專利名稱：調控調節性t細胞活性的方法及組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及調控與調控生物體內免疫功能相關的調節性T細胞活性的方法，特別涉及具有所述調控活性的組合物。
現有技術人具備排除外來異物的生物防御功能，同時耐受自身成分，通過B淋巴細胞、T淋巴細胞、抗體和抗原呈遞細胞(APC)間的相互作用誘導和調控這些免疫應答。首先，外來抗原經APC加工，與主要組織相容性復合體(MHC)I類分子和II類分子結合，呈遞給輔助性T細胞。輔助性T細胞識別與MHC分子結合的外來抗原，使T細胞活化，分泌細胞因子；有助于經抗原刺激的B細胞向抗體產生細胞分化，同時也促進殺傷性T細胞的分化。
通過分泌的抗體及活化的殺傷性T細胞排除抗原呈遞細胞，由此進行排除外來抗原的細胞性、體液性免疫反應。也就是說，T細胞起著核心作用，發動識別靶抗原的免疫應答。例如，人們很早就知道，在抗腫瘤的免疫應答中，CD4+T細胞和CD8+T細胞發揮著相當重要的作用。(L.Gross.Cancer Res.3326-333(1943)；L.Old等，Ann.N.Y.Acad.Sci.10180-106(1962)；R.J.North，Adv.Immunol.3589-155(1984)；P.D.Greenberg，Adv.Immunol.49281-355(1991)；D.M.Pardoll and S.L.Topalian，Curr.Opin.Immunol.10588-594(1998))。
CD8+CTL(細胞毒性T cell)是主要的效應細胞，無論在體內還是在體外均持有直接破壞腫瘤細胞的能力，但是它對呈遞給MHC I的抗原肽有嚴格的特異性，與此相反，自然殺傷性T(NKT)細胞受抗原特異性的制約相對較弱，它被認為是固有性免疫應答的效應細胞(M.J.Smyth等，J.Exp.Med.191661-668(2000)；M.J.Smyth &D.I.Godfray.Nature Immunol.1459-460；M.J.Smyth等，Curr.Opin.Immunol.14165-171(2002)；T.Kawano等，Proc.natl.Acad.Sci.USA955690-5693(1998))。另一方面，CD4+T細胞不直接破壞腫瘤細胞，但發揮著通過多種機制調節抗腫瘤免疫應答的基本作用(K.Huang等，J.Exp.Med.1882357-2368(1998)；F.Ossendorp等，J.Exp.Med.187693-702(1998)；D.M.Pardoll & S.L.Toplian，Curr.Opin.Immunol.10588-594(1998)；R..F.Wang，Trends.Immunol.5269-276(2001))。識別呈遞給MHC II分子的腫瘤抗原肽的CD4+輔助性T細胞通過與抗原呈遞細胞(APC)間的相互作用CTL的活化、增殖作用得以放大。與此相反，CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)卻顯示出對抑制抗腫瘤免疫應答和各種自身免疫性疾病發展的有效性(E.M.Schvach，Annu.Rev.Immunol.18423-449(2000)；M.G.Roncarolo & M.K.Levings.Curr.Opin.Immunol.12676-683(2000)；J.Schimizu et al，J.Immunol.1635211-5218(1999)；S.Sakaguchi等Immunol.Rev.18218-32(2001))。但是，目前尚不清楚Treg所識別的自身抗原肽是什么、在抗原識別與功能上Treg與輔助性T細胞的差異和關系又如何(S.Sakaguchi，Nature Immunol.2283-284(2001)；K.J.Maloy & F.Powrie，Nature Immunol.2816-822(2001)；E.M.Shevach，Nature Rev.Immunol.6389-400(2002))。
在CTL的定量及定性擴增中，輔助性T細胞、CTL及APC間連續的細胞間相互作用，提示與抗腫瘤免疫應答相關的輔助性T細胞可能廣泛識別多種抗原(J.P.Ridge等，Nature 393474-478(1998)；S.R.M.Bennett等，Nature 393478-480(1998)；S.P.Schoenberger等，Nature 393480-483(1998)；Z.Lu等，J.Exp.Med.191541-550(2000))。本發明者們發現，通過將CTL識別抗原與SEREX(重組cDNA表達克隆抗原的血清學分析)抗原一起施用能極大地增強CTL活性、且能誘導強大的抗腫瘤能力(H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814571-14576(2001)；WO 03/000894 A1)。由此完成了與表達腫瘤特異性免疫的疫苗相關的發明(WO 03/000894 A1)，其中用包含CD4+輔助性抗原、優選用SEREX法發現的分子，及CD8+CTL識別的抗原、優選編碼腫瘤抗原的表達載體的組合物作為多核苷酸疫苗。
