一種復合細胞外基質成分生物材料的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種復合細胞外基質成分生物材料，以脫細胞小腸粘膜下層SIS為中間層，脫細胞膀胱粘膜層基底膜UBM為上下表層；所述上下表層完全包覆中間層形成三明治結構。本發明綜合了UBM和SIS的優點：UBM隔絕SIS的免疫原性及其與宿主組織的直接接觸，植入后的宿主?材料交界區炎癥反應基本類型與單純UBM相同，組織相容性高；另一方面，SIS能彌補UBM力學強度低的缺點，且SIS制備方便、拼接后厚度可變；可應用于填充、加強、修復或重建筋膜、腦膜、胸膜、盆底、真皮、實質臟器等各種軟組織缺損，具備良好的臨床實用性。
【專利說明】
-種復合細胞外基質成分生物材料
技術領域
[0001] 本發明屬于組織修復材料領域，特別設及一種復合細胞外基質成分生物材料。
【背景技術】
[0002] 脫細胞基質生物材料(Acellular Tissue Ma化ix，ACTM)是近二十年來軟組織修 復材料研究的重要進展。即運用物理或化學方法脫去組織中的所有細胞、抗原、脂質、可溶 性蛋白質等物質、保留下的具有完整外觀形態、組織學特性及超微結構的不溶性細胞外基 質巧xtracellular Matrix，ECM)作為生物支架。ECM是生物進化過程中高度保守的部分，不 同種屬間相同組織內ECM差異小，經脫細胞技術去除引起免疫排斥反應的細胞成分和抗原 后的ACTM是能夠安全的異種異體移植的。與合成材料的引發慢性炎癥刺激，導致纖維細胞 包裹癒痕修復的機理不同，ACTM可W誘導"內源性組織再生"：植入后其內所含的生物信號 或降解產物可W誘導修復區周圍巨隧細胞和干細胞主動、快速浸潤，生長、增殖并分泌自身 細胞外基質替代植入物。隨著宿主組織的長入，ACTM逐步降解，兩者基本同步，最終ACTM完 全被宿主組織代替。因此，ACTM作為組織修復材料具有較多優勢:①結構和組分接近自然組 織:主要成分是膠原纖維等結構蛋白，和少量糖蛋白、纖粘蛋白、糖胺聚糖和蛋白多糖類、生 長因子與酶類等;②ACTM有良好的可降解性和降解速率可控性，降解更符合再生規律;③ ACTM具有一定的孔隙率，便于組織間的營養和物質空氣的交換;④ACTM具有一定的機械強 度能夠對組織的生長起到支持作用。⑤具備一定的耐受感染能力，可W用在伴有污染或潛 在感染的組織缺損，因為其可W實現吞隧細胞早期進入、早期局部快速再血管化，細菌生物 膜難W形成。
[0003] ACTM目前已臨床應用于替代腦膜、胸膜、腹壁筋膜等，吻合口加強、盆底重建、膀脫 懸吊、肝脾等實質臟器破損填塞止血W及各種復雜痛和腹壁缺損的治療如伴有污染的腹壁 缺損、合成補片植入后感染、腸擾二次手術治療等。據統計，在美國ACTM的用量已占到軟組 織修復材料的5~10%。根據組織來源的不同生物補片可大體分為兩類:①惰性組織（Ined tissue, IT)源產品，W人尸/豬的真皮、牛/豬/馬的屯、包、牛/豬的腹膜等為代表。來源組織 屬機體內生物惰性組織，成分幾乎僅為結構蛋白（膠原纖維和彈力纖維），無粘連蛋白、生長 因子和蛋白聚糖類等生物活性成分。②ECM源生物材料，其擁有完整的活體組織細胞外基質 的Ξ維超微結構和粘連蛋白類、生長因子類、糖胺聚糖類等生物活性成分。運類產品W小腸 粘膜下層（Small Intestinal Submucosa, SIS)、人羊膜、膀脫粘膜層基底膜（UrinaiT Bladder Ma化ix，UBM)等為代表。ECM生物材料的制備技術(包括脫細胞處理和成型工藝)較 IT源產品更復雜但ECM生物材料較IT源產品擁有更多修復組織缺損的優勢:① IT源產品僅 能誘導血管化的結締組織再生填充組織缺損、實現解剖層面的修復，而ECM生物材料植入后 可與宿區有效整合，主動吸引自體干細胞遷入損傷處并促進增殖和分化而實現部分程度的 特異性、功能性修復，如實現肌肉筋膜等組織再生和神經支配部分恢復而改善殘疾肢體功 能和指尖再造。②IT源產品結構致密，含有大量降解緩慢且人體25歲后不能再生的彈性纖 維，導致修復區遠期不穩定，易失彈性。③ECM生物材料較IT源產品更耐受感染、組織再生速 度更快。
