SD成年大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37 V消化25min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化。100目孔徑濾紗過濾，離心(lOOOrpm，5min)。DTZ染色(圖1)，在顯微鏡下手工挑取DTZ著色單個胰島，放入鋪有0.1%明膠的培養皿中，加RPMI1640+10%NBS培養液，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱中培養。培養3~4d，大鼠胰島原代上皮樣干細胞貼壁生長(圖2)。 [0010]2.大鼠胰島上皮樣干細胞純化
打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置于胰島上皮樣干細胞區域內。在克隆環孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化。收集克隆環中的細胞懸液，離心(lOOOrpm，5min)。RPMI1640+10%NBS培養液重懸細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，繼續培養。3~5d，純化的大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長(圖3)。生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣(圖4)。[0011]3.大鼠胰島上皮樣干細胞傳代培養
當純化的大鼠胰島上皮樣干細胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。收集的細胞按IX IO6個/mL細胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF細胞培養液擴增培養。
[0012]4.大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍保存
冷凍:大鼠胰島上皮樣干細胞生長至80%融合，PBS (_)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm, 5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS細胞冷凍液稀釋細胞至I X IO6個/mL，分裝于冷凍管。4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存。
[0013]解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI1640+10%NBS培養液清洗解凍細胞2~3遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養。取少量細胞，臺盼藍染色檢測，細胞解凍成活率約為93%。
[0014]采用以上分離、純化、傳代培養及冷凍保存技術，已獲得大鼠胰島上皮樣干細胞。其中，I例大鼠胰島上皮樣干細胞系已傳50代，冷凍保存50管細胞，約0.5 X IO8個細胞。
[0015]5.大鼠胰島上皮樣干細胞形態特征
H.Ε染色:大鼠胰島上皮樣干細胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖5)。染色方法參照司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[Μ].世界圖書出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰島上皮樣干細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖6)。染色方法參照R.1.弗雷謝尼.動物細胞培養一基本技術指南[Μ].科學出版社.2008.略；
6.大鼠胰島上皮樣干細胞生長特性
大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長。生長曲線表明細胞接種第Id生長緩慢，第2~4d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7 d增殖能力下降(圖7)。
[0016]生長曲線測定方法:解凍復活第20、30、40代大鼠胰島上皮樣干細胞，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液分別稀釋細胞至I X IO4個/mL。取96孔板7個，每個板上分別接種3種不同代數的細胞，每代設6個孔，每孔加100 μ L細胞懸液，并設陰性對照(基礎培養液，無細胞)，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱中培養。此時記為0d。每24h取出一塊培養板，采用CCK-8法測定細胞吸光度值(0D值)，共測7d。測定時，每孔加10μ LCCK-8后，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養箱中作用2h，在酶標儀上測定450nm處OD值。以時間(d)為橫坐標，吸光度值(OD)為縱坐標，繪制大鼠胰島上皮樣干細胞生長曲線圖。
[0017]7.大鼠胰島上皮樣干細胞染色體數目
染色體標本顯示大鼠胰島上皮樣干細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42 (圖8)。
[0018]大鼠胰島上皮樣干細胞按I父105個/ HiL細胞密度接種于鋪有0.1%明膠的培養皿中，貼壁培養。擴增至80%融合時，加入終濃度為0.1 μ g/mL秋水仙素，繼續培養5h，使多數細胞染色體停于中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心。棄上清，加入0.4%KC1，并置于37°C水域中，低滲30min，離心。棄上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3:1，現用現配)，混勻，靜置固定20min，離心。如此反復固定2~3次。棄上清，加0.5mL固定液，混勻，制成染色體懸液。取冰凍載玻片，于約80cm高度滴片,火焰干燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物學顯微鏡下觀察染色體標本，照相。
[0019]8.大鼠胰島上皮樣干細胞表達特征
流式細胞術檢測和熒光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣干細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、配對基因盒4 (Paired box 4, Pax4,圖 10)、配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 11)、神經源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 13)和巢蛋白(nestin,圖 14),不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CDl 17、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。圖12是流式細胞術檢測陰性對照，圖15是突光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照。
[0020]8.1流式細胞術檢測
根據所購特異性抗體是否帶熒光標記，采用直接免疫熒光標記法或間接免疫熒光標記法檢測。[0021]8.1.1直接免疫熒光標記法
直接免疫熒光標記法檢測大鼠胰島上皮樣干細胞不表達MafA、PCNA、⑶117、⑶15、⑶34和 CD45。
