添加醇類促進二萜類化合物Libertellenone H產量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物發酵技術領域；更具體地，本發明涉及一種提高二萜類化合物 Libertellenone H產量的方法，通過在發酵培養基中添加醇類來大大提高二貓類化合物 Libertellenone H 的產量。
【背景技術】
[0002] 北極彎孢聚殼菌（Eutypella sp.)屬于絲狀真菌，其是分離自北極高煒度 (78° 55'N)仙女木根基土壤的一種絲狀真菌，該屬真菌在全球分布較為廣泛，且能夠產生 許多結構新穎、功能獨特的次級代謝物，比如桉烷型倍半萜、海松烷型二萜、三萜、細胞松弛 素類、聚酮類和環二肽類化合物。從該菌發酵產物中分離鑒定的兩種新型異海松烷型二萜 類化合物Libertellenone G和Libertellenone H對人肺癌細胞株H460、人膠質瘤細胞株 U251、人胃癌細胞株SG7901、人胰腺癌細胞株SW1990、人子宮頸癌細胞株Hela和人肝癌細 胞株Huh-7這7種腫瘤細胞株均有一定抑制活性。其中Libertellenone H對Mcf-7乳腺 癌的抑制作用最強，IC5tl達到了 3.31 ymol/L，和陽性對照紫杉醇的IC5tl相當，具有潛在的 開發應用前景。
[0003] 然而，Libertellenone H在Eutypella sp.的原始產量極低，甚至低于HPLC檢出 限，嚴重限制了對其進行進一步的體內外活性評價及藥代藥動力學等藥理學研宄。
[0004] 因此，本領域迫切需要找到提高Libertellenone H發酵產量的方法，從而為抗腫 瘤研宄提供新的藥物。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種通過添加醇類促進二貓類化合物Libertellenone H 產量的方法。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種提高Libertellenones H的產量的方法，所述方法 包括：培養北極絲狀真菌Eutypella sp·，從而生產Libertellenones H ;并且，在北極絲狀 真菌Eutypella sp.的培養基中添加醇類，所述的醇類選自甲醇或乙醇。
[0007] 在一個優選例中，所述的醇類為AR級甲醇或乙醇。
[0008] 在另一優選例中，添加所述的醇類的初始時間是發酵起始起算的第48~96小時； 較佳地，添加所述的醇類的初始時間是發酵起始起算的第60~84小時。
[0009] 在另一優選例中，添加醇類后，醇類在培養基中的最終濃度為1~10% (v/v);更 佳地為 2 ~6% (v/v)，如 4% (v/v)，5% (v/v)。
[0010] 在另一優選例中，所述的醇類的添加方式為：每次添加按照體積〇. 25~2. 5% (v/ v)的醇類，從第一次添加起每隔18~30小時添加1次，共添加2~4次，使醇類最終濃度 為 1 ~10 % (v/v);更佳地為 2 ~6 % (v/v)，如 4 % (v/v)，5 % (v/v)。
[0011] 在另一優選例中，所述的醇類的添加方式為：每次添加按照體積0. 5~I. 5% (v/ V)的醇類，從第一次添加起每隔20~28小時添加1次，共添加2~4次，使醇類的最終濃 度為2~6 % (v/v)，更佳地為3~5 % (v/v)。
[0012] 在另一優選例中，所述的醇類的添加方式為：每次添加按照體積1~2% (如 1. 333% ) (v/v)的醇類，從第一次添加起每隔24小時添加1次，共添加3次，使醇類的最終 濃度為4% (v/v)。
[0013] 在另一優選例中，所述的培養基包含：
[0014]
[0015]
[0016] 在另一優選例中，所述的培養基的pH調至
5. 8 ±0.2 ;較佳地pH調至為5.8 ±0. 1。
[0017] 在另一優選例中，所述的北極絲狀真菌是北極絲狀真菌Eutypella sp. D-I。
[0018] 在另一優選例中，培養北極絲狀真菌Eutypella sp.的溫度是28±2°C。
[0019] 在另一優選例中，所述的方法還包括：從發酵液中分離純化出Libertellenone Η。
[0020] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0021] 圖1、發酵培養基中添加甲醇對彎孢聚殼菌D-I菌體生長及Libertellenone H合 成的影響。
[0022] 圖2、發酵培養基中添加乙醇對彎孢聚殼菌D-I菌體生長及Libertellenone H合 成的影響。
[0023] 圖3、發酵培養基中終濃度4%的乙醇不同添加時間對彎孢聚殼菌D-I菌體生長及 Libertellenone H 合成的影響。
【具體實施方式】
