專利名稱：一種siRNA在制備調控腫瘤細胞分裂周期藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一個生存素survivin基因為靶標的小分子干擾RNA(siRNA)在制備調控腫瘤細胞周期藥物中的用途。

背景技術：
RNA干擾技術(RNAi)是近幾年發展起來的被認為是研究功能基因組最有力工具之一。這種新興的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)介導的轉錄后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)現象。通過在多種生物細胞內導入外源或內源的dsRNA可以使內源性mRNA發生特異性降解，從而引起相應基因轉錄的阻抑。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。惡性腫瘤是當前威脅人類生命健康的主要殺手之一，目前還沒有找到真正有效的根治方法，這迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖從根本上攻克癌癥。
Survivin是1997年耶魯大學Aitieric.DC等人在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一個成員。它定位于17q25，該基因幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達，而正常組織幾乎沒有表達；該基因在腫瘤細胞中高表達后，不但促進腫瘤細胞抗凋亡、促進腫瘤細胞有絲分裂、參與血管形成和放化療耐受多種功能，而引起了國內外學者的廣泛關注。
有研究者(.Lab Invest，1999，79(11)1327-1333；Am J Pathol，1998，152(1)43-49)對正常增殖細胞中survivin基因的潛在分布進行研究發現包括皮膚表面的角化細胞、腸道的上皮細胞和正常的骨髓細胞在內，在各種有絲分裂細胞系中均沒有檢測到survivin基因的表達；survivin具有在腫瘤組織中表達特異性強、表達率高，而在正常組織中不表達的特點以及在腫瘤的發生、發展及抗藥性等諸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成為腫瘤基因治療理想的新靶點。
腫瘤的難治還在于腫瘤的天然耐藥以及后期治療時產生的耐受。腫瘤本身高表達survivin能保護化療藥和放射線對腫瘤的殺傷相反，不足量的化療藥或放射線也能誘導survivin的表達，產生對治療的繼發耐受。研究表明，survivin能抑制某些化療藥物、IL-3，TNF-a，X射線誘導的Fas，Caspase，Bax等參與的凋亡信號通路(Cancer Res，1998，58(23)5315-5320；J CancerRes，2000，91(11)1204-1209)。但假如其唯一的BIR區發生C84A的突變，survivin也就喪失對抗化療藥物Taxol誘導的凋亡的抵抗作用。
血管形成過程取決于血管內皮細胞生存和凋亡的平衡。正常情況下，血管內皮細胞中很難檢測到survivin。在血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下，靜止的血管內皮表達survivin的能力約可增強4倍，VEGF的許多抗凋亡活性都是通過誘導內皮細胞表達survivin來實現的(Am J Pathol，2001，158(5)1757-1765)。血管生成素一1(angiopoietin-1，Ang-1)是胚胎血管形成過程中維持血管穩定性和管腔形成的關鍵因子。它沒有促進內皮細胞生長，而只促進了血管網的穩定和分枝血管的形成。研究發現，Ang-1可以促進內皮細胞中survivin表達，通過Akt(或蛋白激酶B)途徑激活survivin的抗凋亡活性，從而阻止內皮細胞凋亡，在體內血管形成過程中穩定血管結構(J Biol Chem，2000，275(3)9102-9105)。新血管生成是腫瘤生長和轉移的必要因素，因此抑制survivin的表達可能對防止腫瘤細胞的浸潤、遷移起重要作用。己有多項動物實驗證明，反義survivin RNA或survivin突變體可以有效抑制實體瘤的血管形成和腫瘤的侵襲增殖。因此，survivin基因可以作為腫瘤治療的新靶點。
最早的針對survivin的RNAi研究報導于2003年，Carvalho等用小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)轉染HeLa細胞，60h后蛋白印跡結果顯示治療組中己檢測不到survivin的表達，細胞增殖明顯受抑，部分細胞有絲分裂受到阻滯，出現凋亡(J Cell Sci，2003，116(14)2987-2998)。隨著RNAi技術的不斷完善，由原來直接導入外源的siRNA，發展到真核表達載體轉錄產生siRNA，以及用于RNAi的病毒載體的出現，大大提高了轉染效率和干擾效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核載體轉染肝細胞癌SMMC7721細胞，發現轉染細胞中幾乎沒有survivin基因的表達，轉染細胞自發的凋亡增加，G2/M期細胞比例減少，細胞增殖減慢(World J Gastroenterol 2005，11(5)756-759)。目前針對survivin的RNAi研究進展迅速，體外實驗顯示了良好的效果，相信不遠的將來會有更為豐富和完善的研究結果出現。
