括濃縮細胞出口和收獲細胞出口，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統可擇一與所述可監控細胞生物反應器的罐體、所述細胞截留裝置的濃縮細胞出口或所述細胞截留裝置的收獲細胞出口相連接，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統至少包括三種工作聯動方式:
[0023]第一種，當所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統與所述細胞截留裝置的濃縮細胞出口相連接時，其可將所述細胞截留裝置中濃縮的細胞通過細胞截留裝置上的排廢細胞口排出，以達到所述可監控細胞生物反應器內不同細胞比生長速率及不同細胞狀態的調控；
[0024]第二種，當所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統與所述可監控細胞生物反應器的罐體直接相連接時，其可將所述可監控細胞生物反應器內的細胞通過所述可監控細胞生物反應器上的排廢口排出，以達到所述可監控細胞生物反應器內不同細胞比生長速率及不同細胞狀態的調控；
[0025]第三種，當所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統與所述細胞截留裝置的收獲細胞出口相連接時，其可在所述細胞截留裝置的不同截留效率態時將不同濃度的細胞通過作為排廢細胞口的細胞截留裝置的收獲細胞出口排出，以達到所述可監控細胞生物反應器內不同細胞比生長速率及不同細胞狀態的調控。
[0026]在本發明的一優選實施例中，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統包括細胞分離回流單元和細胞排出單元及細胞狀態的調控系統，所述細胞分離回流單元位于所述細胞截留裝置上，其可通過流體無菌控速推動器控制細胞回流速度；所述細胞排出單元選擇性位于所述細胞截留裝置的濃縮細胞出口、收獲細胞出口或所述可監控細胞生物反應器的細胞排出口上；所述細胞狀態的調控系統將所述在線監控系統的設定值反饋至所述細胞排出單元的流體無菌控速推動器，控制細胞排出的速度與排出的細胞量，當排出的細胞量達到所述細胞狀態的調控系統給出的排出細胞量后，流體無菌控速推動器停止工作。
[0027]本發明還公開了一種在線工業魯棒化調節和控制細胞狀態生產重組凝血八因子的方法，該方法包含以下步驟:
[0028]I)對細胞培養系統進行滅菌，然后向細胞培養系統內通入無菌的PBS緩沖液或無菌培養液，循環清洗整個細胞培養系統；
[0029]2)向細胞培養裝置中接種細胞懸液，進行細胞的初級培養；
[0030]3)當細胞生長擴增到適合表達重組蛋白的細胞密度I?100X 16個細胞/ml和細胞活力70%以上時，根據培養細胞的生長特性、細胞培養裝置的工作體積和在線監控系統檢測的細胞培養裝置中理生化指標數據設定在線監控系統的各項參數，所述在線監控系統對灌注培養重組凝血八因子表達過程進行自動控制，將細胞培養裝置中的各項指標維持在設定的最佳理生化條件，并調節細胞狀態調節控制裝置及聯動系統的相應的流體無菌控速推動器，將細胞狀態調節控制為表達重組凝血八因子的最適宜細胞狀態，使整個系統達到穩態的指標，同時自動監控和記錄整個細胞培養和重組凝血八因子表達過程；
[0031]4)生產完成后，停止培養，產物回收純化。
[0032]其中優選，所述的步驟2)中，接種細胞懸液的接種密度為0.5?5 X 16個細胞/ml ο
[0033]優選地，所述的步驟2)中，所接種的細胞是用于生產重組凝血八因子的如下工程細胞之一:CH0、HEK293、BHK 或 Per C.6。
[0034]優選地，所述的步驟3)中，所述理生化指標數據包括細胞代謝、生長速率、產物合成平衡調控數據，該些數據通過在線監測葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酞胺、耗氧速率以及PH值指標獲得，同時監測細胞比生長速率和蛋白比生成速率。
[0035]優選地，所述的步驟3)中，檢測細胞培養裝置中的理生化指標數據的方法為:使細胞培養裝置中的培養液沒過理生化指標檢測器組進行檢測，并將理生化指標檢測器檢測和轉換后的信號數據返回給在線監控系統。
[0036]優選地，所述的步驟3)中，理生化指標檢測器組可以檢測的指標至少包括:溫度，PH值，溶氧，溶二氧化碳，葡萄糖，乳酸，細胞密度，氨指標、液位。
[0037]優選地，所述的步驟3)中，在線監控系統對灌注培養重組凝血八因子表達過程進行自動控制包括:在線監控系統接收理生化指標數據并處理，然后發出指令自動調節新鮮預處理培養液的添加速度和廢細胞排出速度，維持細胞培養環境的理生化指標為設定的最佳理生化條件，其中，新鮮預處理培養液的添加速度是細胞截留裝置上出液口的排出速度與排廢細胞口流速之和。
