鉀離子轉運蛋白基因trkH、其編碼蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及來源于海洋微生物的鉀離子轉運蛋白基 因 trkH、其編碼蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] K+是植物及微生物生長所必需的營養元素之一，廣泛分布于有機體內，參與多種 重要的生理過程。我國土壤普遍缺鉀，并伴有一定程度鹽漬化，細胞內過多的Na +積累會 產生毒性，因此維持細胞質內相對穩定且較高K+含量和較低Na+含量至關重要 [1]。一些研 宄已從不同植物中克隆得到一些鉀離子吸收轉運相關基因，而這些基因大部分來自甜土植 物，表達的蛋白多數對Na +敏感，使得它們在高Na +環境下無法較好地行使K +吸收功能。已 有文獻報道，某些微生物中的K+轉運蛋白在Na +存在下仍有較高K +吸收活性，這與它們的 嗜鹽或耐鹽屬性有關[2]。海洋是高鹽環境，海洋微生物中的K+轉運蛋白很可能具有Na +不 敏感性。由于海洋環境微生物中99%是未可培養的[3]，為了獲得功能基因，選用海洋微生 物宏基因組DNA為實驗材料，該宏基因組DNA包含所收集海水中幾乎所有微生物的遺傳信 息。通過克隆手段得到目的基因后，將基因以無縫連接技術構建到酵母表達載體中，并用電 擊轉化法將重組質粒導入K +吸收缺陷型釀酒酵母CY162中進行功能互補實驗，這也是首次 細菌來源的trk基因在真核系統內的表達探宄。
[0003] 參考文獻：
[0004] [1JVOLKOV V1WANG BjDOMINY PJ, et al.A salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana, possesses effective mechanisms to discriminate between potassium and sodium[J]. Plant, Cell&Environment, 2004, 27(I):1-14.
[0005] [2]FAILLIE C. C, JABN0UNE M, ZIMMERMANN S, et al. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family[J]· Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67(15):2511-2532.
[0006] [3] Joshi G K1Jugran J1Bhatt J P. Metagenomics: The Exploration of Unculturable Microbial World[M]. Advances in Biotechnology.Springer India, 2014:105-115.

【發明內容】

[0007] 針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種來源于海洋細菌且具有鉀吸收 功能的鉀離子轉運蛋白基因，該基因是從海洋微生物宏基因組DNA中分離的一個DNA分子， 命名為trkH。
[0008] 本發明提供的來源于海洋微生物的鉀離子轉運蛋白基因 trkH，具有如SEQ ID NO: 1所示的堿基序列。其序列由1392個堿基組成，自5'端第1到第1392位殘基為該基因 的開放閱讀框序列。
[0009] 本發明的另一方面在于提供具有與上文所述的SEQ ID NO: 1所示的堿基序列95% 以上的同源性，且編碼與SEQ ID NO: 1所示的堿基序列編碼的蛋白質具有相同生物學功能 蛋白質的喊基序列。
[0010] 本發明的另一方面在于提供上文所述的鉀離子轉運蛋白基因 TrkH編碼的蛋白 質，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，其是有463個氨基酸殘基組成的蛋白質。
[0011] 本發明的另一方面在于提供上文所述的鉀離子轉運蛋白基因 TrkH編碼的蛋白質 的衍生蛋白質，其具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基取代、 缺失或添加而產生的氨基酸序列，且該衍生蛋白質與上文所述鉀離子轉運蛋白基因 trkH 編碼的蛋白質具有相同的生物學功能。
[0012] 本發明的另一方面在于提供含有上文所述基因的重組表達載體。本發明所提供的 來源于海洋微生物的鉀離子轉運蛋白基因 trkH，連接于可以誘導外源基因表達的表達載體 制備得到trkH基因重組表達載體。優選的情況下，所述表達載體為質粒pYES 2.0。酵母表 達載體pYES2. 0是帶有Amp和Ura篩選標記的穿梭質粒，在原核生物如大腸桿菌中，該載體 可以利用T7啟動子啟動下游基因的表達；在真核微生物如釀酒酵母中，該載體則可以利用 被半乳糖高誘導的GAL啟動子啟動下游基因的表達。在大腸桿菌內，載體pYES2.0由于具 有Amp抗性所以可進行氨芐霉素篩選，而在真核微生物釀酒酵母CY162中，氨芐霉素對其生 長不會造成影響，因此在酵母中無法用該方法篩選。釀酒酵母CY162的基因型顯示，其Ura 基因突變，尿嘧啶合成功能受到阻礙，因此不能在缺少Ura的培養基中生長，可據此進行有 效篩選。
[0013] 本發明的另一方面在于提供含有上文所述trkH基因的宿主細胞。優選地，該宿主 細胞含有trkH基因的重組表達載體。在本發明的技術方案中，所述的宿主細胞優選采用 釀酒酵母 K+吸收缺陷型菌株 CY162 (Mat a，ura3-52, his3D200, his44-15, trkDl, trkD2: : p cK64)。通過功能互補、離子耗竭和生長情況比較等實驗證實該基因在提高轉基因酵母在低 鉀和鹽脅迫環境下K +吸收中的應用。實驗結果表明，本發明所述轉基因微生物提高了 K +吸 收速率和對Na+的不敏感性。
[0014] 本發明的另一方面在于提供上文所述基因在培育低鉀且鹽脅迫環境下仍能良好 生長的農作物中的應用。本發明的trkH基因所編碼的TrkH蛋白具有K +吸收和對Na+不 敏感的特性，該基因雖然來自細菌但本發明成功得到該基因的轉基因真核微生物（釀酒酵 母），并證明轉基因微生物在低鉀和高鹽（Na+)濃度下的K +吸收功能，說明本發明的基因可 以轉入至植物細胞等真核細胞中，并應用于在低鉀且鹽脅迫環境下仍能良好生長的農作物 的培育。
[0015] 本發明的有益效果：
[0016] 本發明的基因 trkH來源于海洋細菌，其編碼的蛋白TrkH具有吸收轉運鉀離子的 功能，能提高轉基因 K+吸收缺陷型釀酒酵母的K +吸收效率和對Na +的不敏感性，從而提高 其在缺鉀且鹽脅迫條件下的生長狀況。這是該類基因首次在真核系統中鑒定到相關蛋白功 能，培育相應轉基因植物，將在農作物鉀高效利用方面具有很高的應用價值，同時能夠很好 的應用于缺鉀高鹽環境中優良性狀農作物的培育。
【附圖說明】
[0017] 圖1為trkH基因的克隆與分析中進行的電泳圖，其中：圖IA為海洋微生物宏基 因組DNA，其中泳道M為λ -EcoTHDNA Marker，泳道1和泳道2為宏基因組DNA ;圖IB為 PCR擴增的trkH基因的部分片段電泳圖，其中泳道M為DNA marker DL 2000,泳道1為擴 增的trkH基因的部分片段；圖IC為錨定PCR擴增的trkH基因5'端片段連pMD18-T克隆 載體后PCR檢測電泳圖，其中泳道M為DNA marker DL 2000,泳道1-5為含有5'端序列的 質粒，泳道6為空白對照；圖ID為錨定PCR擴增的trkH基因3'端片段連pMD18-T克隆載 體后PC