專利名稱：使用atp7a－調控劑治療神經變性疾病的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含ATP7A蛋白的APP-加工途徑的蛋白復合物，和這些復合物以及ATP7A的抑制劑在治療神經變性疾病中的應用。
阿爾茨海默氏病是一種慢性病，其在全世界影響數百萬人。
阿爾茨海默氏病患者的腦表現出顯著的神經病理性損害的特征病理學，例如最初細胞內的神經原纖維纏結(NFT)，和細胞外的富含淀粉狀蛋白的老年斑。這些損害伴有CNS神經元群的大量喪失，且它們的進展伴隨與AD有關的臨床癡呆。淀粉樣蛋白斑的主要組分是不同長度的淀粉樣蛋白β(A-β，Abeta或Aβ)肽。其一種變體——Aβ1-42-肽(Aβ-42)，是淀粉樣蛋白形成的主要成因劑。另一種變體是Aβ1-40-肽(Aβ-40)。淀粉樣蛋白β是前體蛋白——β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-APP或APP)的蛋白水解產物。APP是I型跨膜蛋白，其被幾種不同的膜相關蛋白酶依次剪切。APP的第一次剪切由2種蛋白酶α-分泌酶或β-分泌酶之一進行。α-分泌酶是一種金屬蛋白酶，其活性最可能是由蛋白ADAM-10和ADAM-17中的一種或其組合提供。α-分泌酶的剪切會妨礙淀粉樣蛋白肽的形成，因而稱作不產生淀粉樣蛋白性的。相反地，β-分泌酶對APP的剪切，是隨后形成淀粉樣蛋白肽的前提。該分泌酶也稱作BACE1(β-位點APP-剪切酶)，是含有天冬氨酰蛋白酶活性的I型跨膜蛋白(下面詳細描述)。
β-分泌酶(BACE)活性剪切APP的外功能區，導致分泌的可溶APPb的脫落，和99個殘基的C-末端跨膜片段(APP-C99)。Vassar等(Science 286，735-741)克隆了跨膜天冬氨酸蛋白酶，其具有APP的假定的β-分泌酶的特征，他們將其稱作BACE1。來自BACE1敲除的小鼠的腦和原代皮層培養物沒有表現出可檢測的β-分泌酶活性，而來自BACE敲除的小鼠的原代皮層培養物產生少得多的來自APP的淀粉樣蛋白-β。這表明，BACE1，而不是它的平行進化同源物BACE2，是APP的主要β-分泌酶。BACE1是501個氨基酸(aa)的蛋白，其含有21個aa的信號肽，隨后是跨越aa 22-45的原序列域。存在可選擇地剪切的形式，BACE-I-457和BACE-I-476。成熟蛋白的胞外域后是一個預測的跨膜域和24個aa的短胞質C-末端尾。預測BACE1是1型跨膜蛋白，其活性位點在膜的胞外側，β-分泌酶在那里剪切APP和可能的其它尚未鑒定的底物。盡管BACE1顯然是將APP加工成A-β所需的關鍵酶，近期的證據暗示BACE1的另外的潛在底物和功能(J.Biol.Chem.279，10542-10550)。迄今為止，尚未描述具有調節或調控功能的BACE1相互作用蛋白。
BACE1剪切產生的APP片段，APP-C99，是γ-分泌酶活性的底物，該酶能將膜平面內的APP-C99剪切成A-β肽(例如生成淀粉樣蛋白性的Aβ1-42肽)，和稱作APP胞內域(AICD)的C-末端片段(Annu RevCell Dev Biol 19，25-51)。γ-分泌酶活性存在于具有至少4個不同的亞基的多蛋白復合物中。發現的第一個亞基是早老素(Proc NatlAcad Sci USA 94，8208-13)。γ-分泌酶復合物的其它已知的蛋白組分是Pen-2，Nicastrin和Aph-1a。
盡管在闡述作為阿爾茨海默氏病的病因學基礎的分子事件方面的最近進展，到目前為止還沒有開發出病性改善療法。為此，業界已經努力鑒別合適的用于抑制BACE1的先導化合物。此外，已經認識到，存在增多數目的γ-分泌酶的替代底物，最顯著的是Notch蛋白。結果，對γ-分泌酶的抑制可能會造成基于機理的副作用。現有的頂級藥物(例如Aricept/多奈哌齊)嘗試通過抑制乙酰膽堿酯酶，這會導致腦中神經遞質乙酰膽堿水平的增加，達到認知功能的暫時改善。這些療法不適用于疾病的晚期階段，它們不能治療潛在的疾病病理狀況，且它們不能停止疾病進展。
因而，存在未滿足的需要，即鑒別允許新的治療阿爾茨海默氏病的分子策略的新靶物。另外，強烈需要新的治療化合物，其能通過靶向所述的新靶物，修飾改變前述的分子過程。
在第一個方面，本發明提供了“ATP7A相互作用分子”在制備用于治療神經變性疾病的藥物組合物中的應用。
在本發明的上下文中，已經意外地發現，銅轉運ATP酶(以后稱作ATP7A)形成不同的胞內蛋白復合物的一部分，所述復合物參與阿爾茨海默氏病中γ-分泌酶對APP的異常加工。特別地，已經發現ATP7A是Psen2復合物和BACE1-復合物的一部分，已知這些復合物能直接或間接調節γ-分泌酶的活性。這些復合物按照它們各自的關鍵蛋白化合物命名。
將ATP7A鑒別為這些復合物中的關鍵分子，使得能使用與ATP7A相互作用的分子治療神經變性疾病。這特別地在下面的實施例中顯示，其中證實了針對ATP7A的siRNA導致Aβ-42的產生和/或分泌的減弱。
在本發明的上下文中，“ATP7A相互作用分子”是至少暫時結合ATP7A的分子，且其優選地調控和特別是抑制ATP7A活性。
ATP7A是一種普遍(肝除外)表達的P-型銅轉運ATP酶，其含有8個跨膜片段和6個N-末端金屬結合域(Chelly等，1993；Mercer等，1993；Vulpe等，1993)。銅泵介導銅攝取進入胞內囊泡隔室中，和當在質膜時介導細胞銅外流。在體外，ATP7A位于遠側高爾基體，并響應外源銅離子而轉移到質膜和Rab7-陽性內體。該轉移事件是獨立于網格蛋白和小窩蛋白的，但是受Rac家族小GTP酶的調節(Cobbold等，2002，2003；Pascale等，2003)。近來已經提出，參與膽固醇分選的Rab7-陽性的囊泡細胞器可能代表著γ-分泌酶活性的重要部位(Runz等，2002)。
需要銅轉運蛋白來激活含銅的酶，例如賴氨酰氧化酶，酪氨酸酶，細胞色素C氧化酶和Cu/Zn超氧化物歧化酶(Petris等，2000)。ATP7A的缺陷與人的門克斯病(MD)和后角綜合征(OHS)有關，且在作為人MD模型的“花斑”小鼠中發現。門克斯病是一種X-連鎖隱性疾病，其特征在于漸進的神經變性和結締組織紊亂局灶性大腦和小腦變性，早期生長延遲，特殊的毛發，色素減退，皮膚松弛癥，血管并發癥和幼童時期的死亡。這是由于銅的吸收和轉運的缺陷(Voskoboinik等，2003)。此外，銅外流轉運蛋白ATP7A的增加表達在卵巢癌細胞中介導對順鉑、卡鉑和奧沙利鉑的抗性(Samimi等，2004)，且與卵巢癌患者的較差存活率聯系在一起(Samimi等，2003)。
APP是一種銅-結合蛋白，其可發揮控制銅體內穩態的作用(Multhaup等，1996)。反過來，APP表達自身又受細胞銅的調節該金屬在成纖維細胞中的耗盡(通過過表達ATP7A)，會顯著降低APP蛋白水平和下調APP基因表達，表明ATP7A在控制APP表達中的作用(Bellingham等，2004)。但是，尚未證實ATP7A對APP的蛋白水解加工的作用。
氯碘羥喹(一種Zn-和Cu-螯合劑)已經在阿爾茨海默氏病的試驗性2期臨床試驗中顯示出了有希望的結果(Ritschie等，2003)。已經假設，氯碘羥喹能阻止Zn和Cu結合APP，從而阻止Aβ聚合并且還解聚淀粉樣蛋白斑。但是，近期的研究提出，氯碘羥喹能介導銅攝入和對抗APP的Cu外流活性(Treiber等，2004)。然而，迄今為止尚未證實銅螯合劑對APP加工的直接作用。
根據本發明，表述“ATP7A”不僅僅指如圖2所示的蛋白，而且還指其功能活性衍生物，或其功能活性片段，或其同源物，或由在低嚴格性條件下與編碼所述蛋白的核酸雜交的核酸編碼的變體。優選地，這些低嚴格性條件包括，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％BSA，100ug/ml變性鮭精DNA，和10％(重量/體積)硫酸葡聚糖的緩沖液中，在40℃雜交18-20小時，在由2X SSC，25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS組成的緩沖液中，在55℃洗滌1-5小時，和在由2X SSC，25mMTris-HCl(pH 7.4)5mM EDTA，和0.1％SDS組成的緩沖液中，在60℃洗滌1.5小時。
這也同樣適用于本發明中提及的所有其它蛋白。因此，給定蛋白或核酸的名稱不僅僅指序列表中指出的該蛋白或核酸，而且還指它的功能活性衍生物，或其功能活性片段，或其同源物，或由在低嚴格性條件下，優選地在如上所述的條件下，與編碼所述蛋白的核酸雜交的核酸編碼的變體。
為了定量檢測細胞或生物中的ATP7A活性，可以利用多種方法a)通過酵母中的功能互補測定在Ccc2p功能受損的釀酒酵母菌株中，亞鐵氧化酶Fet3p是功能障礙的，導致鐵-缺乏表型。人銅轉運ATP酶例如ATP7B(His等，2004)或ATP7A的表達，能彌補該表型。結果，通過測量鐵-缺乏表型的功能互補的程度，即通過定量酵母細胞在鐵-限制的培養基中生長的能力，可以定量ATP7A的活性。
b)通過檢測表達人ATP7A的ccc2p-缺陷型酵母中的亞鐵氧化酶活性除了上述的表型方法外，也可以在ccc2p-缺陷型酵母菌株中測量亞鐵氧化酶活性，作為銅轉運功能的更敏感的指標(Hsi等，2004)，以定量ATP7A活性。
c)通過測量ATP7A的ATP酶活性通過一種測定，在其中測量作為丙酮酸激酶或乳酸脫氫酶的ATP-依賴性酶的反應效率，或通過比色測定，在其中測量在固定的時間間隔的磷酸釋放(Hou等，2001，其在本文引作參考)，可以在37℃檢測ATP7A(例如，通過純化TAP-ATP7A得到)的金屬離子-依賴性的ATP酶活性。許多這樣的測定詳細公開在公眾領域，因此是本領域的技術人員眾所周知的。
d)測量對銅-誘導的毒性的敏感性通過測量細胞銅外流，或通過定量細胞對銅而不是對其它金屬的敏感性，也可以確定ATP7A的活性(Hou等，2001)。
e)64Cu蓄積的穩態測量通過測量胞內銅(優選64Cu)蓄積(Bellingham等，2004)，也可以確定ATP7A的活性。
在實施例3中，更詳細地討論了用于測量ATP7A活性的上述功能測定。
在其它蛋白的情況下，如本文使用的術語“功能活性的”指多肽，即片段或衍生物，其具有根據該多肽即片段或衍生物所涉及的實施方案的蛋白的結構的、調節的、或生化的功能。
根據本發明，如本文使用的術語“活性”指最廣義的分子功能。它通常包括但不限于，分子的生物的、生化的、物理的或化學的功能。它包括例如酶活性，與其它分子相互作用的能力和活化、促進、穩定、抑制、阻遏或去穩定其它分子的功能的能力，穩定性，定位到某些亞細胞位置的能力。在適用時，所述術語也涉及最廣義的蛋白復合物的功能。
根據本發明，如本文使用的術語“組分蛋白的衍生物”或“類似物”或“變體”優選地包括，但不限于，包含與組分蛋白基本上同源的區域的分子，在不同的實施方案中，相同大小的氨基酸序列，或當與比對序列相對比時(其中通過本領域已知的計算機同源性程序進行比對)，具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％同一性；或其編碼核酸能在嚴格的、中等嚴格的或非嚴格的條件下與編碼組分蛋白的序列雜交。它指蛋白，其是分別通過氨基酸置換、刪除和添加而修飾天然存在的蛋白的結果，該衍生物仍然能表現出天然存在的蛋白的生物功能，盡管不一定是相同的程度。通過例如如本發明中提供的合適的可利用的體外測定，可以檢查這樣的蛋白的生物功能。
如本文使用的術語“片段”指根據實施方案的組分蛋白的至少10，20，30，40或50個氨基酸的多肽。在具體的實施方案中，這樣的片段不超過35，100或200個氨基酸。
如本文使用的術語“基因”指核酸，其包含編碼本發明的(如果沒有另作說明)多肽的開放讀碼框，包括外顯子和任選存在的內含子序列。
如本文使用的術語″同源物″或“同源基因產物”指另一個物種、優選哺乳動物中的蛋白，其能執行與本文進一步描述的復合物的蛋白組分相同的生物功能。這樣的同源物也稱作″正向同源基因產物″。用于檢測來自人和哺乳動物或其它物種的正向同源基因對的算法，使用這些生物的整個基因組。首先，使用預測蛋白的完全Smith-Waterman比對，尋找最佳配對樣。為了進一步提高可靠性，將這些對與包含果蠅和美麗線蟲蛋白的最佳配對樣串在一起。這樣的分析記載在例如Nature，2001，409860-921。基于編碼本文提供的蛋白的基因和其它物種的基因的序列同源性，通過采用常規技術克隆各基因，并從這樣的基因表達蛋白，或根據本文提供的方法或本領域普遍知道的其它合適的方法，通過分離類似的復合物分離其它物種的蛋白，可以分離根據本發明的蛋白的同源物。
在本發明的一個優選的實施方案中，“ATP7A-相互作用分子”是ATP7A-抑制劑。
根據本發明，術語“抑制劑”指生化的或化學的化合物，其優選地能抑制或減少ATP7A的活性。這可以通過例如阻遏對應的基因的表達來實現。通過RT-PCR或蛋白印跡分析，可以測量基因的表達。此外，這可以通過對活性的抑制來實現，例如通過結合ATP7A。
