維生素d的新應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及維生素D的新應用。
【背景技術】
[0002] 中國癌癥協會2015年2月15日發布的新數據表明，僅2011年，中國卵巢癌發 病人數與死亡人數分別為45, 223和18, 430人。卵巢表面上皮細胞（OvarianSurface EpithelialCell，OSEC)是包被在卵巢表面的一層立方-長方形細胞，位于卵巢韌帶和腹 膜間皮之間，起源于苗勒氏系統。在卵巢排卵后，起到修復卵巢表面破潰的作用。
[0003] 按照起源，卵巢癌主要分為三種：1上皮-間質性；2性索-間質性；3生殖細胞腫 瘤。目前研究認為，上皮性腫瘤約占所有卵巢腫瘤的60%，其中大約90%的惡性卵巢腫瘤 被認為起源于正常的卵巢表面上皮（OvarianSurfaceEpithelia0SE)細胞。卵巢表面上 皮的惡性轉化的原因基本可以分為三類，炎癥因子的刺激、持續的促性腺激素刺激和持續 不斷的排卵。如果卵巢表面上皮細胞覆蓋在一個不排卵的卵巢上面時它就會處在一個靜止 的間質狀態，而同時具有上皮細胞與間質細胞的特點。當卵巢連續性排卵或者組織重建時， OSE就會發生一個去分化的過程，從上皮細胞向間質細胞轉化（EMT)。此過程首次被發現是 在胚胎發生時，并被認為是胚胎形成的關鍵。后來研究發現EMT過程與成人器官纖維化及 腫瘤轉移有關。有研究證明，EMT參與了卵巢癌發生過程中腫瘤細胞生長、生存、迀移、侵襲 及耐藥性的調節，并被認為是卵巢癌發展的一個關鍵性過程。
[0004] 卵巢癌是一種病死率極高的婦科癌癥，這主要與其三個特性有關：一是卵巢癌早 期缺少有效的篩查與診斷措施；二是卵巢癌惡性程度高，晚期易發生轉移；三是卵巢癌晚 期，癌細胞對卡鉑和紫杉醇等化療藥物易產生耐藥性。卵巢癌極易發生遠端轉移，早期篩查 及診斷率低，而且在晚期對放療和化療易產生耐受性，病死率極高，因此，對于卵巢癌的預 防性治療藥物的發現迫在眉睫。

【發明內容】

[0005] 為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種有效減緩卵巢表面上皮惡性轉化 進程的方法，特別是維生素D在卵巢癌的預防性治療藥物上的新應用。
[0006] 本發明第一方面涉及一種小鼠卵巢表面上皮細胞（MouseOvarianSurface EpithelialCell，M0SEC)體外惡性轉化培養方法，包括以下步驟：
[0007] 1)卵巢表面上皮細胞分離：取6-8周齡未生育過的健康雌性C57BL/6小鼠的卵 巢，沖洗并剝離殘留的輸卵管、脂肪組織及卵巢被膜后，利用胰酶消化分離其卵巢表面上皮 細胞，然后加入完全培養基以終止胰酶消化過程，離心棄上清液后再次加入選擇性完全培 養基并移入培養皿中在培養箱中孵育，孵育第2天避免移動培養皿，孵育第3天根據細胞生 長情況采用半量換液法更換培養液，當卵巢表面上皮細胞密度達80%時，使用免疫熒光法 檢測上皮細胞標志物角化蛋白（Pan-keratin)的表達，當其陽性率達95%以上且鸛卵石樣 立方上皮細胞達80-85%以上時，進行下一步驟；
[0008] 2)早期傳代：接種代數小于15代的卵巢表面上皮細胞，使用半量換液法按2 :3至 3 :2比例傳代，傳代時間間隔5-7天，培養液采用選擇性完全培養基；
[0009] 3)中期傳代：接種代數在16至84代之間的卵巢表面上皮細胞，16-60代按1 :2至 1:4比例傳代，60代后按1 :5至1 :8比例傳代，傳代時間間隔為3-5天，培養液采用完全培 養基；
[0010] 4)晚期傳代：接種代數大于85的卵巢表面上皮細胞，按1 :8至1 :10比例傳代，傳 代時間間隔為3-5天，培養液采用部分性完全培養基。