應用RNA干擾技術，以小分子RNA作為靶向藥物，有針對性地對survivin基因的轉錄后表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，多層次，多途徑對腫瘤進行抑制，這可能成為了一種新的腫瘤治療策略。而且survivin基因選擇性地表達在幾乎所有種類的腫瘤組織中，而正常組織幾乎不表達，則可使這種基因治療對正常組織和細胞的毒副作用降到最低，應用RNAi特異地抑制survivin等腫瘤相關基因的表達有望成為一種新的腫瘤基因治療方式。


發明內容
本發明公開了一種高效的針對survivin基因的廣譜的小分子干擾RNA(siRNA)調控腫瘤細胞分裂周期藥物，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成 正義鏈5′-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′， 反義鏈3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′ 其中X代表tt、TT或UU。t代表脫氧胸腺嘧啶dT。
X優選代表tt。
本發明的小分子干擾RNA是主要針對survivin基因開放閱讀框(ORF)的功能保守區設計的雙鏈siRNA，藥理試驗證明本發明的小分子干擾RNA具有廣譜的抗腫瘤作用，對肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞在體外均有抑制作用，該序列的正義鏈與survivin基因的mRNA結合，干擾survivin基因mRNA的翻譯，從而抑制腫瘤細胞分裂，使腫瘤細胞分裂阻滯在G2/M期，達到治療腫瘤的目的。本發明是一種全新作用機制的抗腫瘤新型藥物，可能為腫瘤的治療帶來了新的希望。
本發明所述的腫瘤疾病包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞。
在臨床使用中，可以將本發明小分子干擾RNA(簡稱CPUsiRNA4)溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，建議CPUsiRNA4為10微克/微升。取適量CPUsiRNA4與小分子干擾RNA轉染試劑RNAi-Mate混合，在室溫溫育30分鐘，以形成CPUsiRNA4-RNAi-Mate復合物。將制備好的CPUsiRNA4-RNAi-Mate復合物按5-500nmol/kg靜脈給藥，一天一次，20天左右一個療程。



圖1是PCR檢測本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株SMMC7721和宮頸癌細胞株Hela的survivin基因的mRNA水平的抑制 圖2是Westernblot檢測本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株SMMC7721和宮頸癌細胞株Hela的Survivin蛋白質的抑制 圖3是流式細胞儀檢測本發明小分子干擾RNA抑制肺癌細胞株A549、肝癌細胞株SMMC7721和宮頸癌細胞株Hela分裂，使它們阻滯在G2/M期
具體實施例方式 實施例1 siRNA的設計與合成 儀器OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司)，DU2640紫外分光光度計(美國Backman公司)。
材料和試劑合成柱(6.3mL)，分子篩(3A Sigma)，30HL載體(批號256723)，RNA Pac PA100分析柱(美國Dionex公司)，5種核苷酸單體(A，U，C，G，dT)，乙腈，二氯乙酸，四唑，N2甲基咪唑，除注明廠家外，其余為瑞典Pharmacia公司產品。
siRNA的設計根據survivin基因開放閱讀框(ORF)的序列，設計小分子干擾RNACPUsiRNA4和1對負對照siRNA，將他們的序列在人類EST數據庫中比對，確定沒有與他們相同的其它基因序列。CPUsiRNA4正義鏈5′-AGCAUUCGUCCGGUUGCGCtt-3′，反義鏈3′-ttUCGUAAGCAGGCCAACGCG-5′。負對照siRNA的正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。siRNA的設計后送上海吉馬公司合成。
siRNA的化學合成用乙腈將5種單體(A，U，C，G，dT)配制成0.2mol/L溶液，分別將5種單體、乙腈、二氯乙酸、四唑安裝到合成儀相應位置，其中單體、乙腈、四唑應加入適當分子篩。合成步驟(1)利用二氯乙酸處理結合于固相載體的核苷酸或寡核苷酸，脫去其5’羥基官能團上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保護基團，露出反應性的5’端；(2)偶聯反應由四唑催化完成，形成3’→5’磷酸酯鏈；(3)封閉反應將未反應5’羥基在N2甲基咪唑催化下由乙酸酐來完成。RNA合成儀按照設計好的程序合成出CPUsiRNA4和負對照siRNA的單鏈RNA。應用紫外分光光度計檢測D 260nm值，并計算產量。