這樣的ATP7A-抑制劑的實例是針對ATP7A尤其是針對ATP7A的活性部位的結合蛋白或結合肽，和針對ATP7A基因的核酸。
術語“針對ATP7A的核酸”指雙鏈或單鏈DNA或RNA，或其修飾或衍生物，例如，其能抑制ATP7A基因的表達或ATP7A的活性，且包括但不限于反義核酸，適體，siRNA(小干擾RNA)和核酶。
優選地，抑制劑選自抗體，反義寡核苷酸，siRNA，低分子量分子(LMW)，結合肽，適體，核酶和肽模擬物。
所謂的“低分子量分子”(以后稱作“LMW”)是非蛋白、肽、抗體或核酸的分子，其表現出小于5000Da、優選地小于2000Da、更優選地小于1000Da、最優選地小于500Da的分子量。可以通過高通量方法從文庫開始鑒別出這樣的LMW。這樣的方法是本領域已知的，且在下面詳細討論。
可以將這些核酸直接施用給細胞，或可以通過外源的導入序列的轉錄，在細胞內生產。
如本文使用的″反義″核酸指，由于一些序列互補性，能與組分蛋白RNA(優選地mRNA)的序列-特異性部分雜交的核酸。反義核酸可以與組分蛋白mRNA的編碼和/或非編碼區互補。這樣的能抑制復合物形成或活性的反義核酸，可以用作治療劑，且可以用于治療或預防本文所述的疾病。
反義核酸是至少6個核苷酸，且優選地是具有6-約200個核苷酸的寡核苷酸。在特定的方面，寡核苷酸是至少10個核苷酸，至少15個核苷酸，至少100個核苷酸，或至少200個核苷酸。
可以化學合成核酸，例如反義核酸或siRNA，例如根據磷酸三酯法(見，例如，Uhlmann，E.& Peyman，A.(1990)ChemicalReviews，90，543-584)。適體是能高親和力地結合多肽(這里是ATP7A)的核酸。通過選擇方法例如SELEX(見例如Jayasena(1999)Clin.Chem.，45，1628-50；Klug和Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.，20，97-107；US 5,582,981)，可以從大量不同的單鏈RNA分子中分離出適體。也可以合成適體，并選擇它們的鏡像形式，例如作為L-核糖核苷酸(Nolte等(1996)Nat.Biotechnol.，14，1116-9；Klussmann等(1996)Na t.Biotechnol.，14，1112-5)。已經按照該方式分離的形式具有下述優點，即它們不會被天然存在的核糖核酸酶降解，且因此具有更大的穩定性。
核酸可以被核酸內切酶或核酸外切酶降解，尤其是被可在細胞中發現的DNA酶和RNA酶降解。因此，為了穩定它們免受降解，從而確保在細胞中長時間維持高濃度的核酸，修飾核酸是有利的(Beigelman等(1995)Nucleic Acids Res.233989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)。典型地，通過導入一個或多個核苷酸間磷基或通過導入一個或多個非-磷的間核苷酸(internucleotide)，可以得到這樣的穩定作用。
合適的修飾的間核苷酸記載在Uhlmann和Peyman(1990)，同上(也見Beigelman等(1995)Nucleic Acids Res.233989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)。可以在根據本發明的應用之一中使用的核酸中的修飾的核苷酸間磷酸基團和/或非-磷橋含有，例如，甲基膦酸酯，磷硫酰，氨基磷酸酯，二硫代磷酸酯和/或磷酸酯，而非-磷間核苷酸類似物含有，例如，硅氧烷橋，碳酸酯橋，羧甲基酯，acetamidate橋和/或硫醚橋。還意圖該修飾應當能提高可以在根據本發明的應用之一中使用的藥物組合物的耐久性。通常，可以在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈上修飾寡核苷酸。
寡核苷酸可以包含其它的附加基團例如肽，能促進跨細胞膜(見，例如，Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；國際專利公開號WO 88/09810)或血-腦屏障(見，例如，國際專利公開號WO 89/10134)轉運的試劑，雜交-觸發的剪切試劑(見，例如，Krol等，1988，BioTechniques 6958-976)，或嵌入劑(見，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。
具體而言，反義寡核苷酸可以包含至少一個修飾的堿基部分，其選自包括但不限于以下的組5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羥基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶核甙，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，D-半乳糖基queosine，肌苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，D-mannosylqueosine，5N-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基-硫代-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧醋酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧醋酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧醋酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。
在另一個實施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的糖部分，其選自包括但不限于以下的組阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。
合適的反義核酸的應用，還記載在例如Zheng和Kemeny(1995)Clin.Exp.Immunol.，100，380-2；Nellen和Lichtenstein(1993)Trends Biochem.Sci.，18，419-23，Stein(1992)Leukemia，6，697-74或Yacyshyn，B.R.等(1998)Gastroenterology，114，1142)。
在另一個實施方案中，寡核苷酸是2-a-異頭寡核苷酸。a-異頭寡核苷酸(2-a-異頭的或a-異頭的)與互補的RNA形成特異性雙鏈雜交體，其中與常見的β-單位不同，鏈彼此平行地排列(Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.156625-6641)。
寡核苷酸可以綴合到另一個分子上，例如，肽，雜交-觸發的交聯劑，轉運劑，雜交-觸發的剪切劑，等。
在本發明中，通過本領域已知的標準方法，例如，通過使用自動化的DNA合成儀(例如商業上購自Biosearch，Applied Biosystems，etc.)，可以合成本發明的寡核苷酸。作為實例，通過Stein等(1988，Nucl.Acids Res.163209)的方法，可以合成磷硫酰寡核苷酸，通過使用可控多孔玻璃聚合物支持物(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857448-7451)等，可以制備出甲基膦酸酯寡核苷酸。
在一個具體的實施方案中，反義寡核苷酸包含催化性RNA，或核酶(見，例如，國際專利公開號WO 90/11364；Sarver等，1990，Science2471222-1225)。在另一個實施方案中，寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.156131-6148)，或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215327-330)。
在一個替代實施方案中，通過外源序列的轉錄，細胞內地生產本發明的反義核酸。例如，可以在體內導入載體，以便它被細胞攝入，該載體或其一部分在該細胞中轉錄，生成本發明的反義核酸(RNA)。這樣的載體將含有編碼組分蛋白的序列。這樣的載體可以保持為附加體，或變成染色體整合的，只要它可以被轉錄，生成需要的反義RNA。通過本領域標準的重組DNA技術方法，可以構建這樣的載體。載體可以是質粒，病毒載體，或本領域已知能在哺乳動物細胞中復制和表達的其它載體。編碼反義RNA的序列的表達，可以通過本領域已知能在哺乳動物、優選人細胞中起作用的任何啟動子。這樣的啟動子可以是誘導型或組成型的。這樣的啟動子包括，但不限于，SV40早期啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)，包含在勞斯肉瘤病毒的3’長末端重復中的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell22787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781441-1445)，金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，1982，Nature 29639-42)等。
本發明的反義核酸包含與組分蛋白基因、優選人基因的RNA轉錄物的至少一部分互補的序列。但是，不要求絕對的互補性，盡管這是優選的。如本文提及的，“與RNA的至少一部分互補的”序列指，具有足夠的互補性能與RNA雜交、形成穩定的雙鏈體的序列；在雙鏈反義核酸的情況下，因而可以測試雙鏈體DNA的一條鏈，或可以測定三鏈體形成。雜交能力依賴于互補性的程度和反義核酸的長度。通常，雜交核酸越長，可以含有越多的與組分蛋白RNA的堿基錯配而仍然形成穩定的雙鏈體(或三鏈體，依具體情況而定)。使用確定雜交的復合體的解鏈溫度的標準方法，本領域的技術人員可以確定可容忍的錯配度。
作為在下調或關閉基因表達(這里指ATP7A基因表達)的過程中RNA干擾的工具的siRNA的生產和應用，記載在例如Elbashir，S.M.等(2001)Genes Dev.，15，188或Elbashir，S.M.等(2001)Nature，411，494。優選地，siRNA具有小于30個核苷酸的長度，其中siRNA的有義鏈的同一性片段優選地是至少19個核苷酸。
核酶也是合適的抑制核酸(這里是ATP7A基因)的翻譯的工具，因為它們能特異性地結合和切割mRNA。它們記載在例如Amarzguioui等(1998)Cell.Mol.Life Sci.，54，1175-202；Vaish等(1998)Nucleic Acids Res.，26，5237-42；Persidis(1997)Nat.Biotechnol.，15，921-2或Couture和Stinchcomb(1996)TrendsGenet.，12，510-5。
可以給患者施用本發明的藥物組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的有效量的核酸，所述患者患有疾病或障礙，所述疾病或障礙屬于表達或過表達本發明的蛋白復合物的類型。
將有效地治療特定障礙或狀況的核酸的量，依賴于該障礙或狀況的性質，且可以通過標準的臨床技術來確定。當可能時，需要體外檢測核酸細胞毒性，然后在可用的動物模型系統中，再在人中測試和使用。
在一個具體的實施方案中，通過脂質體、微粒、或微膠囊，施用包含核酸的藥物組合物。在本發明的不同實施方案中，可以有用地使用這樣的組合物實現核酸的持續釋放。在一個具體的實施方案中，可能需要使用脂質體，其通過抗體靶向特定可識別的中樞神經系統細胞類型(Leonetti等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872448-2451；Renneisen等，1990，J.Biol.Chem.26516337-16342)。
術語“結合蛋白”或“結合肽”指一類蛋白或肽，其能結合和抑制ATP7A，包括但不限于，針對ATP7A的多克隆或單克隆抗體、抗體片段和蛋白支架。
根據本發明，術語抗體或抗體片段也應當理解為指抗體或其抗原-結合部分，其已經被重組地制備，當適當時被修飾，例如嵌合抗體，人源化的抗體，多功能抗體，雙特異性的或寡特異性的抗體，單鏈抗體和F(ab)或F(ab)2片段(見，例如，EP-B1-0 368 684，US 4,816,567，US 4,816,397，WO 88/01649，WO 93/06213或WO 98/24884)，優選地在FAB表達文庫的輔助下生產。