[0004] SIS來源于哺乳動物小腸，是機械除去小腸肌層和漿膜層后經脫細胞處理而得。 SIS主要由I、虹型膠原組成，含有少量的IV、V型膠原，糖胺聚糖、生長因子、纖連蛋白等，植 入體內后可完全降解，是組織工程良好的支架材料。SIS具有良好的力學強度，原材料來源 廣泛，預處理較為簡便或借助機器實現自動化處理。但SIS的生物活性相對較低，且由于其 在活體環境中可能接觸到食物中各種抗原而致其帶有較高的初始生物負載，雖然經過嚴格 的脫細胞、滅菌等處理仍具有一定的免疫原性(可能的內毒素、Gal抗原表位等殘留），引起 宿主免疫反應。
[0005] 中國專利CN2608014公開了一種兼有硬膜和蛛網膜功能的人造硬腦膜，在人羊膜 層上粘合小腸粘膜下層，具有人體硬腦膜的機械抗張能力和蛛網膜防粘連的雙重功能。但 運一制備方法沒有完全隔絕SIS的免疫原性。
[0006] 中國專利CN101366979公開了一種組織補片及其制備方法，W脫細胞小腸粘膜下 層為內層，兩面包裹覆有脫細胞羊膜所構成。W脫細胞羊膜隔絕了脫細胞小腸粘膜下層的 免疫毒性，而脫細胞小腸粘膜下層補償了脫細胞羊膜的機械強度不足，具有較高的生物活 性和組織相容性，無明顯免疫排斥反應，對細胞無毒性。但羊膜為人源性材料，來源難W控 審IJ，存在傳播未知病毒或疾病的風險。
[0007] UBM來源于哺乳動物膀脫，經機械方法除去漿膜、肌層、粘膜下層、粘膜肌層后脫細 胞處理所制得。與SIS相比，UBM具有如下優勢:①極低免疫原性，高組織相容性:UBM在活體 內不接觸細菌等生物負載，層次簡單，且取材過程中可W做到無內毒素污染。②生物活性 高:UBM含完整基底膜結構和成分，可構成血管、皮膚等上皮組織細胞生長的支撐層，可W幫 助組織特異性細胞形成連續的片層、抑制瘤痕組織生成，有助于增強組織修復和傷口愈合 并實現缺損組織特異性的再生。應用Ma化istemUcell公司UBM產品）的患者開放性傷口愈 合時間由25.5周縮短至9.8周。其降解產物含有超過5000種活性成分，其中可W確證與組織 愈合相關的蛋白或多膚有4巧巾，包括神經營養、促血管新生、抑制腫瘤活性或其他與組織重 塑、傷口修復相關的成分(表1)。但在實際生產過程中，UBM的剝離需耗費大量人工，且機械 強度不足，表面光滑難W制成具有一定厚度的產品。
[000引表1 UBM降解產物活性成分
[0009]
[0010]


【發明內容】

[0011] 本發明所要解決的技術問題是提供一種復合細胞外基質成分生物材料，該材料綜 合了UBM和SIS的優點:UBM隔絕SIS的免疫原性及其與宿主組織的直接接觸，植入后的宿主- 材料交界區炎癥反應基本類型與單純UBM相同，組織相容性高；另一方面，SIS能彌補UBM力 學強度低的缺點，且SIS制備方便、拼接后厚度可變;可應用于填充、加強、修復或重建筋膜、 腦膜、胸膜、盆底、真皮、實質臟器等各種軟組織缺損，具備良好的臨床實用性。
[0012] 本發明的一種復合細胞外基質成分生物材料，所述生物材料W脫細胞小腸粘膜下 層SIS為中間層，脫細胞膀脫粘膜層基底膜UBM為上下表層;所述上下表層完全包覆中間層 形成Ξ明治結構。
[0013] 所述SIS由哺乳動物小腸經機械方法除去漿膜層和肌層后脫細胞處理制得，為膜 片狀材料。
[0014] 所述UBM由哺乳動物膀脫經機械方法除去漿膜、肌層、粘膜下層、粘膜肌層后脫細 胞處理制得，為膜片狀材料。
[001引所述中間層的層數化~20層。
[0016] 所述上下表層的層數各為1~10層。
[0017] 所述中間層與上下表層間、中間層與上下表層內（即多層UBM間、多層SIS間）W醫 用粘合劑、縫合捆扎、真空層壓中的一種或幾種方式固定。
[0018] 所述上下表層具有高生物活性，且有效隔絕中間層的免疫原性，不改變外層UBM的 宿主-材料交界區炎癥反應類型。所述中間層可顯著提高材料的力學強度與材料厚度。
[0019] 所述醫用粘合劑為殼聚糖、膠原蛋白、纖維蛋白膠、透明質酸、硫酸軟骨素、水凝 膠、骨膠、明膠、果膠中的一種或幾種。醫用粘合劑、縫合線優選可吸收成分。
[0020] 所述真空層壓的工藝參數為:真空壓力為-50~-760mmHg，作用時間為0.5~72h。 [0021 ]所述生物材料還包括貫穿材料的孔桐。
[0022] 所述孔桐的直徑為1~5mm，孔間距為0.5~5 cm。
[002；3] 有益效果