[0011] 所述選擇性完全培養基、完全培養基均為包括胎牛血清（FBS)、mEGF、以及胰島 素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉（Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培養液，所述部 分性完全培養基為包括胎牛血清、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉且不含mEGF的DMEM/F12 培養液；所述選擇性完全培養基、完全培養基、部分性完全培養基中胎牛血清的濃度依次增 大，所述選擇性完全培養基中mEGF的濃度高于完全培養基中mEGF的濃度。
[0012] 進一步的，接種代數在15代之前的卵巢表面上皮細胞，每次傳代時使用胰酶溶液 的消化時間為30-45s，所述胰酶溶液中胰酶濃度為0. 1 %且不含EDTA。
[0013] 進一步的，所述選擇性完全培養基為包括3-4%胎牛血清（FBS)U-L2%青霉 素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin)、8_10ng/mlmEGF、1-1. 2%膜島素-轉鐵蛋白-亞 硒酸鈉（Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培養液。
[0014] 進一步的，所述完全培養基為包括6-8 %胎牛血清（FBS)U-L2 %青霉素-鏈霉 素（Penicillin-Streptomycin)、2_4ng/mlmEGF、1-1. 2 %膜島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉 (Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培養液。
[0015] 進一步的，所述部分性完全培養基為包括8-10 %胎牛血清（FBS)U-L2 %青 霉素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin)、1-1. 2 %胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉 (Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培養液。
[0016] 進一步的，所述卵巢表面上皮細胞分離步驟完成后，進行免疫熒光鑒定和/或免 疫組化鑒定之后，當鑒定結果符合標準后進行早期傳代步驟。
[0017] 本發明第二方面涉及一種減緩卵巢表面上皮細胞惡性轉化的方法，采用前述的卵 巢表面上皮細胞體外惡性轉化方法、或采用其它能夠使卵巢表面上皮細胞在體外惡性轉化 方法，以建立卵巢表面上皮細胞惡性轉化模型；培養過程中，在卵巢表面上皮細胞每次傳代 及每次更換培養基時添加活性維生素D(1，25(0H)2D3);應當說明的是：所述減緩是指對卵 巢表面上皮細胞由正常到惡性轉化全過程中細胞惡性程度進展的減緩；此外，體外培養細 胞與體內實驗不同，只能通過添加活性維生素D以提高活性維生素D的終濃度，而人或動物 體內由于含有維生素D代謝酶或合成代謝的完成系統，可以通過添加維生素D、25 -羥維生 素D(25 (OH)D)或活性維生素D(1，25 (OH) 2D3)以提高活性維生素D的終濃度。
[0018] 優選的，減緩卵巢表面上皮細胞惡性轉化過程中，所使用的培養基中添加活性維 生素D(1，25 (OH) 2D3)、并使其終濃度維持在0. 5~3nM;在小鼠卵巢上皮細胞惡性轉化的三 個階段中，由于細胞性質的變化使得維生素D的代謝酶和維生素D受體的表達出現差異，在 添加活性維生素D之后，其濃度值會在0. 5-3nM之間波動。優選的，活性維生素D或代謝后 的活性維生素D的終濃度維持在1 ±0. 5nM。
[0019] 優選的，培養過程中，在避光條件下添加活性維生素D。
[0020] 優選的，培養過程中，在低溫環境下添加活性維生素D，優選為-30~_20°C的環境 下，例如在冰箱里完成活性維生素D添加過程后立即放入37°C培養箱，或是添加時才從冰 箱中將活性維生素D取出。