[0024] 本發明人致力于提高北極絲狀真菌Eutypella sp.生產二貓類化合物 Libertellenone H的產量的研宄，通過深入而廣泛的研宄，意外地發現：在發酵過程中通過 加入醇類，特別是甲醇或乙醇，可以極大地促進Libertellenone H的產量。并且，本發明還 優化了醇類的添加時間和添加量。在此基礎上完成了本發明。
[0025] 除非另外說明，本發明中所提到的發酵培養基組成中各組分的量（g/L)是相對于 培養基的體積而言，添加的甲醇或乙醇的濃度百分比（v/v)及甲醇或乙醇的最終濃度百分 比（v/v)均為相對于培養基的體積而言。
[0026] 除非另外說明，本發明所述的接種量的百分比是相對于培養基的體積百分比。
[0027] 本發明人首次提出了以醇類提高北極絲狀真菌Eutypella sp.生產 Libertellenone H的產量的策略。所述的醇類包括：甲醇或乙醇；較佳地，為AR級的甲醇 或乙醇。
[0028] 適用于本發明方法的生產Libertellenone H的菌株沒有特別限制，可以是野生型 北極絲狀真菌Eutypella sp.，也可以是基于該菌株、通過常規方法改造或誘變而獲得的工 程菌，也可以是轉化有外源基因的重組的菌株，也可以是其自然突變體。
[0029] 利用上述的菌株，可在常規的、適合表達Libertellenone H的條件下培養，從而生 產Libertellenone H，并且在培養過程中添加醇類。
[0030] 本發明人在研宄中發現，濃度不當的醇類的添加對于菌株的生長有極大的影響， 使得菌體量減少。因此，本發明人還優化了醇類的添加量，以醇類在培養基中的最終濃度計 (如多次添加，以添加后的總量計），添加量為1~10% (v/v);更佳地為2~6% (v/v);進 一步更佳地為3~5% (v/v)。
[0031] 本發明人在研宄中發現，在不同的發酵時間點添加醇類，菌株生長的狀態也將受 到影響。因此，本發明人還優化了醇類的添加時間，較佳的添加方式為：每次添加按照體積 0.25~2. 5% (v/v)的醇類，從第一次添加起每隔18~30小時添加1次，共添加2~4次， 使醇類最終濃度為1~10% (v/v);更佳的添加方式為：每次添加按照體積〇. 5~1. 5% (v/v)的醇類，從第一次添加起每隔20~28小時添加1次，共添加2~4次，使醇類的最終 濃度為2~6 % (v/v)，更佳地為3~5 % (v/v)。
[0032] 應理解，在本發明的提示下，本領域人員也可適當地對于添加次數以及每次添加 量進行適當的調整，例如調整為進行更多次且每次更少量的添加方式，這種改變是本領域 技術人員已于聯想到的，且易于操作，也應包含在本發明的保護范圍內。
[0033] 多種已知的可被應用于北極絲狀真菌Eutypella sp.的培養基均應被包含在本發 明中，并且在其中添加醇類。還可在培養基中添加有益于菌株生長的微量元素。作為本發 明的優選方式，所述的培養基包含：
[0034]
[0037] 在本發明中，對于發酵生產的Libertellenone H，可以用常規方法進行純化，隨后 制成藥劑。一種可選的方法是對發酵樣品用常規方法酸化后進行離心、過濾等方式去除菌 體，獲得含Libertellenone H的發酵清液。然后，對發酵清液通過鹽析、超濾等方法進行初 步純化后再進行層析純化，也可直接進行離子層析純化。應理解，其它各種適用于化合物純 化的方法均可被應用于進行Libertellenone H的純化。
[0038] 在本發明的具體實施例中，利用北極絲狀真菌Eutypella sp. D-I (菌種保藏編號： CCTCC M2013144)為生產菌株，當發酵至72h時，在發酵培養基中添加甲醇或乙醇來促進 Libertellenone H產量的提高。在發酵培養基中添加甲醇最高產量可達到0.473mg/l，比 不加甲醇的對照組提高了 72. 3% ;在發酵培養基中添加乙醇最高產量可達到4. 36mg/l，比 不加乙醇的對照組提高了 14. 9倍，實現了極其優異的技術效果。
[0039] 本發明的有益效果具體如下：
[0040] 本發明提供了一種通過在發酵培養基中添加醇類提高Libertellenone H產量的 方法，克服了 Libertellenone H發酵產量低的缺陷。
[0041] 本發明對于北極絲狀真菌Eutypella sp.發酵研宄及Libertellenone H的代謝 調控研宄具有重要意義。
[0042] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0043] I.材料和方法
[0044] 1、實驗菌株及保藏方法
[0045] 彎孢聚殼菌D-I (Eutypella sp. D-1，菌種保藏編號：CCTCC M2013144)由中國人民 解放軍第二軍醫大學提供。
[0046] 菌株接種于種子培養液中，培養3. 5天后獲得新鮮種子液，50%甘油與新鮮種子 液按2:3比例混合于保種管，置于_80°C冷凍保藏，并取新鮮種子液于安瓿管中經冷凍真空 干燥保存。
[0047] 2、培養基
[0048] 固體平板及種子液體培養基：
[0049]
[0050]
[0051] 固體平板培養基則是在此基礎上添加2%的瓊脂粉，于1