已經闡明，CD4+CD25+T調節性細胞通常以功能成熟的狀態在正常的胸腺中產生，但其通常處于不反應狀態，隨著T細胞受體(TCR)的刺激傳入其可強烈地抑制其它T細胞的活化、增殖，此過程中通過組成型表達的CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)分子和GITR(糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子家族)分子介導的刺激傳遞對抑制能力的表達是必要的(T.Takahashi等，J.Exp.Med.192303-310(2000)；S.Read等，J.Exp.Med.192295-302(2000)；J.Shimizu等，Nature Immunol.3135-142(2002))。一般認為Treg是由具有識別與MHC II結合的自身抗原的多種特異性的細胞構成的，但對識別的抗原尚未進行鑒定，對Treg抑制能力增強的機制也沒有完全搞清。
發明公開小鼠和人等正常個體具有作為針對外來異物的生物屏障的免疫系統，其不攻擊自己。一般認為這種對自身的耐受是由自身反應性免疫細胞的排除、自身反應性免疫細胞的不活化及Treg造成的免疫抑制這3種機制形成的。一旦對自身的耐受受到破壞就會發生自身免疫性疾病，另一方面，這種自身耐受性允許癌細胞的增殖。另外，在臟器和組織移植中，外來抗原的排除機制給移植帶來困難。如今發現免疫系統中Treg對免疫抑制發揮重要作用后，人們殷切期望能開發出針對因免疫異常而引起的疾病，特別是自身免疫性疾病和移植排斥反應、移植物抗宿主反應、過敏性疾病等的，調控Treg活性的方法和藥劑。
本發明者們在將編碼腫瘤抗原的表達載體和編碼SEREX抗原的表達載體施用給荷瘤小鼠觀察其抗腫瘤效果時，觀察到如果只施用編碼SEREX抗原的表達載體，可以觀察到對腫瘤組織的生長和轉移的促進，由此完成了本發明。
本發明提供包含CD4+CD25+調節性T細胞識別的抗原的組合物。另外，提供抑制哺乳動物免疫應答的方法，它包括將上述組合物施用給哺乳動物。還提供預防和/或治療自身免疫性疾病的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動物。還提供上述組合物在制備自身免疫性疾病的預防和/或治療劑中的應用。
還提供過敏性疾病的預防和/或治療的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動物；或提供上述組合物在制備預防和/或治療過敏性疾病的藥劑中的應用。
還提供抑制器官或組織移植中排斥反應和/或移植物抗宿主反應的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動物；或提供上述組合物在制備抑制器官或組織移植中排斥反應和/或移植物抗宿主反應的預防劑和/或治療劑中的應用。
更詳細而言，用SEREX法發現的分子(SEREX抗原)使CD4+CD25+T細胞(調節性T細胞)致敏，增強調節性T細胞的活性，相反，用IFN-γ或同時施用IL-12和IL-18減弱活化了的調節性T細胞的活性，由此構成調節性T細胞活性的調控方法。特別是，作為增強調節性T細胞的活性的組合物，如包含編碼SEREX抗原的表達載體的多核苷酸，所述多核苷酸可單獨使用，也可以固定到載體顆粒上后施用到細胞內。
本發明的目的是，通過人為使用抗原使調節性T細胞致敏，增強其免疫抑制活性，從而實現移植中排斥反應和移植物抗宿主反應的抑制、自身免疫性疾病的抑制及過敏性疾病的抑制，從而對患有這些疾病或具有所述病癥的患者提供有效的治療方法。
本發明涉及用于抑制免疫的方法，它基于這樣的發現通過施用編碼CD4+CD25+T細胞識別的抗原的表達載體，抑制免疫反應。因此，本發明涉及包含CD4+CD25+T細胞識別的抗原或編碼該抗原的表達載體的組合物。詳細言之，CD4+CD25+T細胞所識別的抗原優選用SEREX法發現的分子，該抗原可以是異種抗原，也可以是自身抗原，但優選自身抗原。SEREX法是近年來由M.Pfreundschuh等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941914-1918(1997))開發的方法，是用人血清篩選人腫瘤cDNA表達文庫，在國際互聯網上，用SEREX法鑒定出的基因已經超過1800種(www.licr.Org/SEREX.Html)，作為SEREX數據庫。它們包括但并不限定于，例如，熱休克蛋白DnaJ-like2(GenBank Accession No.NM_005494，XM_028966，XM_172161，XM_052862，XM_052754，XM_093388，NM_016306，NM_012328，NM_005880)、Galectin8(GenBank Accession No.AH008815，AF193806，AF193805)、PolyA結合蛋白[PolyA bindingprotein](GenBank Accession No.XM_0 67844)、連接酶[Ligase]1(GenBank Accession No.NM_000234)等。本說明書中的“SEREX鑒定分子”是指用SEREX法鑒定出的這些分子。