作為經典抗體的替代物，也可能例如使用針對ATP7A的蛋白支架，例如anticalin，其基于lipocalin(Beste等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1898-1903)。可以改變lipocalin(例如視黃醇-結合蛋白或后膽色素-結合蛋白)的天然配體-結合位點，例如通過“組合蛋白設計”方案，以這樣的方式使它們結合選定的半抗原，這里指ATP7A(Skerra，2000，Biochim.Biophys.Acta，1482，337-50)。其它已知的蛋白支架是已知用于分子識別的抗體替代物(Skerra(2000)J.Mol.Recognit.，13，167-187)。
根據熟練的技術人員眾所周知的方法，例如通過用ATP7A免疫哺乳動物例如兔子，當適當時在例如弗氏佐劑和/或氫氧化鋁凝膠存在下，可以實現制備抗體或抗體片段的操作(見，例如，Diamond，B.A.等(1981)The New England Journal of Medicine1344-1349)。隨后，可以使用眾所周知的方法，從血液中分離多克隆抗體，其作為免疫反應的結果在動物中形成，并例如通過柱色譜純化。例如根據已知的Winter & Milstein的方法(Winter，G.& Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)，可以制備單克隆抗體。
更具體地，通過使用作為免疫原的多肽免疫合適的對象，可以如上所述制備多克隆抗體。優選的多克隆抗體組合物是，已經選擇針對本發明的一種或多種多肽的抗體的那些。特別優選的多克隆抗體制品是，僅僅含有針對給定的一種或多種多肽的抗體的那些。特別優選的免疫原組合物是，不含有其它人蛋白的那些，例如，使用非-人宿主細胞重組表達本發明的多肽制備的免疫原組合物。以這樣的方式，由得到的針對該免疫原的抗體組合物識別的唯一人表位，會作為本發明的一種或多種多肽的一部分存在。
通過標準的技術，例如用使用固定化的多肽的酶聯免疫吸附測定(ELISA)，可以隨時間監測經免疫的對象中的抗體滴度。如果需要，可以從哺乳動物(例如，從血液)分離抗體分子，并進一步通過眾所周知的技術例如蛋白A色譜進行純化，得到IgG級分。或者，通過例如親和色譜，可以選擇(例如，部分地純化)或純化對本發明的蛋白或多肽特異性的抗體。例如，如本文所述生產重組地表達和純化(或部分地純化)的本發明的蛋白，且共價地或非-共價地偶聯到固體支持物例如色譜柱上。然后，可以用該柱，從含有針對大量不同表位的抗體的樣品中，親和純化對本發明的蛋白特異性的抗體，從而產生基本上純化的抗體組合物，即基本上不含有污染抗體的抗體組合物。在該上下文中，基本上純化的抗體組合物指，抗體樣品至多含有僅僅30％(按干重計)污染抗體，其針對本發明目的蛋白或多肽上的表位以外的表位，優選地樣品中至多20％，更優選地至多10％，最優選地至多5％(按干重計)是污染抗體。純化的抗體組合物指，組合物中的至少99％抗體針對本發明的目的蛋白或多肽。
在免疫后適當的時間，例如，當特異性抗體滴度最高時，可以從對象得到產生抗體的細胞，并通過標準的技術，例如Kohler和Milstein，1975，Nature 256495-497最初描述的雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，Immunol.Today 472)，EBV-雜交瘤技術(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁)或三源雜交瘤技術，用于制備單克隆抗體。生產雜交瘤的技術是眾所周知的(通常見CurrentProtocols in Immunology 1994，Coligan等(編)John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。通過篩選雜交瘤培養物上清液中能結合目標多肽的抗體，例如，使用標準的ELISA測定，可以檢測能生產本發明的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的替代方案，通過用目標多肽篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)，可以鑒別和分離針對本發明的多肽的單克隆抗體。用于產生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可以在市場上得到(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。另外，特別適用于產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可見于例如美國專利號5,223,409；PCT公開號WO92/18619；PCT公開號WO 91/17271；PCT公開號WO 92/20791；PCT公開號WO 92/15679；PCT公開號WO 93/01288；PCT公開號WO 92/01047；PCT公開號WO 92/09690；PCT公開號WO 90/02809；Fuchs等，1991，Bio/Technology 91370-1372；Hay等，1992，Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse等，1989，Science 2461275-1281；Griffiths等，1993，EMBO J.12725-734。
另外，重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，其包含人和非-人部分，可以使用標準的重組DNA技術生產，它們在本發明的范圍內。嵌合抗體是一種分子，其中不同的部分源自不同的動物物種，例如具有源自鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恒定區的那些(見，例如，Cabilly等，美國專利號4,816,567；和Boss等，美國專利號4,816,397，它們都在本文中整體引作參考)。人源化抗體是來自非-人物種的抗體分子，其具有一個或多個來自非-人物種的互補決定區(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區(見，例如，Queen，美國專利號5,585,089，其在本文中整體引作參考)。通過本領域已知的重組DNA技術，例如使用PCT公開號WO 87/02671；歐洲專利申請184,187；歐洲專利申請171,496；歐洲專利申請173,494；PCT公開號WO86/01533；美國專利號4,816,567；歐洲專利申請125,023；Better等，1988，Science 2401041-1043；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等，1985，Nature314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559)；Morrison，1985，Science 2291202-1207；Oi等，1986，Bio/Techniques 4214；美國專利5,225,539；Jones等，1986，Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988，Science 2391534；和Beidler等，1988，J.Immunol.1414053-4060所述的方法，可以生產這樣的嵌合和人源化單克隆抗體。
治療性處理人患者，特別需要完全人的抗體。可以生產這樣的抗體，例如，使用轉基因小鼠，其不能表達內源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但是其可以表達人重鏈和輕鏈基因。用選擇的抗原，例如，本發明的多肽的全部或一部分，以正常的方式免疫該轉基因小鼠。使用常規的雜交瘤技術，可以得到針對抗原的單克隆抗體。在B細胞分化過程中，轉基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉基因進行重排，并隨后經歷類轉換和體細胞突變。因而，使用這樣的技術，可能生產治療上有用的IgG，IgA和IgE抗體。關于生產人抗體的該技術的概述，見Lonberg和Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.1365-93)。關于生產人抗體和人單克隆抗體的該技術和生產這樣的抗體的方案的詳細討論，見，例如，美國專利5,625,126；美國專利5,633,425；美國專利5,569,825；美國專利5,661,016；和美國專利5,545,806。另外，Abgenix，Inc.(Freemont，CA)等公司可從事使用類似于上述的技術提供針對選擇的抗原的人抗體。
使用稱作“引導選擇”的技術，可以產生能識別選擇的表位的完全人抗體。在該方案中，使用選擇的非-人單克隆抗體，例如鼠抗體，引導選擇能識別該表位的完全人抗體(Jespers等，1994，Bio/technology 12899-903)。
通過本領域已知的技術，可以產生含有復合物的獨特型的抗體片段。例如，這樣的片段包括，但不限于，F(ab′)2片段，其可以通過對抗體分子的胃蛋白酶消化來生產；Fab′片段，其可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵來產生；Fab片段，其可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子來產生；和Fv片段。
在抗體的生產中，通過本領域已知的技術，例如，ELISA(酶聯免疫吸附測定)，可以篩選需要的抗體。為了選擇對復合物的特定結構域或其衍生物特異性的抗體，可以測定產生的雜交瘤中能結合含有這樣的結構域的復合物片段或其衍生物的產物。為了選擇能特異性地結合本發明的復合物或其衍生物或同源物、但是不特異性地結合復合物的各蛋白或其衍生物或同源物的抗體，可以在與復合物陽性結合和缺乏與各蛋白組分結合的基礎上選擇。
在與給定的一種或多種蛋白的定位和/或定量有關的領域已知的方法中，例如，用于將這些蛋白成像，測量其在適當的生理學樣品中的水平(通過免疫測定)，在診斷方法中等，可以使用前述抗體。這也適用于復合物的衍生物或其同源物。
在一個優選的實施方案中，ATP7A-抑制劑是具有下述序列的任一種siRNAAAAGCAGATTGAAGCTATGGG(A)或AACACAGAGGGATCCTATACT(B)如上所述，ATP7A是參與調節γ分泌酶活性和/或β分泌酶活性的蛋白復合物的一部分。因此，在一個優選的實施方案，ATP7A相互作用分子或抑制劑作用于ATP7A分子，后者是蛋白復合物(優選Psen2蛋白復合物或BACE1-復合物)的一部分。
已經將所述的蛋白復合物鑒別為與可供選擇的γ-分泌酶亞基Psen2和與β-分泌酶蛋白相互作用的蛋白的裝配體。
如上所述，在本發明的上下文中已經意外地發現，ATP7A是調節APP的蛋白水解加工(尤其是通過β-分泌酶和/或γ-分泌酶活性)的蛋白復合物的一部分。因此，在一個優選的實施方案，抑制劑或相互作用分子能調控γ分泌酶和/或β-分泌酶的活性。
在本發明中，術語“調控γ分泌酶和/或β-分泌酶的活性”包括，直接或間接調控酶的活性。這意味著，ATP7A調控劑也可以直接結合到這些酶中的任一種，或者更優選地，可以對ATP7A施加影響，這又通過例如蛋白-蛋白相互作用或通過信號轉導或通過小代謝物，調控這些酶中的任一種的活性。
在本發明中，β分泌酶調控劑優選地能完全或部分地抑制β分泌酶的活性。在本發明中，ATP7A調控劑的最優選的功能后果是減少Aβ-42產生。
在本發明的上下文中，“調控γ分泌酶和/或β-分泌酶的活性”指活性減少，所以形成較少的產物或不形成產物，最優選地形成較少的Aβ-42或不形成(部分或完全抑制)，或各酶產生不同的產物(在γ-分泌酶的情況下，例如Aβ-38或更短氨基酸序列的其它Aβ肽種類-而不是Aβ-42)，或產物的相對量是不同的(在γ-分泌酶的情況下，例如改變、優選地增加Aβ-40/Aβ-42的比例)。此外包括，調控劑能調控γ分泌酶或β-分泌酶或2種酶的活性。
關于γ分泌酶活性的調控劑，優選地，該調控劑能抑制γ分泌酶活性。但是，也優選地，以不改變Aβ肽種類的總量、但是產生更多的Aβ-38來替代Aβ-42的方式，轉變γ分泌酶的活性。
例如通過檢測APP加工，例如通過檢測產生的Aβ肽種類的水平，最重要地Aβ-42的水平(見下面的實施例部分)，可以測量γ分泌酶活性。