[0024] (1)高生物活性，組織粘連輕，無過量癒痕:表層UBM基底膜組織成分可W釋放大量 支持和調控細胞生長分化等生命行為的活性因子，如堿性成纖維生長因子、表皮生長因子、 肝細胞生長因子、角蛋白細胞生長因子等成分，促進細胞的黏附和遷移，誘導分化，減少調 亡；調控上皮細胞優先于成纖維細胞侵入并抑制過量纖維蛋白原滲出，在成纖維細胞占優 勢前形成上皮組織，聯合材料表面光滑的基底膜結構，減少粘連，抑制癒痕組織生成。
[0025] (2)高組織相容性、低免疫原性、不改變UBM的宿主-材料交界區炎癥反應基本類 型:SIS被包裹在極低免疫原性的UBM中，保證植入初期無法直接接觸到周圍組織，延遲可能 引起免疫反應的成分釋放，免疫反應類型和程度與單純UBM植入相同。伴隨UBM的降解，組織 同步長入，植入后期SIS的逐漸暴露將不再改變組織修復結果。貫穿整個材料的孔桐，加速 周圍組織細胞長入，利于組織液流動，故血清腫等局部并發癥發生率低。
[0026] (3)良好的力學強度，厚度可變，適應不同創面修復的需要。中間層可為材料整體 提升力學強度，且SIS的層數可W適當增減W適應不同力學需求的組織修復。醫用粘合劑和 真空層壓的聯合使用增強了材料的剝離強度，保證多層材料水化或剪裁后的完整性，不易 松散。
[0027] (4)降低原料預處理難度，價格低廉:在兼顧UBM和SIS優勢的同時，本發明可W大 幅度降低產量和生產周期限制因素-UBM的用量。降低材料成本，縮短生產周期，減少人力投 入。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明的結構示意圖；其中，1為脫細胞小腸粘膜下層SIS，2為脫細胞膀脫粘 膜層基底膜UBM。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可W對本發明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0030] 實施例1
[0031] WAbraham法制備豬源性脫細胞膀脫粘膜層基底膜(UBM)和脫細胞小腸粘膜下層 (SIS)。一層UBM鋪平(光滑面向下），將單片膜狀SIS按照層間錯位50%的方式拼接為獨立片 層，平鋪于UBM表面，層間錯位90°鋪設4層。其上再鋪設一層UBM(光滑面向上）。排除氣泡，各 層間使用醫用殼聚糖粘合劑粘合，再W-250mm化的壓力經過24h將其壓為一體。材料全層 打孔，孔間距為5mm，直徑為1mm。
[0032] 實施例2
[0033] WAbraham法制備豬源性脫細胞膀脫粘膜層基底膜(UBM)和脫細胞小腸粘膜下層 (SIS)。兩層UBM鋪平(光滑面向下），將單片膜狀SIS按照層間錯位50%的方式拼接為獨立片 層，平鋪于UBM表面，層間錯位90°鋪設6層。其上再鋪設兩層UBM(光滑面向上）。排除氣泡，各 層間使用醫用膠原蛋白粘合劑粘合，再W-300mm化的壓力經過36h將其壓為一體。材料全 層打孔，孔間距為8mm，直徑為2mm。
[0034] 實施例3
[0035] 根據GB/T528-2009,取3個樣品制作成4cmXlcm的啞鈴狀，水化后用材料力學試驗 機固定樣品兩端，W lOmm/min速度拉伸，測算材料抗張強度為34± 3N/cm。
[0036] 取3個樣品制作成2cm X 5cm，兩端固定在拉力機上下夾持器上，WlOmm/min穩定的 速度連續剝離，直到樣品重疊部分分層。測量分層時負載力。SIS-SIS間、UBM-SIS間的剝離 強度為6±2N/cm，剝離維持力為l.5±0.5N/cm。
[0037] 根據GB/T 16886.5規定的方法評價材料細胞毒性。^^冊了3和1^929為模式細胞。 W細胞培養基為浸提介質，W梯度濃度的浸提液替代培養基培養細胞，MTT法測定細胞存活 率。材料的細胞毒性為0~I級。
[0038] 細胞遷移實驗:將材料低溫粉碎，蛋白酶酶解，酶解產物濃度為50yg/mL。細胞經饑 餓培養2地后，Boyden小室法測定化細胞遷移量，W含10%胎牛血清培養基和不含血清培養 基分別為陽性和陰性對照。修復材料細胞遷移量為2056 ± 72，陽性對照為2105 ± 35，陰性對 照為1328 ±65。材料組與陽性對照組無顯著性差異(P〉0.05)。