合成粗產品的HPLC色譜分析色譜柱DNA 2Pac PA 2100(4mm×250mm)；樣品20OD/m L，進樣的量20μL；流動相A25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，10％乙腈，pH8；流動相B25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，3mol/L NH4Cl，pH 8；洗脫梯度流動相B在40min內從10％到70％；流速1mL/min；檢測波長260nm；柱溫50℃。
合成的單鏈RNA的正義鏈和反義鏈后，退火成雙鏈的CPUsiRNA4和負對照siRNA，之后進行HPLC純化的純度大于97％的雙鏈CPUsiRNA4和負對照siRNA。
實施例2 抗腫瘤藥效學試驗 材料和方法 肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela細胞株由本實驗室保存，轉染試劑Lipofectamin TM 2000購自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，dNTP、DNA Marker和蛋白質Marker購于Takara公司。Survivin蛋白的兔抗人抗體，HRP-羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒購于武漢博士德公司。
細胞培養肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela細胞株在含10％胎牛血清的RPMI1640培養液中，37℃，5％ CO2的培養箱中培養。
MTT法將2.5×106/L細胞接種于96孔板，每孔180μl，每組平行3孔，并設立空白，陰性藥對照。44h后，棄去上清，每孔加20μL新配制的5g/L MTT，孵育4h，棄去上清液，加150μL DMSO溶解，混勻后用Bio-Rad型號的酶標儀490nm波長測定。
RT-PCR按Trizol說明書進行培養細胞總RNA抽提RT采用說明書M-MLV逆轉錄酶體系，PCR擴增采用20μL反應體系。PCR擴增條件為94℃變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25個循環。
Westernblot檢測干擾效應轉染后48h取出六孔板，吸干RPMI-1640培養液，加入500μL胰酶的溶液，待細胞消化后加入1mL PBS溶液，反復吹打將細胞沖下來，把細胞懸液轉入1.5mL EP管中，1000r/min離心5min收集細胞沉淀，加入60μL預冷的細胞裂解液，反復吹打將細胞充分混勻，冰浴中放置40min，10000r/min 4℃離心10min，取上清置于-70℃保存。蛋白的分離采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，12％的分離膠和5％的濃縮膠，細胞蛋白采用稀釋的5×蛋白質的上樣緩沖溶液，經100℃ 4min變性后加樣，上樣量均為20μL，恒壓120V至溴酚藍遷移至凝膠底部，取下凝膠，置轉膜緩沖液中平衡10min，覆蓋經處理的PVDF膜，采用半干轉移系統，按1毫安/每平方厘米恒流轉移3h將蛋白轉移至膜上，將PVDF膜置于含10％小牛血清的1×PBS溶液中4℃封閉1小時，取出PVDF膜后在適當位置剪開(根據目的蛋白和對照蛋白大致的電泳位置)，分別加入用含0.1％小牛血清白蛋白1×PBST溶液作1∶1000稀釋Survivin蛋白的一抗室溫振蕩孵育10h，用大量的PBST溶液洗滌三次，每次10min，再加入用含10％小牛血清的1×PBST溶液作1∶1000稀釋的Survivin蛋白的二抗，室溫振蕩孵育1h，用大量的PBST洗滌三次，每次10min。吸干膜上的溶液，加入DAB顯色液，顯色5min。
流式細胞術檢測細胞周期變化轉染方法同前，轉染干擾載體48h后，細胞用胰蛋白酶消化后1min，PBS洗兩遍，加入1mL乙醇固定過夜，去乙醇，PBS洗兩遍，加入100μL濃度為10μg/mL的PI，混勻后室溫避光孵育30min，在反應管中加400μL PBS，上機檢測細胞周期變化。
統計學處理統計結果以.x±s表示，用SPSS13.0統計學軟件進行分析，數據兩兩比較采用配對資料t檢驗，多組之間比較用ANOVA進行。
結果 細胞分裂的抑制 本發明的小分子干擾RNA作用后的腫瘤細胞株肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela分裂明顯減少、細胞的生長也受到明顯抑制，小分子干擾RNA CPUsiRNA4在12.5nM至400nM對肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela的抑制作用逐漸增強，CPUsiRNA4作用48小時后，MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑制率結果，見表1。用臨床上常用的抗腫瘤的順鉑作為CPUsiRNA4的藥效對照藥物，順鉑在5μM至80μM對腫瘤肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela的抑制作用逐漸增強，作用48小時后，MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑制率結果，見表2。
表1 CPUsiRNA4作用于腫瘤細胞48小時的抑制率
n＝6，mean±SD，重復3次，*為P<0.05(有顯著差異)；**為P<0.01(有極顯著差異) 表2 順鉑作用于腫瘤細胞48小時的抑制率