早老素1和2(Psen1和Psen2，分別也稱作PS1和PS2)是整合膜蛋白，其位于內質網、高爾基體，也位于細胞表面(Kovacs，Nat Med 2.224)。它們主要作為NTF和CTF內切蛋白酶解片段的異二聚體存在。不知道能剪切早老素的蛋白酶(“早老素酶”)，該過程可能是自身催化的，也不清楚PS(自身)蛋白水解的功能意義。早老素參與淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)(De Strooper等，Nature 391，387)和Notch受體(De Strooper等，Nature 398，518)的蛋白水解加工。另外，早老素與細胞粘附蛋白α和β-連環蛋白、N-鈣粘蛋白和E-鈣粘蛋白(Georgakopoulos等，Mol Cell 4，893)和犰狳家族的其它成員(Yu等，J Biol Chem 273，16470)有關。早老素對APP的加工，是通過它們對剪切APP的γ-分泌酶的作用，產生A-β肽的C-末端。PS1與APP的C83和C99加工的C-末端片段(Xia等，Proc Natl Acad Sci USA，94，8208)，Nicastrin(Yu等，Nature 407，48)和Pen-2(Francis等，Dev Cell 3，85)有關。早老素加工中需要Aph-1(Francis等，Dev Cell 3，85)。不清楚早老素是否直接調節γ-分泌酶活性，或它們自身是否是蛋白酶(Kopan和Gouate，Genes Dev 14，2799)。γ分泌酶活性可以包含這些蛋白的多聚體復合物(Yu等，Nature 407，48)，但是不知道這些蛋白之間的關系如何影響分泌酶活性。
β-分泌酶(BACE)活性剪切APP外功能區，導致分泌的可溶APPb的脫落，和99個殘基的C-末端跨膜片段(APP-C99)。Vassar等(Science 286，735-741)克隆了跨膜天冬氨酸蛋白酶，其具有APP的假定的β-分泌酶的特征，被他們稱作BACE1。來自BACE1敲除的小鼠的腦和原代皮層培養物沒有顯示出可檢測的β-分泌酶活性，且來自BACE敲除的小鼠的原代皮層培養物從APP產生少得多的淀粉樣蛋白-β。這表明，BACE1，而不是它的平行進化同源物BACE2，是APP的主要β-分泌酶。BACE1是501個氨基酸的蛋白，其含有21個aa的信號肽，隨后是跨aa 22到45的前蛋白結構域。存在可替代地剪接的形式，BACE-I-457和BACE-I-476。成熟蛋白的腔域后是一個預測的跨膜域和24個aa的短胞質C-末端尾。預測BACE1是1型跨膜蛋白，其在膜的腔側具有活性部位，β-分泌酶在這里剪切APP和可能的其它尚未鑒定的底物。盡管BACE1顯然是將APP加工成A-β所需的關鍵酶，近期的證據暗示BACE1的其它的潛在底物和功能(J.Biol.Chem.279，10542-10550)。迄今為止，尚未描述具有調節或調控功能的BACE1相互作用蛋白。
這些蛋白相互作用物的闡述，能提供新的治療介入點。
如上所述，在本發明的上下文中，已經意外地發現，ATP7A是調節β-分泌酶和/或γ分泌酶活性的蛋白復合物的一部分。因此，在一個優選的實施方案中，抑制劑或相互作用分子能調控β-分泌酶和/或γ分泌酶的活性。
在本發明的上下文中，“調控γ分泌酶和/或β分泌酶的活性”指，降低活性，形成更少的產物或無產物(部分或完全抑制)，或各酶產生不同的產物(在γ分泌酶的情況下，例如Aβ-40，而不是Aβ-42)，或產物的相對量是不同的(在γ分泌酶的情況下，例如比Aβ-42更多的Aβ-40)。此外包括調控劑調控γ分泌酶或β分泌酶或2種酶的活性。
在本發明中，優選地，β分泌酶調控劑能完全地或部分地抑制β分泌酶活性。
關于γ分泌酶活性的調控劑，優選地，該調控劑會抑制γ分泌酶活性。但是，也優選地，以能產生更多的Aβ-40代替Aβ-42的方式，轉變γ分泌酶的活性。
例如通過檢測APP加工，例如通過檢測生成了Aβ-40還是Aβ-42(見下面實施例-部分)，可以測量γ分泌酶活性。
為了測量BACE1活性，通過蛋白印跡(Blasko等，J Neural Transm111，523)，可以分析α-和β-C-末端APP片段之間的比例的變化；BACE1活性測定的其它實例包括但不限于使用含有BACE1剪切位點的環化酶供體肽，以重建和測量β-半乳糖苷酶報道分子活性(Naqvi等，JBiomol Screen.9，398)；使用淬滅的熒光肽底物和熒光測量(Andrau等，J.Biol Chem 278，25859)；使用基于細胞的利用重組嵌合蛋白的測定，其中通過一串含有BACE1識別序列的氨基酸將酶(例如堿性磷酸酶)連接到高爾基體-駐留蛋白(Oh等，Anal Biochem，323，7)；熒光共振能轉移(FRET)-為基礎的測定(Kennedy等，Anal Biochen319，49)；在酵母中的細胞生長選擇系統(Luthi等，Biochim BiophysActa 1620，167)。
優選地，神經變性疾病是阿爾茨海默氏病。
根據本發明，使用ATP7A相互作用分子來制備藥物組合物。
因此，本發明提供了藥物組合物，其可以以有效量施用給對象。在一個優選的方面，治療劑基本上是純化的。對象優選地是動物，包括但不限于動物例如牛，豬，馬，雞，貓，狗，等，且優選地是哺乳動物，最優選地是人。在一個具體的實施方案中，非-人哺乳動物是對象。
已知多種輸送系統，且可以用于施用本發明的治療劑，例如包封在脂質體，微粒，和微膠囊中；使用能表達治療劑的重組細胞，使用受體-介導的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)；構建作為逆轉錄病毒或其它載體的一部分的治療核酸等。導入方法包括但不限于皮內的，肌肉內的，腹膜內的，靜脈內的，皮下的，鼻內的，硬膜外的和經口的途徑。通過任何方便的途徑，例如通過輸注，通過快速推注，通過經上皮或粘膜皮膚內襯(例如，口腔的，直腸的和腸的粘膜等)的吸收，可以施用化合物，且可以與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能需要通過任何合適的途徑，包括腦室內的和鞘內的注射，將本發明的藥物組合物導入中樞神經系統；通過腦室內的導管，例如其連接到儲器，例如Ommaya儲器，可以促進腦室內注射。也可以采用肺施用，例如，通過使用吸入器或或噴霧器，并與霧化劑一起配制。
在一個具體的實施方案中，可能需要將本發明的藥物組合物局部地施用到需要治療的區域。這可以通過下述方式實現例如但不限于，在手術過程中局部灌輸，局部應用(外用)，例如手術后與創傷敷料相聯合，通過注射，借助導管，借助栓劑，或借助植入物，所述植入物是多孔的，無孔的，或凝膠狀的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纖維。在一個實施方案中，施用可以是通過在惡性腫瘤或腫瘤的或腫瘤發生前的組織的部位(或先前部位)直接注射。
在另一個實施方案中，可以在囊泡、尤其脂質體中輸送治療劑(Langer，1990，Science 2491527-1533；Treat等，1989，見Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler編，Liss，New York，第353-365頁；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁；總見上文)在另一個實施方案中，通過控釋系統，可以輸送治療劑。在一個實施方案中，可以使用泵(Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201-240；Buchwald等，1980，Surgery88507-516；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574-579)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料(Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise編，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，Smolen和Ball編，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；Levy等，1985，Science 228190-192；During等，1989，Ann.Neurol.25351-356；Howard等，1989，J.Neurosurg.71858-863)。在另一個實施方案中，控釋系統可以置于治療靶物(即腦)附近，從而僅僅需要全身劑量的一小部分(例如，Goodson，1984，見MedicalApplications of Controlled Release，同上，Vol.2，第115-138頁)。在Langer(1990，Science 2491527-1533)的綜述中，討論了其它控釋系統。
在一個具體的實施方案中，其中治療劑是核酸，優選地編碼蛋白治療劑，可以體內施用核酸，以促進它編碼的蛋白的表達，通過將它構建為合適的核酸表達載體的一部分，并施用它，以便使它變成胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)，或通過給它包被脂類、細胞-表面受體或轉染劑，或通過將它與已知能進入核中的同源框-樣肽一起連合施用(例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)等。或者，可以胞內地導入核酸治療劑，并通過同源重組摻入宿主細胞DNA中以進行表達。
總體而言，本發明的藥物組合物包含治療有效量的治療劑和藥學上可接受的載體。在一個具體的實施方案中，術語″藥學上可接受的″指被聯邦或政府機關的管理部門所批準，或列在美國藥典或其它公認的藥典中，用于動物，更特別是用于人。術語″載體″指與治療劑一起施用的稀釋劑，輔劑，賦形劑，或介質。這樣的藥物載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，包括但不限于花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當經口施用藥物組合物時，水是優選的載體。當靜脈內地施用藥物組合物時，鹽水和含水右旋糖是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖和甘油溶液優選地用作可注射溶液的液體載體。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物還可以含有小量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續釋放制劑等的形式。利用傳統的粘合劑和載體，例如甘油三酯，可以將組合物配制成栓劑。經口制劑可以包括標準的載體例如藥物級甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。合適的藥物載體的實例記載在E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″。這樣的組合物含有治療有效量的治療劑，優選純化的形式，以及合適量的載體，以便提供適于施用給患者的形式。制劑應當適合施用模式。
在一個優選的實施方案中，根據常規方法，將組合物配制成適于靜脈內地施用給人類的藥物組合物。典型地，靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。當需要時，組合物也可以包括增溶劑和局部麻醉劑，例如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，單獨分開地或在單位劑型中混合在一起地供應成分，例如，作為在密封容器中的凍干粉末或無水濃縮物，所述容器例如指示活性劑的量的安瓿或藥囊(sachette)。當要通過輸注施用組合物時，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶分配它。當通過注射施用組合物時，可以提供一安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便可以在施用前混合各成分。
本發明的治療劑可以配制成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與游離羧基形成的那些，例如源自鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的羧基；與游離胺基團形成的那些，例如源自異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等的胺基團，和源自鈉、鉀、銨、鈣和鐵氫氧化物等的那些。