[0039] 根據GB/T14233.2規定的方法檢測材料內毒素含量。W內毒素檢測用水為浸提介 質，37°C浸提24h。動態濁度法測定材料內毒素含量，復測稀釋浸提液內毒素含量W排除干 擾。材料內毒素含量《祀U/裝置。
[0040] 根據GB/T14233.2規定的方法測定材料血液相容性。接觸組：大鼠背部脫毛，涂抹 濃度為50yg/mL的酶解產物，每天涂抹1次，連續涂抹20d;經口攝入組:7d內隔天口服ImL浸 提液，共攝入4次;肌肉注射組和靜脈注射組:7d內隔天注射濃度為0.15mL浸提液，各注射4 次。分別于染毒第30天和90天兩批處死動物，取靜脈血用于測試。溶血率按下列公式計算： 溶血率（％) =(樣品吸光度一陰性吸光度)/(陽性吸光度一陰性吸光度）X 100%。材料溶血 率《5%。
[0041] 根據GB/T 16886.10規定的方法評價材料皮內刺激性。于白兔皮內注射浸提液及 對照液(PBS)各0.2mL，于注射后15min，化，2d，3d觀察實驗區皮膚反應，根據紅斑和水腫情 況打分。材料無刺激性。
[0042] 根據GB/T 16886.10規定的最大劑量法評價材料致敏性。純淀粉溶液為陰性對照 組，經口灌胃，持續1周，停藥后繼續觀察1周。每天記錄大鼠體重，觀察動物臨床毒性體征， 記錄毒性級別。實驗結束后處死大鼠常規組織病理切片。材料無遲發型超敏反應。
[0043] 構建犬腹直肌前銷和腹直肌缺損動物模型，缺損面積為10 X5cm2,將復合軟組織 修復材料裁剪至一定大小進行修復，W單純SIS、單純UBM為對照。單純SIS對照組術后修復 區血清腫發生率為33%，單純UBM和復合軟組織修復材料組未發生血清腫。術后2周、1個月、 2個月、4個月取出修復區，組織切片經CD68、CCR7、CD163染色觀察浸潤細胞類型和密度，Ml/ M2巨隧細胞比例，證實材料不改變UBM的宿主-材料炎癥反應基本類型，且組織修復效果與 純UBM相近。
【主權項】
1. 一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述生物材料以脫細胞小腸粘膜 下層SIS為中間層，脫細胞膀胱粘膜層基底膜UBM為上下表層;所述上下表層完全包覆中間 層形成三明治結構。2. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述SIS由 哺乳動物小腸經機械方法除去漿膜層和肌層后脫細胞處理制得。3. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述UBM由 哺乳動物膀胱經機械方法除去漿膜、肌層、粘膜下層、粘膜肌層后脫細胞處理制得。4. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述中間層 的層數為1~20層。5. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述上下表 層的層數各為1~10層。6. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述中間層 與上下表層間、中間層與上下表層內以醫用粘合劑、縫合捆扎、真空層壓中的一種或幾種方 式固定。7. 根據權利要求6所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述醫用粘 合劑為殼聚糖、膠原蛋白、纖維蛋白膠、透明質酸、硫酸軟骨素、水凝膠、骨膠、明膠、果膠中 的一種或幾種。8. 根據權利要求6所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述真空層 壓的工藝參數為:真空壓力為-50~-760mmHg，作用時間為0.5~72h。9. 根據權利要求1所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述生物材 料還包括貫穿材料的孔洞。10. 根據權利要求9所述的一種復合細胞外基質成分生物材料，其特征在于:所述孔洞 的直徑為1~5mm，孔間距為0 · 5~5cm 〇
【文檔編號】A61L27/40GK105920669SQ201610261472
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】張劍
【申請人】上海卓阮醫療科技有限公司