[0022]PBS(-)洗滌大鼠胰島上皮樣干細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管7個，分別加入ImL細胞懸液，離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀釋的熒光素標記抗體(0.25ug/100uL稀釋的金黃地鼠抗小鼠MafA熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人PCNA熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD117熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD 15熒光抗體、5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人CD34熒光抗體或5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人⑶45突光抗體,均購自eBioscience公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，PBS (-)洗漆細胞 2 次,離心(lOOOrpm, 5min),以除去未結合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS (-)重懸細胞，流式細胞儀(Accuri C6，BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重復3次。
[0023]8.1.2間接免疫熒光標記法
間接免疫熒光標記法檢測大鼠胰島上皮樣干細胞表達八聚體轉錄因子4 (0ct4)、配對基因盒 4 (Paired box 4, Pax4)和配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6)。
[0024]PBS (_)洗滌大鼠胰島上皮樣干細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管4個，分別加入ImL細胞懸液,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀釋的無熒光素標記的一抗(1:100稀釋的兔抗人0ct4或1:500稀釋的兔抗大鼠Pax6,購自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,購自Abgent公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min),以除去未結合的多余抗體。棄上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀釋的熒光素標記二抗(1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min),以除去未結合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS(_)重懸細胞,流式細胞儀(AccuriC6，BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重復3次。
[0025]8.2突光免疫化學反應對于購買不到流式細胞術檢測的抗體，則購買熒光免疫化學反應抗體檢測。
[0026]熒光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣干細胞表達神經源性因子3 (Neurogenin3, Ngn3)和巢蛋白(nestin),不表達 Pdxl、Ptfla、CK19、Nanog、NeuroD2、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。[0027]在鋪有0.1 %明膠的培養皿中放入蓋玻片，大鼠胰島上皮樣干細胞按I父105個/mL細胞密度接種在放有蓋玻片的培養皿中。當細胞生長至80%融合，4%多聚甲醛室溫固定細胞爬片15min。PBS (-)洗滌細胞爬片2次后，l%Triton_X100穿孔30min，1%BSA封閉45min。洗掉多余封閉液，加含1%BSA的PBS (-)稀釋的一抗(1: 100稀釋的小鼠抗人Ngn3、3 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Ptfla、5 μ g/mL稀釋的小鼠抗人ghrelin或1:100稀釋的兔抗人secretin,均購自Abcam公司；1:300稀釋的小鼠抗大鼠nestin,購自Novus公司；20yg/mL稀釋的小鼠抗人Pdxl或20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人CK19,購自eBioscience公司；1:100稀釋的兔抗人Nanog、1:300稀釋的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀釋的兔抗人Sox2或1:100稀釋的兔抗人somatostatin,均購自Epitomics公司；1:500稀釋的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀釋的兔抗大鼠glucagon，購自Boster公司；)，陰性對照加PBS(-)，4°C過夜。PBS(_)洗滌3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀釋的熒光二抗(1:1000稀釋的羊抗小鼠突光二抗，購自Novu公司或1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)洗滌3次，每次3min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，照相。陰性對照細胞為小鼠胎兒成纖維細胞。
[0028]9.大鼠胰島上皮樣干細胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣干細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞。
[0029]9.1分化形成神經細胞
分化形成神經細胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖16)，熒光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖17)。
[0030]大鼠胰島上皮樣干細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液定向誘導培養，隔天換液。誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞分化形成有突觸的神經細胞，熒光免疫化學反應表達NSE。
[0031]9.2分化形成脂肪細胞
分化形成脂肪細胞:采用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導，誘導7d，大鼠胰島多角形上皮樣干細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽性(圖18)。
[0032]大鼠胰島上皮樣干細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液定向誘導培養，隔天換液。誘導7d,大鼠胰島多角形上皮樣干細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣干細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一 ；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大,油紅O染色陽性。
[0033]9.3分化形成成骨細胞