本發明中編碼抗原的多核苷酸，只要根據本發明的方法施用給宿主動物能產生所期望的免疫應答，無其他特殊限制，其可以是DNA或RNA。本發明的編碼抗原的多核苷酸，只要該多核苷酸編碼的多肽在宿主中可產生所期望的免疫應答即可，其核苷酸序列可通過位點特異性突變誘導方法等眾所周知的方法(參照Ausubel等，CurrentProtocols in Moleculor Biology(1987)John Wiley & Sons，Section 8.1-8.5)，人為造成一個或一個以上的氨基酸序列發生缺失、置換、插入、附加。另外，只要是在宿主動物中可產生所期望的免疫應答，可利用眾所周知的雜交技術(參照Ausubel等，Current Protocols in MoleculorBiology(1987)John Wiley & Sons，Section6.3-6.4)和基因擴增技術(PCR)(參照Ausubel等，Current Protocols in MoleculorBiology(1987)John Wiley & Sons，Section6.1-6.4)分離自然界中存在的突變體。
另外，當編碼抗原蛋白質的基因已知時，可分析其蛋白質氨基酸序列上的疏水性/親水性區域(Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.157105-122(1982))、進行二級結構分析(Chou and Fasman，Ann.Rev.Biochem.47251-276(1978))、推算氨基酸序列中的抗原性區域(例如，參照Anal/Biochem.151540-546(1985)，然后合成推定的氨基酸序列的肽，用PEPSCAN法(Nature 314(1985)；特表昭60-500684號公報)確定其抗原性，這些都是本領域技術人員很容易做到的。因此，通過化學合成等手段制備編碼包含根據上述方法確定的表位部分的肽片段的多核苷酸用作本發明的抗原的表達載體。
本發明中所應用的表達載體是整合了CD4+CD25+調節性T細胞所識別的抗原基因的重組載體，作為插入抗原基因的載體可利用，例如質粒、噬菌體、粘粒、病毒及該領域中目前應用的其它載體。本領域技術人員可根據，例如Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1987)John Wiley& Sons等記載的技術構建各種質粒和載體。
這里所用的啟動子、終止子等在宿主內發揮表達調控作用的因子，本領域技術人員可根據宿主的種類和目的從眾所周知的調控序列中選擇，配置到抗原基因的上游和/或下游。因此，既可使用來自抗原的調控序列，也可使用異種調控序列。另外，根據需要本發明的表達載體中也可應用抗生素耐性標記等標記。可利用多種商品化的載體，但本發明中優選除去不必要的多核苷酸序列。
本發明的組合物可作為裸質粒應用，可包裝到脂質體中，或構建形成逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、痘苗病毒載體、豆病毒載體、腺相關病毒載體及HVJ載體等各種病毒載體(例如參照，K.Adolph“病毒基因組法”CRC Press，Florida(1996))，或者包被到膠質金等微珠(載體)上應用。無限制但優選將能表達CD4+CD25+調節性T細胞所識別抗原的載體附著在金粒等載體粒子上，通過基因槍等技術將其導入生物體內。將多核苷酸包被載體粒子的技術眾所周知(例如，參照WO93/17706)。最終可將多核苷酸調整到適于生物體應用的生理鹽水等溶液中。此外，也可并用幫助質粒攝入到細胞內的鈣離子等藥劑。需要時，也可與藥學上可接受的利于轉染的藥劑一起施用。
本發明的組合物可通過任一種方法施用，但優選通過適當的非經口途徑施用，例如靜脈內、腹腔內、皮下、皮內、脂肪組織內、乳腺組織內、吸入或肌肉內注射、注入，或通過氣體誘導性粒子沖擊法(通過電子槍等)、點鼻藥等形式的通過粘膜途徑的方法施用。這些施用方法中，借助加速粒子的基因轉化技術，記載于美國專利第4945050號、第5240842號等中，市場上有售基于其改良方法的裝置(BioradLaboratories)。