將有效地治療特定障礙或狀況的本發明的治療劑的量，將取決于障礙或狀況的性質，且可以通過標準的臨床技術來確定。另外，可以任選地采用體外測定，以輔助鑒別最佳劑量范圍。在制劑中使用的準確劑量，也依賴于施用途徑，疾病或障礙的嚴重性，且應當根據操作人員的判斷和每位患者的情況來決定。但是，靜脈內施用的合適的劑量范圍通常是約20-500微克活性化合物/千克體重。鼻內施用的合適的劑量范圍通常是約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。從源自體外或動物模型實驗系統的劑量效應曲線，可以外推有效劑量。
栓劑通常含有0.5％-10％(重量)的活性成分；經口制劑優選地含有10％-95％活性成分。
本發明也提供了藥物包或試劑盒，其包含一個或多個容器，其中裝有本發明的藥物組合物的一種或多種成分。任選地，這樣的容器伴有負責管理藥物或生物產品的生產、使用或銷售的政府機構規定形式的說明書，該說明書能反映用于人施用的生產、使用或銷售的機構的批準。
本發明的試劑盒也可以含有編碼復合物結構的基本組分的表達載體，該組分在表達后可以重構，以形成生物活性復合物。這樣的試劑盒優選地還含有需要的緩沖液和試劑。任選地，這樣的容器伴有試劑盒的使用說明書和/或負責管理藥物或生物產品的生產、使用或銷售的政府機構規定形式的說明書，該說明書能反映用于人施用的生產、使用或銷售的機構的批準。
本發明還涉及治療方法，其中將有效量的本發明的ATP7A-相互作用分子或抑制劑或藥物組合物施用給患有神經變性疾病、優選阿爾茨海默氏病的對象。
關于本發明的該方法，上面給出的所有實施方案都適用于本發明的應用。
本發明還涉及鑒別γ分泌酶調控劑和/或β-分泌酶調控劑的方法，其包括下述步驟a.通過檢測給定的實驗化合物是否是ATP7A-相互作用分子，鑒別ATP7A-相互作用分子，b.確定步驟a)的ATP7A-相互作用分子是否能調控γ分泌酶活性或β-分泌酶活性。
在本發明的一個優選的實施方案中，在步驟a)中，使實驗化合物接觸ATP7A，并檢測ATP7A與實驗化合物的相互作用。優選地，測量候選分子是否與ATP7A結合。
在本發明的一個優選的實施方案中，在步驟a)中鑒別的ATP7A相互作用分子首先進行如上所述的ATP7A活性測試(也見實施例3)，以發現它是否能調控、優選地抑制ATP7A活性，然后進行方法的步驟b)(測試Aβ-降低作用)。
優選地，在高通量測定的情境中，進行本發明的方法。這樣的測定是本領域的技術人員已知的。
可以將待篩選的實驗或候選分子提供為有限數目的特定化合物的混合物，或作為化合物文庫，肽文庫等。待篩選的試劑/分子也可以包括所有形式的抗血清，反義核酸等，其可以調控復合物活性或形成。下面闡述了用于篩選的示例性的候選分子和文庫。
通過許多普遍知道的方法之一，可以實現對文庫的篩選。見例如下面的文獻，其公開了肽文庫的篩選Parmley和Smith，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218；Scott和Smith，1990，Science 249386-390；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13422-427；Oldenburg等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895393-5397；Yu等，1994，Cell 76933-945；Staudt等，1988，Science241577-580；Bock等，1992，Nature 355564-566；Tuerk等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896988-6992；Ellington等，1992，Nature 355850-852；Ladner等的美國專利號5,096,815，美國專利號5,223,409，和美國專利號5,198,346；Rebar和Pabo，1993，Science263671-673；和國際專利公開號WO 94/18318。
在一個具體的實施方案中，通過使文庫成員接觸固定化在固相上的ATP7A，并收獲與蛋白(或編碼核酸或衍生物)結合的那些文庫成員，可以進行篩選。這樣的篩選方法的實例稱作″淘選(panning)″技術，例如記載在Parmley和Smith，1988，Gene 73305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13422-427；國際專利公開號WO 94/18318；和上面引用的文獻中。
在一個具體的實施方案中，篩選ATP7A-片段和/或類似物、尤其是肽模擬物作為ATP7A與其它蛋白例如Psen2形成復合物(復合物的量或復合物的組成)或細胞中ATP7A活性的競爭性或非-競爭性抑制劑的活性，其由此抑制細胞中的復合物活性或形成。
在一個實施方案中，使用結合抑制測定，可以篩選能調控(即拮抗或激動)ATP7A-活性或ATP7A-蛋白復合物形成的試劑，其中在水性的或生理的結合條件下，篩選試劑調控復合物形成的能力，其中在沒有要測定的試劑的情況下發生復合物形成。將能干擾本發明的復合物形成的試劑鑒別為復合物形成的拮抗劑。將能促進復合物形成的試劑鑒別為復合物形成的激動劑。將能完全阻斷復合物形成的試劑鑒別為復合物形成的抑制劑。
篩選方法可以包含，用放射性配體(例如，125I或3H)，磁性配體(例如，共價地結合到醋酸光生物素上的順磁珠)，熒光配體(例如，熒光素或羅丹明)，或酶配體(例如，螢光素酶或β-半乳糖苷酶)，標記復合物的組分蛋白。然后，通過許多本領域已知的技術之一，包括但不限于，使用針對未標記的結合伴侶(或標記的結合伴侶，其具有與第二個標記的復合物部分上所用的標記可區分的標記)的抗血清對標記的復合物部分的共免疫沉淀，免疫親和色譜，尺寸排阻色譜，和梯度密度離心，可以分離在溶液中結合的反應物。在一個優選的實施方案中，標記的結合伴侶是小片段或肽模擬物，其不能被市場上買到的過濾器截留。結合后，標記的種類不再能通過過濾器，提供對復合物形成的簡單測定。
使用本領域普遍已知的方法來標記復合物的至少一個組分成員。合適的標記方法包括，但不限于，通過摻入放射性標記的氨基酸例如3H-亮氨酸或35S-甲硫氨酸進行放射標記，通過使用氯胺T方法，鮑爾通-亨特試劑等，用125I或131I進行翻譯后碘化而實現放射性標記，或使用磷酸化酶和無機放射性標記的磷，用32P進行標記，用光生物素-醋酸酯進行生物素標記，和太陽燈暴露等。在復合物成員之一是固定化的情況下，例如如下所述，可標記游離的種類。當相互作用物質都沒有被固定化時，可以用可區分的標記物標記每一種，從而可以追蹤兩個部分的分離，以便更準確的定量并區分同源和異源復合物的形成。提供了使用輔助蛋白的方法，該蛋白能結合經修飾的相互作用劑之一，以提高檢測的靈敏性，增加復合物的穩定性等。
典型的結合條件是，例如，但不限于，在10-250mM NaCl，5-50mM Tris-HCl，pH 5-8，和0.5％Triton X-100或能提高相互作用的特異性的其它去污劑的水性鹽溶液中。可以加入金屬螯合劑和/或二價陽離子，以提高結合和/或減少蛋白水解。反應溫度可以包括4，10，15，22，25，35，或42℃，且溫育時間典型地是至少15秒，但是更長的時間是優選的，以允許發生結合平衡。使用常規的蛋白結合測定來確定可再現的結合的最佳結合條件，可以測定特定的復合物。
使用對所用的標記特異性的測定方法，例如，用于放射性檢測的液體閃爍計數，酶-標記的部分的酶活性等，通過定量復合物形成，可以分析復合物形成的物理參數。然后，使用Scatchard分析，Hill分析，和本領域普遍已知的其它方法，分析反應結果(見，例如，Proteins，Structures，and Molecular Principles，2ndEdition(1993)Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York).
在結合測定的第二個普通方案中，將結合物質之一共價地或非-共價地固定化到過濾器上，微量滴定板孔中，試管中，色譜基質上等。使用本領域眾所周知的任意方法，例如，但不限于Kadonaga和Tjian，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835889-5893的方法，即連接到溴化氰衍生的基質例如CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)，可共價地固定化蛋白。當需要時，可以使用間隔物減少基質的空間位阻。蛋白向基質的非-共價結合包括但不限于，蛋白向帶電荷的表面的結合，與特異性的抗體的結合，向第三種無關的相互作用蛋白的結合等。
提供了用于競爭復合物的一個成員(或其衍生物)與通過任意方式(例如，上述的那些方式)標記的復合物的另一個成員結合的試劑(包括細胞提取物或文庫集合)的測定，以篩選復合物形成的競爭劑或增強劑。
在具體的實施方案中，在測定混合物中包括封閉劑，其用于抑制試劑與其它蛋白組分的非特異性結合，或試劑向塑料、固定化基質的吸附損失等。封閉劑包括但不限于牛血清白蛋白，酪蛋白，脫脂奶粉，Denhardt氏試劑，菲柯爾，聚乙烯吡咯烷，非離子型去污劑(NP40，Triton X-100，Tween 20，Tween 80，等)，離子型去污劑(例如，SDS，LDS，等)，聚乙二醇等。合適的封閉劑濃度允許復合物形成。
進行結合后，去除上清液中的未結合的標記的蛋白，廣泛地洗滌保留任意的結合的標記蛋白的固定化蛋白。然后，使用本領域的標準方法，檢測如上所述的標記，定量結合的標記的量。
在另一個具體的實施方案中，通過將本文提供的蛋白復合物/蛋白和/或本文提供的抗體結合到固體載體上，可以篩選如本文提供的蛋白復合物/蛋白的調控劑。
這樣的含有不同類型的蛋白(包括抗體)的陣列的制備，是本領域眾所周知的，且是本領域的技術人員顯而易見的(見例如Ekins等，1989，J.Pharm.Biomed.Anal.7155-168；Mitchell等2002，Nature Biotechnol.20225-229；Petricoin等，2002，Lancet359572-577；Templin等，2001，Trends Biotechnol.20160-166；Wilson和Nock，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.681-85；Lee等，2002 Science 2951702-1705；MacBeath和Schreiber，2000，Science2891760；Blawas和Reichert，1998，Biomaterials 19595；Kane等，1999，Biomaterials 202363；Chen等，1997，Science 2761425；Vaugham等，1996，Nature Biotechnol.14309-314；Mahler等，1997，Immunotechnology 331-43；Roberts等，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3268-273；Nord等，1997，Nature Biotechnol.15772-777；Nord等，2001，Eur.J.Biochem.2684269-4277；Brody和Gold，2000，Rev.Mol.Biotechnol.745-13；Karlstroem和Nygren，2001，Anal.Biochem.29522-30；Nelson等，2000，Electrophoresis 211155-1163；Honore等，2001，Expert Rev.Mol.Diagn.3265-274；Albala，2001，Expert Rev.Mol.Diagn.2145-152，Figeys和Pinto，2001，Electrophoresis 2208-216和本文列出的出版物中的文獻)。
通過本領域的技術人員顯而易見的各種不同方法，可以將蛋白或蛋白復合物結合到陣列上。例如，純化步驟后，或通過本領域的技術人員顯而易見的另一種合適的純化方案，經由TAP-標記(如WO/0009716和Rigaut等，1999，Nature Biotechnol.101030-1032所述)，可以將復合物添加到陣列。
任選地，可以交聯復合物的蛋白，以增強復合物的穩定性。不同的交聯蛋白的方法，是本領域眾所周知的。交聯劑的反應性末端基團包括但不限于-COOH，-SH，-NH2或N-氧-琥珀酰胺酸酯。
應當根據要交聯的復合物的大小，選擇交聯劑的間隔物。對于僅僅包含少數蛋白的小蛋白復合物，相對較短的間隔物是更優選的，以便減少交聯反應混合物中分開的復合物的可能性。對于較大的蛋白復合物，另外使用較大的間隔物是優選的，以便促進復合物內的蛋白之間的交聯。
優選地，在將復合物連接到載體上之前，檢查交聯的成功率。
本領域的技術人員顯而易見，需要在個案的基礎上，確定最佳交聯率。這可以通過本領域眾所周知的方法來實現，下面示例性地描述了其中的一些。
例如通過分析變性蛋白凝膠上交聯的復合物相對未交聯的復合物，可以檢查足夠的交聯率。
