用于表達豬流行性腹瀉蛋白中m蛋白、n蛋白和s1蛋白的重組質粒及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N 蛋白和Sl蛋白的重組質粒及其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED)首次報道于英國，隨后比利時， 德國，加拿大，日本，瑞士等多個國家相繼報道，我國于1976年發現此病并陸續報道。豬流 行性腹瀉（PED)是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起 的，以豬嘔吐，嚴重腹瀉脫水為主要臨床癥狀特征的高度接觸性傳染病。不同年齡和不同品 種的豬均易感，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬發病率可達100%，死亡率高達95%以上。近 年來，PED的流行區域有逐漸擴大的趨勢，危害比較嚴重，給養豬業帶來巨大經濟損失，已成 為中國甚至世界最常見的豬腹瀉傳染病之一。
[0003] PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組為不分節段的單股正鏈 RNA，基因組全長約28033bp，編碼的結構蛋白主要有纖突（spike)蛋白（即S蛋白），囊膜 (Membrane)蛋白（即M蛋白），核衣殼（nucleocapsid)蛋白（即N蛋白）。PEDV S蛋白可 以被劃分為2個功能區即Sl (第1-789位氨基酸）和S2 (第790-1383位氨基酸），其中Sl 區包含了病毒主要的中和表位和受體結合域。
[0004] 2A肽是近年使用較多的一種構建多基因載體的工具，與其它多基因構建策略相 比，2A肽片段小，能自動切割連接的上下游蛋白，并且規避了多基因表達時蛋白活性不高或 下游基因表達量低等缺點，具備明顯的優勢，是目前較為理想的多基因表達策略。2A肽最初 于1991年被Ryan及其同事在口蹄疫病毒（FMDV)中鑒定得到，可以自裂解為小片段肽，屬 于小RNA病毒屬小核糖核酸病毒。2A肽平均長度為18-22氨基酸（AA)。2A代表小RNA病 毒多蛋白中的一段特定區域，源于研宄者所參用的學術命名系統。2A肽可以在自己的C-端 自動裂解，N-端被3C/3CD蛋白酶裂解或從上游殼蛋白ID處起修整的一小段肽。2A肽在多 基因共表達中應用廣泛，通過2A肽連接從海洋細菌中獲取的胡蘿卜素4,4'_氧合酶以及3， 3'-羥化酶，可賦予本不能合成酮類胡蘿卜素的高等植物（如西紅柿和煙草等）生產蝦青 素以及斑蝥素的能力。在轉基因動物領域，4個復雜的⑶3蛋白（⑶3 ε，γ，δ，ζ )基因通 過2Α肽連接構建逆轉錄病毒載體后轉染CD3缺陷型小鼠骨髓細胞，可活化T細胞，刺激其 功能發揮。2Α肽連接兩個熒光報告基因轉染小鼠受精卵，可實現小鼠胚胎期、成年后穩定表 達兩種熒光蛋白并將該基因穩定遺傳給后代。
[0005] 核酸疫苗是把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒DNA直接 注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反 應。核酸疫苗與其他疫苗相比，具有無可比擬的優點：如生產成本低，易于構建適于大批量 生產，可以根據需要隨時進行更新，化學性質穩定，保存和運輸方便，不存在減毒疫苗毒力 回升的危險；選擇抗原決定簇的自由空間比較大，可以同時構建編碼不同蛋白質的重組質 粒同時預防多種疾病，為制備聯合疫苗方面提供了廣闊空間。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種誘導產生針對PEDV特異性抗體的能力強、表達能力 強的用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組質粒及其構建方法和應 用。
[0007] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0008] 一種用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組質粒，所述重 組質粒攜帶有：
[0009] 載體質粒；
[0010] 豬流行性腹瀉病毒中的M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因、Sl蛋白編碼基因；及
[0011] 連接肽，所述M蛋白編碼基因和N蛋白編碼基因通過連接肽連接，所述N蛋白編碼 基因和Sl蛋白編碼基因通過連接肽連接。
[0012] 本發明中，優選的方案為所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒CV777株， GeneBank公布的編號為AF353511。
[0013] 本發明中，優選的方案為所述載體質粒為PVAXl載體質粒，所述連接肽為2A肽。
[0014] 本發明中，優選的方案為該重組質粒為PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAXl為載體 質粒，2A為連接M和N、N和Sl的連接肽2A，M、N和Sl分別為豬流行性腹瀉病毒中表達M 蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因和Sl蛋白編碼基因。
[0015] 本發明中，優選的方案為所述重組質粒中的M-2A段之間包含一個Furin蛋白酶酶 切位點，所述重組質粒中的N-2A段之間包含一個Furin蛋白酶酶切位點。
[0016] 本發明還提供該用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組 質粒的構建方法，包括如下步驟：
[0017] a、制備含豬流行性腹瀉病毒中的M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因序列的質粒；
[0018] b、制備含豬流行性腹瀉病毒中的Sl蛋白編碼基因序列的質粒；
[0019] C、將a步驟得到的含豬流行性腹瀉病毒中的M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因序 列的質粒和步驟b得到的含豬流行性腹瀉病毒中的Sl蛋白編碼基因序列的質粒雙酶切，然 后進行連接反應，得到產品。
[0020] 發明中，優選的方案為：
[0021] 所述a步驟中的含豬流行性腹瀉病毒中的M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因序列 的質粒為含M_2A_N_2A基因序列的質粒，所述含M_2A_N_2A基因序列的質粒的制備方法包 括如下步驟：合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列，然后將得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI 基因序列與載體質粒連接，得到含M-2A-N-2A基因序列的質粒；