分化形成成骨細胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞出現皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性(圖19)，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖20)。
[0034]大鼠胰島上皮樣干細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液定向誘導培養，隔天換液。誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣干細胞出現明顯的皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
[0035]10.大鼠胰島上皮樣干細胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣干細胞無致瘤性。大鼠胰島上皮樣干細胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0036]在6只裸鼠背部皮下分別注射大鼠胰島上皮樣干細胞，劑量為I X IO6個/0.2mL/site, 3只裸鼠背部皮下注射0.2mL細胞培養液RPMI1640作為對照，正常飼養管理30d。結果，6只實驗裸鼠和3只 對照裸鼠均存活至實驗結束，解剖觀察，均未見瘤狀物。
【權利要求】
1.建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)大鼠胰島原代上皮樣干細胞分離培養 無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至Irnm3，膠原酶消化；DTZ染色，手工挑取DTZ著色單個胰島，置于鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，大鼠胰島原代上皮樣干細胞貼壁生長； (2)大鼠胰島上皮樣干細胞純化 打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置于胰島上皮樣干細胞區域內，在克隆環孔中消化；收集克隆環中的細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液繼續培養，純化的大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長；當細胞生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣； (3)大鼠胰島上皮樣干細胞傳代培養 當純化的大鼠胰島上皮樣干細胞生長至80%融合，胰蛋白酶消化液消化；收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，細胞培養液擴增培養；1例大鼠胰島上皮樣干細胞已傳50代； (4)大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍保存 冷凍:細胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣干細胞，分裝于冷凍管，平衡，投入液氮長期冷凍保存； 解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣干細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰島上皮樣干細胞成活率為93%。
2.根據權利要求1所述的建立大鼠胰導上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:步驟(1)所述的膠原酶消化是指加入0.1% IV型膠原酶，在37°C條件下，消化25min。
3.根據權利要求1所述的建立大鼠胰導上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:步驟(2)所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室溫消化3min。
4.根據權利要求1所述的建立大鼠胰導上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:步驟(3)所述的細胞培養液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF。
5.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:步驟(4)所述的細胞冷凍液是指80% RPMI 1640+10%DMS0+10%NBSo
6.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于:步驟(4)所述的平衡是指4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h。
7.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法建立的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系保藏號為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心。
8.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞形態特征為:大鼠胰島上皮 樣干細胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣，細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁。
9.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞生長特性為:大鼠胰島上皮樣干細胞克隆性生長；細胞接種第Id生長緩慢，第2~4 d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7 d增殖能力下降。
10.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞染色體數目為:大鼠胰島上皮樣干細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42o
11.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞表達特征為:大鼠胰島上皮樣干細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子4(Octamer-binding transcription factor 4,0ct4)、配對基因盒 4(Paired box 4,Pax4)、配對基因盒6 (Paired box 6, Pax6)、神經源性因子3 (Neurogenin 3, Ngn3)和巢蛋白(nestin)，不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
12.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞分化潛能為:大鼠胰島上皮樣干細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣干細胞分化形成有突觸的神經細胞，表達NSE;分化形成含有脂滴的脂肪細胞，油紅O染色陽性；分化形成成骨細胞，產生礦化結節，茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
13.根據權利要求7所述的大鼠胰導上皮樣干細胞系，其特征在于:所述的大鼠胰島上皮樣干細胞致瘤性為: 大鼠胰島上皮樣干細胞無致瘤性。
【文檔編號】C12R1/91GK103881963SQ201410138860
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】安立龍, 效梅 申請人:廣東海洋大學