如果已經成功地進行了交聯，預期會在相同的泳道中發現復合物的蛋白，而預期未交聯的復合物的蛋白會按照它們各自的特征分開。任選地，使用本領域眾所周知的方法，例如質譜法和/或埃德曼降解，通過各條帶中的蛋白的肽-測序，可以進一步檢查復合物的所有蛋白的存在。
另外，還應當避免太高的交聯率。如果已經太廣泛地進行了交聯，將會有增加量的各蛋白復合物的交聯，這會潛在地干擾使用陣列進行的對潛在結合伴侶和/或調控劑等的篩選。
通過本領域眾所周知的方法，包括例如凝膠過濾實驗，其對比含有交聯的復合物相對未交聯的復合物的凝膠過濾特征溶液，可以確定這樣的結構的存在。
任選地，可以進行本領域的技術人員顯而易見的功能測定，本文示例地提供了其中的一些，以檢查復合物的完整性。
或者，可以將所述多種或一種蛋白表達為單一融合蛋白，并偶聯到基質上，如本領域的技術人員顯而易見的。
任選地，通過本領域的技術人員顯而易見的各種方法，可以進一步監測如上所述的復合物或蛋白或抗體的結合。它們包括但不限于表面等離子共振(見例如McDonnel，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.5572-577；Lee，2001，Trends Biotechnol.19217-222；Weinberger等，2000，1395-416；Pearson等，2000，Ann.Clin.Biochem.37119-145；Vely等，2000，Methods Mol.Biol.121313-321；Slepak，2000，J.Mol Recognit.1320-26。
用于通過ELISA測量Aβ-40和Aβ-42肽的產生的示例測定，包括但不限于在Vassar R等，1999，Science，286735-41中描述的那些。
用于通過蛋白印跡測量細胞系或轉基因動物中C-末端APP片段的產生的示例測定，包括但不限于在Yan R等，1999，Nature，402533-7中描述的那些。
用于測量早老素2-復合物(Psen2)和BACE1-復合物的針對體外細菌表達的APP片段的β-或γ分泌酶的蛋白水解活性(例如借助于RNAi(siRNA)和/或編碼相互作用蛋白的質粒，通過修飾細胞中一種或幾種相互作用蛋白的表達)的示例測定，包括但不限于在Tian G等，2002，J Biol Chem，27731499-505中描述的那些。
用于測量早老素2-復合物(Psen2)和BACE1-復合物的Gal4-驅動的報道基因的轉活化(例如借助于RNAi(siRNA)和/或編碼相互作用蛋白的質粒，通過修飾細胞中一種或幾種相互作用蛋白的表達)的示例測定，包括但不限于在Cao X等，2001，Science，293115-20中描述的那些。
可以測定本領域已知的任意分子作為根據本發明的相互作用分子或抑制劑的能力。可以將候選分子直接提供給能表達ATP7A-復合物機制的細胞，或者，在候選蛋白的情況下，可以通過在能重組表達核酸以生成候選蛋白的條件下，通過提供它們的編碼核酸來提供。
本發明的方法非常適用于篩選化學文庫中能調控(例如，抑制、拮抗或激動)復合物的量、活性或蛋白組分組成的分子。化學文庫可以是肽文庫，肽模擬物文庫，化學合成的文庫，重組體例如噬菌體展示文庫，和基于體外翻譯的文庫，其它非-肽合成有機文庫等。
示例文庫可以在商業上從幾種來源得到(ArQule，Tripos/PanLabs，ChemDesign，Pharmacopoeia)。在有些情況下，使用組合策略生成這些化學文庫，其在成員化合物結合的基質上編碼每個文庫成員的身份，從而允許直接且立即鑒別是有效的調控劑的分子。因而，在許多組合方案中，化合物在平板上的位置指示著化合物的組成。另外，在一個實例中，單個的平板位置可以具有1-20種化學物質，通過施用到含有目標相互作用的孔，可以進行篩選。因而，如果檢測到調控，可以測定越來越小的相互作用對集合的調控活性。通過這樣的方法，可以篩選許多候選分子。
適合使用的許多多樣性文庫是本領域已知的，且可以用于提供要根據本發明測試的化合物。或者，使用標準方法，可以構建文庫。化學(合成)文庫，重組表達文庫，或基于多核糖體的文庫，是可以使用的示例類型的文庫。
文庫可以是受限制的或半剛性的(具有一定程度的結構剛性)，或線性的或非限制的。文庫可以是cDNA或基因組表達文庫，隨機肽表達文庫或化學合成的隨機肽文庫，或非-肽文庫。將表達文庫導入在其中進行測定的細胞，在其中表達文庫的核酸以產生它們編碼的蛋白。
在一個實施方案中，可以在本發明中使用的肽文庫可以是體外化學合成的文庫。這樣的文庫的實例提供在Houghten等，1991，Nature35484-86，其描述了游離的六肽的混合物，其中各自分別地和具體地定義了每個肽中的第一個和第二個殘基；Lam等，1991，Nature 35482-84，其描述了″一個珠子，一種肽″方案，其中固相裂分合成方案生成肽文庫，其中收集物中的每個珠子具有固定化在其上面的氨基酸殘基的單一的隨機序列；Medynski，1994，Bio/Technology12709-710，其描述了裂分合成法和T-袋合成法；和Gallop等，1994，J.Med.Chem.371233-1251。僅僅作為其它實例，可以根據Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422-11426；Houghten等，1992，BioTechniques 13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911614-1618；或Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011708-11712的方法制備組合文庫供使用。PCT公開號WO 93/20242和Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383描述了″編碼的組合化學文庫″，其含有各化學聚合物文庫成員的寡核苷酸標識符。
在一個優選的實施方案中，篩選的文庫是生物表達文庫，其是隨機肽噬菌體展示文庫，其中隨機的肽是受限制的(例如因為具有二硫鍵)。
另外也可以使用其它更一般的結構上受限制的有機多樣性(例如，非肽)文庫。作為實例，可以使用苯并二氮類文庫(見例如，Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)。
可以使用的構象受限制的文庫包括但不限于以下那些含有不變的半胱氨酸殘基，所述殘基在氧化環境下通過二硫鍵進行交聯形成胱氨酸；修飾的肽(例如，摻入氟，金屬，同位素標記，被磷酸化，等)，含有一個或多個非-天然存在的氨基酸的肽，非-肽結構，和含有-羧基谷氨酸的重要部分的肽。
也可以使用非-肽的文庫，例如，肽衍生物(例如，含有一個或多個非-天然存在的氨基酸的那些)。它們的一個實例是類肽文庫(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367-9371)。類肽是非-天然氨基酸的聚合物，所述非天然氨基酸具有天然存在的側鏈，后者不是連接到α-碳而是連到主鏈氨基氮。由于類肽不能被人消化酶容易地降解，它們有利地更易適用于藥物用途。Ostresh等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111138-11142描述了可以使用的文庫的另一個實例，其中肽中的酰胺官能團已經被全甲基化，產生化學轉化的組合文庫。
可以根據本發明篩選的肽文庫的成員不限于含有20種天然存在的氨基酸。更具體地，化學合成的文庫和基于多核糖體的文庫允許使用20種天然存在的氨基酸以外的氨基酸(它們包括在用于文庫產生的氨基酸的前體集合中)。在具體的實施方案中，文庫成員含有一種或多種非-天然的或非-經典的氨基酸或環肽。非-經典的氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-異構體，-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸；-Abu，-Ahx，6-氨基己酸；Aib，2-氨基異丁酸；3-氨基丙酸；鳥氨酸；正亮氨酸；正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，磺丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己基丙氨酸，β-丙氨酸，設計的氨基酸例如β-甲基氨基酸，C-甲基氨基酸，N-甲基氨基酸，氟-氨基酸和一般的氨基酸類似物。而且，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
在一個具體的實施方案中，篩選本發明的復合物或其蛋白組分的片段和/或類似物(尤其肽模擬物)作為復合物活性或形成的競爭性或非-競爭性抑制劑的活性。
在本發明的另一個實施方案中，可以使用組合化學來鑒別復合物的調控劑。組合化學能建立含有許許多多種化合物的文庫，其中的許多可以是結構上類似的。盡管高通量篩選程序能篩選這些巨大的文庫對已知靶物的親和力，已經開發了新的方案，其實現更小尺寸的文庫，但是其能提供最大的化學多樣性(見例如，Matter，1997，J.Med.Chem.401219-1229)。
一種組合化學方法是親和指紋法，以前已經用于測試小分子的離散文庫對確定的一組蛋白的結合親和力。使用通過篩選得到的指紋，預測各文庫成員對其它目標蛋白或受體(在本發明中，本發明的蛋白復合物和其蛋白組分)的親和力。將指紋與從已知能與目標蛋白反應的其它化合物得到的指紋相對比，預測該文庫化合物是否可能類似地反應。例如，不測試大文庫中的每種配體與復合物或蛋白組分的相互作用，而僅僅測試具有與已知具有該活性的其它化合物類似的指紋的那些配體(見，例如，Kauvar等，1995，Chem.Biol.2107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical ManufacturingInternational.825-28；和Kauvar，Toxic-Chemical Detection byPattern Recognition in New Frontiers in AgrochemicalImmunoassay，Kurtz，Stanker and Skerritt(eds)，1995，AOACWashington，D.C.，305-312)。
Kay等(1993，Gene 12859-65)公開了構建肽文庫的方法，所述文庫編碼完全隨機序列的肽，其比任何以前的常規文庫的序列更長。Kay等公開的文庫編碼完全合成的隨機的肽，其長度大于約20個氨基酸。可以有利地篩選這樣的文庫，以鑒別復合物調控劑(也見美國專利號5,498,538，1996年3月12日；和PCT公開號WO 94/18318，1994年8月18日)。
對各種類型的肽文庫的綜述可見Gallop等，1994，J.Med.Chem.371233-1251。
在一個優選的實施方案中，實驗化合物與ATP7A的相互作用，會導致對ATP7A-活性的抑制。
根據一個優選的實施方案，在步驟b)中，測量γ-分泌酶剪切APP的能力。這可以如上所述測量。
而且，本發明還涉及制備用于治療神經變性疾病、優選阿爾茨海默氏病的藥物組合物的方法，其包括下述步驟a)根據本發明的方法，鑒別γ-分泌酶調控劑和/或β-分泌酶調控劑，優選抑制劑，和b)將γ-分泌酶和/或β-分泌酶調控劑、優選抑制劑配制成藥物組合物。
關于藥物組合物，如上所述的所有實施方案也適用于此。
在一個優選的實施方案中，本發明的該方法還包括混合鑒別的分子和如上所述的藥學上可接受的載體的步驟。
本發明還涉及藥物組合物，其包含如上定義的ATP7A-抑制劑。
而且，本發明也涉及可以通過上面的制備藥物組合物的方法得到的藥物組合物。
本發明也涉及本發明的藥物組合物用于治療神經變性疾病，例如阿爾茨海默氏病和有關的神經變性障礙。
本發明也涉及治療或預防神經變性疾病、優選阿爾茨海默氏病的方法，其包括向需要這樣的治療或預防的對象施用治療有效量的本發明的藥物組合物。
關于本發明的該方法，如上所述的關于本發明的應用的所有實施方案也適用。
本發明也涉及ATP7A-相互作用分子在體外調控、優選地抑制β-分泌酶和/或γ-分泌酶活性的應用。例如，本發明包括通過ATP7A-相互作用分子調控、優選地抑制細胞培養物中的β-分泌酶和/或γ-分泌酶活性。如上所述的關于ATP7A-相互作用分子的所有實施方案也適用于本發明的該應用。
下面的實施例將更詳細地描述本發明的主題。
實施例1使用TAP-技術，其更完整地分別記載在EP 1 105 508 B1和Rigaut，等，1999，Nature Biotechnol.171030-1032，并如下所述進一步改進，進行蛋白純化。使用如下所述的質譜法鑒別蛋白。
將ATP7A鑒別為與TAP技術進入點Psen2的蛋白復合物的成員。