[0022] 所述b步驟包括如下步驟：以Sl蛋白編碼基因序列為模板進行PCR擴增，得到 NotI-Sl-XhoI序列，將NotI-Sl-XhoI序列與載體質粒連接，得到含Sl蛋白編碼基因序列的 質粒。
[0023] 本發明中，進一步優選的方案為所述a步驟中含M-2A-N-2A基因序列的質粒為 PVAX1-M-2A-N-2A質粒，制備PVAX1-M-2A-N-2A質粒的方法包括如下步驟：
[0024] 合成BamHI_M_2A_N _2A_NotI基因序列：在M蛋白編碼基因肖U加入BamHI酶切位 點和KOZAK序列，在N蛋白編碼基因前加入KOZAK序列，利用2A肽將M蛋白編碼基因和N 蛋白編碼基因連接起來，然后在N蛋白編碼基因的尾端連接上2A肽，然后在得到的片段 后加入NotI酶切位點，去除M蛋白編碼基因和N蛋白編碼基因序列的終止密碼子，得到 BamHI-M-2A-N-2A-NotI 基因序列；
[0025] 將得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列與puc57載體質粒連接，得到 puc57-M-2A-N-2A 質粒；
[0026] 將得到含M-2A-N-2A基因序列的質粒、PVAXl載體質粒雙酶切，進行連接反應，得 到 PVAX1-M-2A-N-2A 質粒。
[0027] 本發明中，進一步優選的方案為在M-2A段之間加入一個Furin蛋白酶酶切位點， 在N-2A段之間加入一個Furin蛋白酶酶切位點。
[0028] 本發明中，進一步優選的方案為所述b步驟中含Sl蛋白編碼基因序列的質粒為 PMD18-T-S1質粒，制備pMD18-T-Sl質粒的方法包括如下步驟：
[0029] 以Sl基因的核酸序列為模板，以上下游引物進行PCR擴增，其中：
[0030] 上游引物：ATAAGAATGCGGCCGCATGAGGTCTTTAAITTAC (NotI);
[0031] 下游引物：CCGCTCGAGAATACTCATACTAAAGTT (XhoI);
[0032] 其中GCGGCCGC為NotI酶切位點，CTCGAG為XhoI酶切位點；
[0033] 將擴增得到的Sl基因序列與pMD18-T-Simple載體質粒連接，得到pMD18-T-Sl質 粒。
[0034] 本發明的用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組質粒，可 用于制備豬流行性腹瀉核酸疫苗。如，將本發明的重組質粒轉染293T細胞，該重組質粒便 會在293T細胞中表達M蛋白、N蛋白和Sl蛋白。
[0035] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0036] 1、本發明選取表達基因為完整的M蛋白編碼基因，N蛋白編碼基因，Sl蛋白編碼 基因，完整的包含了線性抗原表位和中和表位，因此誘導產生針對PEDV特異性抗體的能力 強；
[0037] 2、本發明選取2A肽作為連接表達蛋白的連接肽（Linker)，2A肽序列短，具有高裂 解活性，能夠實現編碼基因與連接肽直接達到良好的連接；
[0038] 3、M-2A段之間、N-2A段之間包含一個Furin蛋白酶裂解位點（-RAKR)，可以保證 蛋白在沒有殘留氨基酸的情況下表達，保證了蛋白的活性和空間結構的正確；
[0039] 4、本發明選取PVAXl作為表達載體，它能使重組蛋白在哺乳動物細胞中高效的表 達。
[0040] 下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
【附圖說明】
[0041] 圖1是實施例1的用于表達豬流彳丁性腹彳與蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組 質粒的構建示意圖；
[0042] 圖2是實施例1的用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組 質粒雙酶切結果的電泳圖；
[0043] 圖3是實施例1的用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組 質粒的PCR擴增基因的電泳圖；
[0044] 圖4是實施例1的間接免疫熒光法測定PVAX1-M-2A-N-2A-S1質粒轉染293T細胞 后N蛋白的表達圖，其中一抗采用N蛋白單克隆抗體，二抗采用綠色熒光二抗；
[0045] 其中，圖 2 中，M、10KB 核酸 Marker ;1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1 質粒；2、利用 NotI/ XhoI對PVAX1-M-2A-N-2A-S1質粒進行雙酶切后的質粒；
[0046] 圖3中，M、5KB核酸Marker ;1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1質粒中擴增的M蛋白編碼基 因；2、PVAX1-M-2A-N-2A-S1質粒中擴增的N蛋白編碼基因；3、PVAX1-M-2A-N-2A-S1質粒中 擴增的Sl蛋白編碼基因。
【具體實施方式】
[0047] 實施例1
[0048] 一種用于表達豬流行性腹瀉蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組質粒，所述 重組質粒攜帶有：載體質粒；豬流行性腹瀉病毒中的M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因 、Sl 蛋白編碼基因；及連接肽，所述M蛋白編碼基因和N蛋白編碼基因通過連接肽連接，所述 N蛋白編碼基因和Sl蛋白編碼基因通過連接肽連接；所述連接肽為2A肽；該重組質粒為 PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAXl為載體質粒，2A為連接M和N、N和Sl的連接肽2A，M、N和 Sl分別為豬流行性腹瀉病毒中表達M蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因和Sl蛋白編碼基因； 所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒CV777株，GeneBank公布的編號為AF353511。
[0049] 構建本實施例的用于表達豬流彳丁性腹彳與蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重組質 粒，所