[0038]優選地，所述的步驟3)中，所述最佳理生化條件至少包括:培養液添加10%_20%的血清(v/v)，若使用無血清培養液，則不添加血清；培養液溫度34.5°C ±5.5°C，PH值7.0±2.0，溶氧 10% ?65%，溶二氧化碳 5%±8%。
[0039]優選地，所述的步驟3)中，在線監控系統調節控制的細胞狀態指標至少包括:細胞比生長速率，細胞周期分布，細胞周期平均停留時間。
[0040]優選地，所述的步驟3)中，達重組凝血八因子的最適宜細胞狀態至少包括:細胞周期G0/G1期細胞占30%?85%，S期細胞占15%?70%，G2/M期細胞占10%?30%且其總和為100%，細胞在G0/G1期平均停留時間2小時?80小時，S期平均停留時間4小時?40小時，G2/M期平均停留時間I小時?20小時。
[0041]優選地，所述的步驟3)中，所述整個系統的穩態的指標主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，細胞比生長速率的值保持基本穩定。
[0042]優選地，所述的步驟3)中，自動監控和記錄整個細胞培養和重組蛋白表達過程為:設定在線監控系統自動記錄每個指標探頭監測數據和設備運行參數，自動記錄的時間間隔為5?300秒，并存儲數據。
[0043]優選地，所述的步驟4)中，判斷生產完成的標準為:細胞活率下降，或細胞總數下降明顯，或蛋白表達明顯降低，可通過工藝放大前的預實驗結合整個系統的運行數據確定。
[0044]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:
[0045]本發明提供的一種既可在線、連續、監控細胞培養環境中多種理生化指標，又可以直接調節和控制細胞狀態(包括細胞周期等)的生物反應器類細胞培養裝置及由該裝置生產的方法，使重組凝血八因子生產過程降低染菌風險，維持細胞生長環境穩定，保持細胞恒定生長活力，達到高質、高效連續生產重組凝血八因子的目的。
【附圖說明】
[0046]圖1為細胞周期示意圖；
[0047]圖2為本發明實現可在線工業魯棒化(industrially robust)調節和控制細胞狀態生產重組凝血八因子的裝置的一種實施方式的示意圖；
[0048]圖3為本發明實例I的細胞的初級培養和次級培養過程細胞生長動力學圖；
[0049]圖4為本發明實例I的細胞的初級培養和次級培養過程細胞周期分布柱狀圖；
[0050]圖5為本發明實例I的次級培養過程重組凝血八因子表達圖；
[0051]圖6為本發明實例2轉染后培養過程重組凝血八因子表達圖。
【具體實施方式】
[0052]以上的描述大致說明了本發明的內容，下面的幾個具體實施例將會更直接的體現本發明的情況，但必須指出的是，在此舉出的實例僅僅是為了加以說明的目的，本發明并非局限于此，任何本領域的技術人員能思之的變化，都應落在本發明的保護范圍內。
[0053]以下實施例中用到的可在線調節和控制CHO或HEK293細胞狀態生產重組凝血八因子的裝置參見圖2，其主要包括:培養液儲存罐、可監控細胞生物反應器、產品收獲罐(對應圖中上清液收獲罐)、連接設置在可監控細胞生物反應器上的若干理生化指標檢測器、在線監控系統(對應圖中在線監控終端)、細胞狀態調節控制裝置及聯動系統(工作方式包括聯動方式一、聯動方式二和聯動方式三)、細胞截留裝置、若干流體無菌控速推動器和可控速管道體系，其中，所述培養液儲存罐通過所述可控速管道體系經所述流體無菌控速推動器與所述可監控細胞生物反應器連接，所述細胞截留裝置連接所述可監控細胞生物反應器，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統通過所述可控速管道體系經所述流體控速推動器選擇性與所述可監控細胞生物反應器或所述細胞截留裝置連接，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統通過所述可控速管道體系經所述流體無菌控速推動器連接所述產品收獲罐，所述可監控細胞生物反應器通過所述理生化指標檢測器連接所述在線監控系統，所述在線監控系統與所述流體無菌控速推動器連接并發送控速指令給所述流體無菌控速推動器，上述所有容器類裝置均通過可控速管道體系進行連接，其中，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統用于所述可監控細胞生物反應器內不同細胞比生長速率及不同細胞狀態的調控。需要說明的是本示意圖2的目的是幫助更好的理解本發明，而并非表明本發明的裝置與方法僅僅局限于此附圖所表現的形式。
[0054]其中，所述細胞截留裝置包括濃縮細胞出口和收獲細胞出口，所述細胞狀態調節控制裝置及