第1部分TAP-標記的誘餌的構建通過RT-PCR，得到了編碼完整ORF的cDNA。使用RNeasy小試劑盒(Qiagen)，從適當的細胞系制備總RNA。使用基因-特異性的引物，以用于長模板試劑盒(Life Technologies)的SUPERSCRIPT One-StepRT-PCR，進行cDNA合成和PCR。擴增35-40個循環后，用MinElute PCR純化試劑盒(Qiagen)，凝膠純化具有預期大小的PCR-產物，如果需要，用于進一步擴增。在凝膠純化前，通過巢床PCR擴增低豐度的RNA。將NotI的限制位點連接到PCR引物上，以允許將擴增的cDNA亞克隆進逆轉錄病毒載體pIE94-N/C-TAP，從而產生具有TAP-標記的N-或C-末端融合體(Rigaut等，1999，Nature Biotechnol.171030-1032)。為下面的誘餌/進入點選擇N-末端標記早老素1，早老素2，Aph-1a，Aph-1b，Pen-2，APP，Tau，Fe65，Calsenilin。為下面的誘餌/進入點選擇C-末端標記Nicastrin，Aph-1a，Aph-1b，BACE1 D215N，APP，APP695SW，APP-C99，Fe65，X11β。
通過限制消化，DNA測序和使用TNT T7快速偶聯的轉錄/翻譯系統(Promega inc.)通過體外翻譯，分析克隆。使用TAP-標記的蛋白A部分進行檢測，通過蛋白印跡，證實了蛋白的存在。簡而言之，通過標準的SDS-PAGE分離蛋白，然后使用來自Pharmacia Biotech的MultiphorII印跡裝置，半干轉移到硝酸纖維素膜(PROTRAN，Schleicher&Schuell)上。轉移緩沖液由48mM Tris，39mM甘氨酸，10％甲醇和0，0375％十二烷基硫酸鈉組成。在添加了10％干奶粉和0.1％Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉后，用在封閉溶液中稀釋的過氧化物酶-抗-過氧化物酶可溶復合物(Sigma)探測轉移的蛋白。徹底洗滌后，通過增強化學發光(ECL；Amersham Pharmacia Biotech)，觀察免疫反應蛋白。
第2部分病毒的制備和感染使用基于MoMLV的重組病毒作為載體。
如下進行制備2.1.病毒的制備293gp細胞生長至100％匯合。將它們以1∶5分到聚-L-賴氨酸平板(在PBS中1∶5稀釋的聚-L-賴氨酸
，放在平板上至少10min)。在第2天，將63微克逆轉錄病毒載體DNA和13微克編碼合適的包膜蛋白的質粒的DNA一起，轉染進293gp細胞(Somia，等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9612667-12672；Somia等，2000，J.Virol.744420-4424)。在第3天，將培養基替換為15ml DMEM+10％FBS/15-cm培養皿。在第4天，收獲含有病毒的培養基(上清液)(在轉染后培養基更換后24h)。當計劃第二次收集時，將DMEM 10％FBS加入平板，并將平板溫育另外24h。如下進行所有收集經0.45微米過濾器(Corning GmbH，醋酸纖維素，431155)，過濾上清液。將過濾器置于圓錐形異質同晶聚合物離心管(Beckman，358126)中，后者置于SW 28轉子(Beckman)的桶中。在21℃，以19400rpm，在SW 28轉子中超速離心經過濾的上清液2小時。拋棄上清液。使用氣溶膠安全的管尖，通過上下吸液100次，將含有病毒的沉淀重新懸浮在小體積(例如300微升)漢克平衡鹽溶液[Gibco BRL，14025-092]中。將病毒用于如下所述的轉染。
2.2.感染在前一天，將感染的細胞平板接種到6-孔平板的一個孔中。感染前4小時，將細胞上的舊培養基替換為新鮮培養基。僅僅加入最小體積，以完全覆蓋細胞(例如700微升)。在感染過程中，細胞活躍地分裂。
下面(“2.3.細胞系”)進一步描述了細胞和它們的生長條件。
向濃縮的病毒中，加入聚凝胺(溴化己二甲銨；Sigma，H 9268)，達到8微克/ml的終濃度(這相當于2.4微升1毫克/ml聚凝胺原液/300微升濃縮的逆轉錄病毒)。在室溫，在聚凝胺中溫育病毒1小時。為了感染，將病毒/聚凝胺混合物加給細胞，并在37℃，在合適的CO2濃度下，溫育數小時(例如經過白天或過夜)。感染后，將感染的細胞上的培養基替換為新鮮培養基。在細胞變成匯合后，照常將細胞傳代。細胞含有整合進它們的染色體中的逆轉錄病毒，且穩定地表達目標基因。
2.3.細胞系使用SKN-BE2細胞進行表達。在95％OptiMEM+5％添加了鐵的小牛血清中，培養SKN-BE2細胞(美國典型培養物保藏中心-No.CRL-2271)。
第3部分檢查TAP-標記的蛋白的表達模式通過免疫印跡分析和/或通過免疫熒光，檢查TAP-標記的蛋白的表達模式。取決于TAP-標記的蛋白的類型，根據No.1或No.2，進行免疫熒光分析。根據No.3，進行免疫印跡分析。
3.1對固定的哺乳動物細胞的質膜和ER結合的蛋白進行間接免疫熒光染色的方案細胞在聚賴氨酸包被的8孔室載玻片上的FCS培養基中生長至50％匯合。然后，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液(0.14M磷酸鹽，0.1M NaClpH 7.4)中稀釋的4％多聚甲醛中，進行細胞的固定。以300微升/孔，在室溫培養細胞30分鐘。在室溫，在PBS中的0.1M甘氨酸中，淬滅2×20分鐘。用在0.3％皂苷+PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)，在室溫封閉至少1小時。在+4℃，在封閉溶液中溫育一抗過夜。在個案基礎上，確定抗體的適當稀釋度。在室溫，在含有0.3％皂苷的PBS中，洗滌細胞2×20分鐘。在封閉溶液中，溫育二抗。以1∶1000稀釋Alexa594偶聯的山羊抗-兔(Molecular Probes)。以1∶1000稀釋Alexa 488偶聯的山羊抗-小鼠(Molecular Probes)。使用DAPI來標記DNA。如果使用鬼筆環肽來標記F-肌動蛋白，以1∶500稀釋該藥物，并與二抗一起溫育。然后，在室溫，在PBS中再洗滌細胞2×20分鐘。去除多余的緩沖液，將細胞置于含有抗-漂白劑的培養基(Vectashield，Vector Laboratories)中。
3.2對固定的哺乳動物細胞的非-質膜結合的蛋白進行間接免疫熒光染色的方案細胞在聚賴氨酸包被的8孔室載玻片上的FCS培養基中生長至50％匯合。然后，在室溫(RT)，以300微升/孔，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液(0.14M磷酸鹽，0.1M NaCl pH 7.4)中稀釋的4％多聚甲醛中，進行細胞的固定30分鐘。在室溫，在PBS中的0.1M甘氨酸中，淬滅2×20分鐘。在室溫，用在PBS中的0.5％Triton X-100，透化細胞10分鐘。在0.3％皂苷+PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)中，在室溫封閉至少1小時(封閉溶液)。在+4℃，在封閉溶液中溫育一抗過夜。必須在個案基礎上確定抗體的適當稀釋度。在室溫，在含有0.3％皂苷的PBS中，洗滌細胞2×20分鐘。在封閉溶液中，溫育二抗。以1∶1000稀釋Alexa 594偶聯的山羊抗-兔(Molecular Probes)。以1∶1000稀釋Alexa 488偶聯的山羊抗-小鼠(Molecular Probes)。使用DAPI來標記DNA。如果使用鬼筆環肽來標記F-肌動蛋白，以1∶500稀釋該藥物，并與二抗一起溫育。在室溫，在PBS中洗滌細胞2×20分鐘。去除多余的緩沖液，將細胞置于含有抗-漂白劑的培養基(Vectashield，Vector Laboratories)中。
3.3免疫印跡分析為了分析TAP-標記的蛋白的表達水平，在60μl DNA酶I緩沖液(5％甘油，100mM NaCl，0.8％NP-40(IGEPAL)，5mM硫酸鎂，100μg/ml DNA酶I(Roche Diagnostics)，50mM Tris，pH 7.5，蛋白酶抑制劑混合物)中，在冰上裂解細胞沉淀(來自6-孔皿)15min。將每份樣品分成兩個等分試樣。第一份以13,000rpm離心5min，在上清液中產生NP-40-可提取的物質；仔細地研磨第二份(全部材料)。在50℃，在振蕩器上，將NP-40-可提取的物質和全部材料各50μg與含有DTT的樣品緩沖液混合30min，通過在預凝成塊的4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。然后，使用不連續緩沖系統的半干方法，將蛋白轉移到硝酸纖維素。簡而言之，將凝膠和硝酸纖維素膜疊放到浸泡在陽極緩沖液(3層緩沖液A1(0.3M Tris-HCl)和3層緩沖液A2(0.03M Tris-HCl))或陰極緩沖液(3層0.03M Tris-HCl，pH 9.4，0.1％SDS，40mM □-氨基己酸)中的濾紙之間。立刻在600mA進行2種凝膠的電轉移25min。用麗春紅S溶液使轉移的蛋白顯色1分鐘，以控制轉移效率，然后在水中脫去染色。在室溫，在TBST(含有0.05％Tween-20的TBS)中的5％脫脂奶粉中封閉膜30min。隨后，在室溫，與HRP-偶聯的PAP抗體(在5％奶/TBST中1∶5000稀釋)溫育1h，在TBST中洗滌3次10min。最后，將印跡膜浸泡在化學發光底物(ECL，Roche Diagnostics)中2min，并暴露于X-射線膠片或在成像臺上分析。
第4部分純化蛋白復合物使蛋白復合物純化適合于TAP-標記的蛋白的亞細胞定位，并如下進行。
4.1細胞質蛋白的裂解物制備用細胞刮刀，收獲約1×109貼壁細胞(平均)，并在冰冷的PBS中洗滌3次(3min，550g)。將收集的細胞冷凍在液氮中，或立即進一步加工。為了細胞裂解，將細胞沉淀重新懸浮于10ml CZ裂解緩沖液(50mM Tris-Cl，pH 7.4；5％甘油；0,2％IGEPAL；1.5mM MgCl2；100mM NaCl；25mM NaF；1mM Na3VO4；1mM DTT；每25ml緩沖液含有1片無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTM，Roche))，并通過用緊密配合的杵在dounce勻漿器中沖擊10次進行勻漿。將裂解物在冰上溫育30min，以20,000g離心10min。以100,000g，將上清液進行另外的超速離心步驟1h。回收上清液，并迅速冷凍在液氮中，或立即進一步加工。
4.2膜蛋白的裂解物制備用細胞刮刀，收獲約1×109貼壁細胞(平均)，并在冰冷的PBS中洗滌3次(3min，550g)。將收集的細胞冷凍在液氮中，或立即進一步加工。為了細胞裂解，將細胞沉淀重新懸浮于10ml膜-裂解緩沖液(50mM Tris，pH 7.4；7.5％甘油；1mM EDTA；150mM NaCl；25mM NaF；1mM Na3VO4；1mM DTT；每25ml緩沖液含有1片無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTM，Roche))，并通過用緊密配合的杵在dounce勻漿器中沖擊10次，進行勻漿。以750g離心裂解物10min，回收上清液，并以100,000g進行超速離心步驟1h。將膜沉淀重新懸浮于7,5ml含有0.8％正十二烷基-β-D-麥芽苷的膜-裂解緩沖液中，在恒定攪拌下，在4℃溫育1h。以100,000g，將樣品進行另一個超速離心步驟1h，并將溶解的物質迅速冷凍在液氮中，或立即進一步加工。
4.3核蛋白的裂解物制備用細胞刮刀，收獲約1×109貼壁細胞(平均)，并在冰冷的PBS中洗滌3次(3min，550g)。將收集的細胞冷凍在液氮中，或立即進一步加工。為了細胞裂解，將細胞沉淀重新懸浮于10ml低滲的-裂解緩沖液(10mM Tris，pH 7.4；1.5mM MgCl2；10mM KCl；25mM NaF；1mM Na3VO4；1mM DTT；每25ml緩沖液含有1片無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTM，Roche))，并通過用緊密配合的杵在dounce勻漿器中沖擊10次，進行勻漿。以2,000g離心裂解物10min，將得到的上清液(S1)保藏在冰上。將核沉淀(P1)重新懸浮于5ml核-裂解緩沖液(50mM Tris，pH 7.4；1.5mM MgCl2；20％甘油；420mMNaCl；25mM NaF；1mM Na3VO4；1mM DTT；每25ml緩沖液含有1片無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTM，Roche))，并在冰上溫育30min。將樣品與S1合并，用7ml稀釋緩沖液(110mM Tris，pH 7.4；0.7％NP40；1.5mM MgCl2；25mM NaF；1mM Na3VO4；1mMDTT)進一步稀釋，并在冰上溫育10min，以100,000g離心1h。將最后的上清液(S2)迅速冷凍在液氮中。