n＝6，mean±SD，重復3次，*為P<0.05(有顯著差異)；**為P<0.01(有極顯著差異) RT-PCR檢測survivin基因的mRNA的轉錄 見圖1，圖中第1，2，3泳道分別是沒加藥的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的RT-PCR檢測結果，第4，5，6泳道是分別是加了有效的本發明的小分干擾RNA siRNA4 100nM 48小時的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的RT-PCR檢測結果。雖然它們都能擴增出450bpsurvivin基因的帶，但4，5，6泳道的條帶明顯更淡，這表明survivin基因在mRNA的轉錄受到了一定的抑制。
Western blot檢測小分干擾RNA對survivin表達的抑制情況 見圖2，圖中第1，2，3泳道分別是沒加藥的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的Westernblot檢測結果，第4，5，6泳道是分別是加了本發明小分干擾RNA siRNA4 100nM 48小時的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的Westernblot檢測結果。雖然它們都能印出15kD的Survivin蛋白的帶，但4，5，6泳道的條帶明顯更淡，這表明survivin基因在蛋白質的翻譯受到了一定的抑制。
流式細胞儀檢測細胞周期變化的實驗結果 圖3中，a，b，c分別是沒加藥的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的流式細胞儀檢測細胞周期變化的實驗結果，d，e，f泳道是分別是加了本發明的小分干擾RNA siRNA4 50nM 48小時的腫瘤A549、SMMC7721和Hela細胞的流式細胞儀檢測細胞周期變化的實驗結果。轉染的小分干擾RNA CPUsiRNA4 50nM 48小時后，用流式細胞儀檢測細胞周期變化顯示腫瘤細胞A549、Be17402和HL60分裂明顯受到抑制，分別有37.6％、30.1％和20.1％的細胞被阻滯在G2/M期。
一種siRNA在制備調控腫瘤細胞周期藥物中的用途
<110>申請人姓名宜春學院
<120>發明名稱一種siRNA在制備調控腫瘤細胞周期藥物中的用途
<160>序列表中序列的個數6
<210>序列相對應的序列標識符1
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符1
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt
<210>序列相對應的序列標識符2
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符2
GCAACCGGACGAAUGCUUUtt
<210>序列相對應的序列標識符3
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符3
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCTT
<210>序列相對應的序列標識符4
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符4
GCAACCGGACGAAUGCUUUTT
<210>序列相對應的序列標識符5
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符5
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCUU
<210>序列相對應的序列標識符6
<211>序列長度21
<212>序列的類型RNA
<213>生物體人工序列
<400>序列標識符6
GCAACCGGACGAAUGCUUUUU
權利要求
1、一種雙鏈小分子干擾RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成
正義鏈5′-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′，
反義鏈3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′
其中X代表tt、TT或UU。
2、權利要求1的雙鏈小分子干擾RNA，其中X代表tt，t為脫氧胸腺嘧啶。
3、權利要求1或要求2的雙鏈小分子干擾RNA在制備調控腫瘤細胞周期藥物中的用途。
4、權利要求3的用途，其中腫瘤是肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞。
全文摘要
本發明涉及一種小分子干擾RNA在制備調控腫瘤細胞分裂周期藥物中的用途，這種小分子干擾RNA可以沉沒survivin基因表達，高效的調控肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞的周期，顯著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌細胞的細胞分裂。這種小分子干擾RNA可以制備抑制腫瘤細胞分裂的藥物。
文檔編號C07H21/02GK101456887SQ20081013660
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月24日 優先權日2008年12月24日
發明者陸云華 申請人:宜春學院