[0021] 本發明第三方面涉及維生素D在制備減緩卵巢表面上皮細胞惡性轉化的試劑上 的應用，所述維生素D為包括維生素D2 (麥角鈣化醇，VD2)、維生素D3 (膽鈣化醇，VD3)、維生 素D類似物、25 -羥維生素D(25 (OH)D)、以及活性維生素D(1，25 (OH)2D3)在內的一種或多 種，所述試劑在卵巢表面上皮細胞每次傳代及每次更換培養基時添加。所述試劑若為包含 活性維生素D的試劑，可以在細胞培養過程中直接添加至培養基中，所述試劑若為不包含 活性維生素D的試劑，在細胞培養過程中，則需通過其它方式將其轉化為活性維生素D后再 加入至培養基中，例如采用細菌發酵法、或者采用添加特定的維生素D相關酶來實現。
[0022] 優選的，所述試劑添加后，培養基中的活性維生素D或代謝后的活性維生素D的 終濃度達到0. 5~3nM。優選的，活性維生素D或代謝后的活性維生素D的終濃度達到 1±0. 5nM。
[0023] 優選的，所述維生素D選用活性維生素D。
[0024] 優選的，所述含活性維生素D的試劑在避光條件下完成添加過程。
[0025] 優選的，所述含活性維生素D的試劑在-30~-20 °C環境下完成添加過程，例如在 冰箱里完成活性維生素D添加過程，或是添加時才從冰箱中將活性維生素D取出。
[0026] 本發明第四方面涉及維生素D在制備治療卵巢癌藥物上的應用，所述維生素D為 包括維生素D2 (麥角鈣化醇，VD2)、維生素D3 (膽鈣化醇，VD3)、維生素D類似物、25 -羥維 生素D(25 (OH)D)、以及活性維生素D(1，25 (OH) 2D3)在內的一種或多種。
[0027] 優選的，所述卵巢癌為起源于卵巢表面上皮的上皮型卵巢癌。
[0028] 優選的，所述維生素D為活性維生素D。
[0029] 優選的，所述藥物為預防性治療卵巢癌的藥物。
[0030] 優選的，所述藥物包括維生素D及化療藥物，所述化療藥物包括紫杉醇；卵巢癌對 紫杉醇易產生耐藥性，使用維生素D長期處理后可以增加卵巢癌對紫杉醇的敏感性。
[0031 ] 優選的，所述藥物包括注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑或顆粒劑。
[0032] 優選的，所述藥物的使用劑量標準為使腫瘤區域的活性維生素D或代謝后的活性 維生素D的終濃度達到0. 5~3nM;該使用劑量標準由體外卵巢表面上皮細胞惡性轉化試 驗結果推論得到，雖然體外和體內環境有所不同，但是體外試驗足以模擬腫瘤區域活性維 生素D的終濃度對于腫瘤細胞的影響；活體情況下，視具體使用方法和活體質量，相對應的 依照上述標準調整藥物的使用劑量。例如，當使用片劑、丸劑、膠囊劑或顆粒劑時，由于需要 體內對維生素D進行代謝，且活性維生素D的半衰期較短，為了達到特定濃度的活性維生素 D，可以使用維生素D2 (麥角鈣化醇，VD2)、維生素D3 (膽鈣化醇，VD3)、維生素D類似物、25 -羥維生素D(25 (OH)D)，并提高濃度；當采用注射劑型時，可將藥物直接注入腫瘤區域，因而 可采用活性維生素D，并可準確控制活性維生素D的終濃度范圍。優選的，活性維生素D或 代謝后的活性維生素D的終濃度達到1 ±0. 5nM。
[0033]借由上述方案，本發明至少具有以下優點：1)活性維生素D減緩卵巢表面上皮 細胞的惡性轉化過程（1)體外增殖能力：根據活性維生素D對MOSEC的細胞形態、增殖 能力、迀移能力的作用，將活性維生素D對MOSEC的惡性轉化作用階段分為三期，S卩I期 (P20-P60)、II期（P70-P90)、III期（P100-P120)。平板克隆實驗結果顯示，隨著MOSEC惡性 轉化過程，活性維生素D雖然增大了II和III期細胞的克隆直徑（P〈0. 05)，但是抑制了三個 階段細胞的克隆形成率（P〈〇. 05)。軟瓊脂克隆實驗結果表明：活性維生素D抑制I期和III 期細胞的克隆形成率（P〈〇. 05)，但是卻促進了II期細胞的軟瓊脂克隆形成率（P〈0. 05)。2) 體內致瘤性：由于活性維生素D促進了II期MOSEC的體外增殖能力，因此，本研究使用體內 致瘤實驗比較分析P90對照組與處理組細胞在裸鼠體內成瘤能力的變化。與對照組細胞相 比較，活性維生素D減弱了處理組細胞的成瘤能力，具體表現為腫瘤轉移灶減少（P