4.4串連親和純化在37℃水浴，迅速解凍冷凍的裂解物，并以100,000g離20min。回收上清液，在恒定攪拌下，在4℃，與0.2ml沉降的兔IgG-瓊脂糖珠子(Sigma)一起溫育2h。用10ml CZ裂解緩沖液(每50ml緩沖液含有1片CompleteTM片劑(Roche))洗滌固定化的蛋白復合物，并用5ml TEV剪切緩沖液(10mM Tris，pH 7.4；100mM NaCl；0.1％IGEPAL；0.5mM EDTA；1mM DTT)進一步洗滌。通過與5μl TEV蛋白酶(GibcoBRL，Cat.No.10127-017)在16℃、在150μl TEV剪切緩沖液中溫育1小時，洗脫蛋白-復合物。回收洗脫物，與在0.2ml CBP結合緩沖液(10mM Tris，pH 7.4；100mM NaCl；0,1％IGEPAL；2mM MgAc；2mM 咪唑；1mM DTT；4mM CaCl2)中的0.2ml沉降的鈣調蛋白親和珠子(Stratagene)合并，隨后在恒定攪拌下，在4℃溫育1小時。用10ml CBP洗滌緩沖液(10mM Tris，pH 7.4；100mM NaCl；0,1％IGEPAL；1mM MgAc；1mM咪唑；1mM DTT；2mM CaCl2)洗滌固定化的蛋白復合物，并通過添加600μl CBP洗脫緩沖液(10mM Tris，pH 8.0；5mMEGTA)，在37℃洗脫5min。在硅化的試管中回收洗脫物并凍干。在50μl 4x Laemmli樣品緩沖液中，煮沸剩余的鈣調蛋白樹脂5min。分離樣品緩沖液，與凍干的級分合并，并裝載到NuPAGE梯度凝膠(Invitrogen，4-12％，1.5mm，10孔)上。
第5部分質譜法鑒別蛋白5.1質譜法分析之前的蛋白消化基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68850-858所述的方法，將凝膠分離的蛋白還原，烷基化并在凝膠中消化。簡而言之，使用干凈的解剖刀，從凝膠切下凝膠分離的蛋白，使用10mM DTT(在5mM碳酸氫銨中，54℃，45min)還原，隨后用55mM碘乙酰胺(在5mM碳酸氫銨中)在室溫、在黑暗中烷基化(30min)。在5mM碳酸氫銨中以12.5ng/μl的蛋白酶濃度，用豬胰蛋白酶(Promega)在凝膠中消化經還原且烷基化的蛋白。在37℃，進行消化4小時，隨后使用5μl 5％甲酸終止反應。
5.2質譜法分析之前的樣品制備用20μl 1％TFA提取凝膠塞2次，并與酸化的消化上清液合并。在真空離心機中干燥樣品，并重新懸浮于13μl 1％TFA。
5.3.質譜數據獲取將肽樣品注射進毫微LC系統(CapLC，Waters或Ultimate，Dionex)，后者直接連接到四極TOF(QTOF2，QTOF Ultima，QTOF Micro，Micromass或QSTAR Pulsar，Sciex)或離子阱(LCQ Deca XP)質譜儀。使用水性和有機溶劑的梯度(見下面)，在LC系統上分離肽。溶劑A是在0.5％甲酸中的5％乙腈，溶劑B是在0.5％甲酸中的70％乙腈。
表1在質譜儀中，部分地測序從LC系統洗脫的肽
5.4.蛋白鑒別使用在LC-MS/MS實驗中產生的肽質量和斷裂(fragmentation)數據，查詢fasta格式化的蛋白和核苷酸序列數據庫，其由NCBI(對于NCBInr，dbEST以及人和小鼠基因組)和歐洲生物信息研究所(EBI，對于人，小鼠，果蠅和美麗線蟲蛋白質組數據庫)維持和定期更新。使用軟件工具Mascot(Matrix Science；Perkins等，1999，Electrophoresis 203551-3567)，通過將測量的肽質量和斷裂數據與從數據庫中的輸入條目計算的相同數據相關聯，鑒別蛋白。搜索標準隨使用哪個質譜儀進行分析而變化。
實施例2SiRNA-介導的ATP7A的knock-down已發現，類似于針對已知的APP加工的效應物BACE1和nicastrin的siRNA，靶向ATP7A的siRNA會造成Aβ1-42分泌的顯著弱化，而Luc3 siRNA沒有作用(

圖1A)，這證實了ATP7A在調節APP的加工/分泌中起功能作用。
進一步證實，ATP7A-siRNA實際上確實干擾ATP7A的表達(圖1B)。
2.1 siRNA knock-down和細胞Aβ1-42測定采用RNAi基因表達干擾策略，進行ATP7A作為APP加工的效應物的功能驗證將針對ATP7A的siRNA A和B，或針對APP加工的已知效應物BACE1或nicastrin的siRNA，或針對無關的Luc3的siRNA，轉染進表達人APP695的SK-N-BE2成神經細胞瘤細胞。由DharmaconResearch Inc.合成人ATP7A的SiRNA。
為ATP7A使用的siRNA的序列是AAAGCAGATTGAAGCTATGGG(A)和AACACAGAGGGATCCTATACT(B).
按照生產商的說明書，使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)，進行SK-N-BE2細胞的轉染。簡而言之，轉染前12-16小時，以1.0×104細胞的密度，將細胞接種到85μl終體積/96-孔。將25nM siRNA與8μl Opti-MEM緩沖液(Gibco)和60ng載體DNA相混合，并在室溫溫育混合物20分鐘，然后加入細胞。轉染后16和48小時，將培養基分別替換為100μl或200μl有或沒有血清的生長培養基。轉染后72小時，收獲100μl上清液用于Aβ1-42 ELISA(Innogenetics)。按照生產商的說明書，進行該測定。
通過定量RT-PCR，評估選擇的siRNA的Knockdown效率。簡而言之，平板接種5×10°5 SKNBE2細胞/6-孔，并在次日用25nM siRNA轉染。轉染后36h，收獲細胞，制備總RNA，并使用標準方法進行反轉錄。按照生產商的說明書，使用等量的cDNA和ATP7A-特異性的引物，檢測ATP7A的相對表達水平。所有值都相對于人參照RNA(Stratagene)標準化。
實施例3ATP7A活性的測定3.1酵母中的功能互補測定在Ccc2p功能受損的釀酒酵母菌株中，亞鐵氧化酶Fet3p是功能障礙的，導致鐵-缺乏表型。人銅轉運ATP酶例如ATP7B(His等，2004)或ATP7A的表達，能彌補該表型。結果，通過測量鐵-缺乏表型的功能互補的程度，即通過定量酵母細胞在鐵-限制的培養基中生長的能力，可以定量ATP7A的活性。
因而，通過它們對抗所述功能互補的能力，即通過它們在鐵-限制的培養基中停止生長的能力，可以鑒別ATP7A的抑制劑。
3.2檢測在表達ATP7A的ccc2p-缺陷型酵母中的亞鐵氧化酶活性除了上述的表型方案外，也可以在ccc2p-缺陷型酵母菌株中測量亞鐵氧化酶活性作為銅轉運功能的更敏感的指標(Hsi等，2004)，以定量ATP7A活性。
3.3測量ATP酶活性本領域的技術人員從公知領域可以得到幾種測定。例如，在37℃，通過丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶-偶聯的測定或通過比色法，后者測量在固定的時間間隔的磷酸釋放(Hou等，2001和其中的文獻)，測定ATP7A(例如，通過純化TAP-ATP7A得到)的金屬離子-依賴性的ATP酶活性。
3.4測量對銅-誘導的毒性的敏感性通過測量細胞銅外流或通過定量細胞對銅(而不是對其它金屬)的敏感性(Hou等，2001)，也可以測定ATP7A的活性。
因而，將ATP7A的抑制劑鑒別為能減弱細胞銅外流、改變細胞對銅(而不是對其它金屬)的敏感性的試劑(Hou等，2001)。
3.564Cu蓄積的穩態測量通過測量胞內銅(優選地64Cu)蓄積(Bellingham等，2004)，也可以測定ATP7A的活性。
可以將ATP7A的抑制劑鑒別為能造成胞內銅(優選64Cu)蓄積的試劑(Bellingham等，2004)。
實施例4ATP7A調控劑對Aβ1-42產生/分泌的調控將穩定地過表達人APP695的SKNBE2細胞(SKNBE2/APP695)(或另一種合適的細胞系)，或具有增強的β-/γ-分泌酶剪切動力學的合適的突變體，平板接種在生長培養基中，并在次日早晨血清-剝奪(serum-starved)4小時。然后，加入在無血清培養基中稀釋的ATP7A調控劑，優選抑制劑，并溫育合適的時間段。收集細胞上清液，并通過ELISA(Innotestβ-淀粉樣蛋白(1-42)，購自INNOGENETICS N.V.，BelgiumInnogenetics)，測定Aβ1-42的水平。
下面的附圖更詳細地描述了本發明圖1siRNA-介導的ATP7A表達的knock-down減弱Aβ1-42的分泌圖1A將針對BACE1，nicastrin，ATP7A(siRNA A或siRNA B)或Luc3的SiRNA，轉染進過表達APP695的SK-N-BE2成神經細胞瘤細胞。轉染后48h，去除生長培養基，并在無血清的培養基中培養細胞過夜。收集上清液，通過ELISA(Innogenetics)測定Aβ1-42的水平。一式兩份地進行至少3次獨立實驗。顯示了代表性的實施例。
Fig.1B針對ATP7A的SiRNA(siRNA A和siRNA B)，而不是針對無關的Luc3的siRNA，能特異性地減少ATP7A-mRNA，如通過定量RT-PCR分析所評估的。為每個siRNA顯示的2個條柱代表著2次獨立實驗。
圖2以單字母密碼描繪的人ATP7A(銅轉運ATP酶1)的氨基酸序列。
圖3人ATP7A和ATP7B的多序列比對。
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權利要求
1.ATP7A-相互作用分子在制備用于治療神經變性疾病的藥物組合物中的應用。
2.權利要求1的應用，其中所述ATP7A-相互作用分子是ATP7A-抑制劑。
3.權利要求2的應用，其中所述抑制劑選自抗體，反義寡核苷酸，siRNA，低分子量分子(LMW)，結合肽，適體，核酶和肽模擬物。
4.權利要求1-3中的任一項的應用，其中ATP7A是胞內蛋白復合物的一部分。
5.權利要求1-4中的任一項的應用，其中所述相互作用分子或抑制劑調控γ-分泌酶和/或β-分泌酶的活性。
6.權利要求1-5中的任一項的應用，其中所述神經變性疾病是阿爾茨海默氏病。
7.鑒別γ-分泌酶和/或β-分泌酶調控劑的方法，其包括下述步驟a.通過檢測給定的實驗化合物是否是ATP7A-相互作用分子，鑒別ATP7A-相互作用分子，b.確定步驟a)的ATP7A-相互作用分子是否能調控γ-分泌酶和/或β-分泌酶活性。
8.權利要求7的方法，其中在步驟a)中，使實驗化合物接觸ATP7A，并檢測ATP7A與實驗化合物的相互作用。
9.權利要求8的方法，其中所述實驗化合物與ATP7A的相互作用導致對ATP7A活性的抑制。
10.權利要求7-9中的任一項的方法，其中在步驟b)中，測量γ-分泌酶和/或β-分泌酶剪切APP的能力，優選地，其中測量生成Aβ42的能力。
11.制備用于治療神經變性疾病的藥物組合物的方法，其包括下述步驟a.根據權利要求7-10，鑒別γ-分泌酶和/或β-分泌酶調控劑，和b.將所述γ-分泌酶和/或β-分泌酶調控劑配制成藥物組合物。
12.權利要求11的方法，還包括混合鑒別的分子和藥學上可接受的載體的步驟。
13.藥物組合物，其包含權利要求1-5任一項中所定義的ATP7A-抑制劑。
14.可通過根據權利要求11或12中的任一項的方法得到的藥物組合物。
15.根據權利要求13或14中的任一項的藥物組合物，其用于治療神經變性疾病例如阿爾茨海默氏病和有關的神經變性障礙。
16.治療或預防神經變性疾病、優選阿爾茨海默氏病的方法，向需要這樣的治療或預防的對象施用治療有效量的權利要求13-15中的任一項的藥物組合物。
17.ATP7A-相互作用分子在體外調控β-分泌酶和/或γ-分泌酶活性的應用。
全文摘要
本發明涉及ATP7A－相互作用分子在制備用于治療神經變性疾病的藥物組合物中的應用。其中ATP7A－相互作用分子優選地是ATP7A的抑制劑，尤其是，它具有調控γ－分泌酶和/或β－分泌酶的活性的能力。而且，本發明涉及鑒別γ－分泌酶和/或β－分泌酶調控劑的方法，其包括下述步驟a)通過檢測給定的實驗化合物是否是ATP7A－相互作用分子，鑒別ATP7A－相互作用分子；b)確定步驟a)的ATP7A－相互作用分子是否能調控γ－分泌酶和/或β－分泌酶活性。
文檔編號A61K31/713GK1934251SQ200480042299
公開日2007年3月21日 申請日期2004年11月29日 優先權日2004年1月29日
發明者C·霍普, G·德維斯, H·魯夫尼爾 申請人:塞爾卓姆股份公司