本發明中對宿主動物的種類沒有限定，具體而言，包括包含如小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬、羊、牛、馬及猴和人等靈長類在內的哺乳動物，其中更優選人作宿主動物。
發明的詳述本發明中所應用的抗原或表達載體的施用量無限定，根據疾病的種類、程度、性別、年齡、體重、施用途徑而異，但是通常每次施用0.001μg-1g，優選0.01μg-10mg，更優選0.1μg-100μg。
如上所述的實施結果是造成免疫抑制狀態，該狀態可通過應用IFN-γ或將IL-12和IL-18同時施用而解除。也就是說，通過適當聯合這些細胞因子的作用和用SEREX抗原進行致敏作用，可人為操縱調節性T細胞，可適用于自身免疫性疾病、器官移植反應、過敏反應及腫瘤免疫的調控等。
還可通過抗CD4抗體、抗CD25抗體的處理解除免疫抑制狀態。
因此，本發明提供調控調節性T細胞活性的方法及組合物。
本發明通過明確SEREX抗原促進調節性T細胞的免疫抑制活性，首次提出調控調節生T細胞活性的方法。
目前，盡管已開發出多種針對自身免疫性疾病和過敏反應的治療以及針對抑制移植排斥反應和移植物抗宿主反應的治療的手段和藥劑，但其有效性有限，期望超越這些方法和藥劑的有效性。
近年來，CD4+CD25+調節性T細胞在生物體內的重要性越來越明朗，本發明提供調控CD4+CD25+調節性T細胞作用的極其有效的方法和組合物，給與自身免疫性疾病和過敏性疾病的治療、通過器官、組織移植的療法帶來很大的進步。
附圖簡述

圖1表示單獨應用SEREX抗原進行免疫促進肺轉移的圖。
圖2表示單獨應用SEREX抗原進行免疫誘導的促進肺轉移的執行細胞是CD4+細胞或CD4+CD25+細胞，而非CD8+細胞的圖。
圖3表示通過移植從單獨應用SEREX抗原進行免疫的小鼠中獲取的CD4+CD25+T細胞可促進肺轉移的圖。
圖4表示單獨用SEREX抗原進行前處理抑制mERK2抗原特異性的CD8+T細胞的數量。
圖中，9m-pulsed PIHTR是指mERK2 9m抗原蛋白質，p63-71(T)-pulsed PIHTR是指對照的抗原蛋白質。
圖5表示通過應用mERK2或147HER2、Dna J-like2進行免疫而產生的對肺轉移的體內預防和治療效果的圖表。
圖6、圖7、圖8和圖9是實施例4中小鼠背部腫瘤直徑的測定結果。
圖6表示用SEREX鑒定自身抗原Dna J-like2對BALB/c小鼠進行免疫，對C57BL/6來源的黑色素瘤B16的排斥被耽擱，一部分小鼠因腫瘤死亡。
圖7表示用其它SEREX鑒定自身抗原對BALB/c小鼠進行免疫時與Dna J-like2進行免疫時同樣，對C57BL/6來源的黑色素瘤B16的排斥被耽擱，一部分小鼠因腫瘤死亡。
圖8表示用Dna J-like2對BALB/c小鼠進行免疫，通過施用抗CD25抗體可解除對C57BL/6來源的黑色素瘤B16排斥的延誤。
圖9表示用Dna J-like2對BALB/c小鼠進行免疫，通過施用抗GITR抗體可解除對C57BL/6來源的黑色素瘤B16排斥的延誤。
實施例以下通過實施例對本發明進行更詳細的說明，但該實施例并沒有任何限定本發明的意圖。
參考例通過SEREX抗原和腫瘤抗原同時致敏，阻止肺轉移BALB/c起源的3-甲基膽蒽誘導的肉瘤CMS5m細胞，體內注射后可引起肺轉移，5-6周內使動物致死。于是，用總量0.1ml 1×105CMS5m腫瘤細胞通過尾靜脈施用于BALB/c小鼠，作為肺轉移模型。用突變的激酶mERK2作為腫瘤抗原，用Dna J-like2作為SEREX抗原。在將下述物質施用于腫瘤的14日前、7日前、當天，或5日后開始進行隔周免疫，所述的物質是1)編碼mERK2的質粒；2)編碼mERK2質粒及對照載體的質粒混合物；3)mERK2質粒及Dna J-like2質粒的混合物(根據H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9814571-14576(2001)記載的方法)。施用于腫瘤28天后殺死小鼠，用解剖顯微鏡數肺中小瘤數。各組用5只動物，結果用均值±SEM表示。
通過在將所述物質施用于腫瘤細胞之前14天，使用編碼的mERK2質粒對小鼠進行免疫，可以完全預防肺轉移。在將所述物質施用于腫瘤細胞之前7天或在施用于腫瘤細胞之后進行免疫時，看不到該預防效果(參見圖5)。與此相反，在配合施用mERK2質粒以及Dna J-like2質粒的免疫中，從將所述物質施用于腫瘤細胞開始到施用5天之后的免疫中均可以完全預防轉移(參見圖5)。有無轉移可以通過組織病理學實驗進行確認。圖中的數值表示為各組5只小鼠的平均值±SEM。
實施例1 SEREX抗原單獨致敏促進肺轉移在與參考例同樣的肺轉移模型中，將所述物質施用于腫瘤5日后，用編碼SEREX抗原的質粒或對照載體進行免疫，腫瘤接種28日后殺死被免疫的小鼠，數肺小瘤數。用熱休克蛋白質Dna J-like2、DNA連接酶I、Galectin 8和poly A結合蛋白質胞質的4種(均為小鼠的蛋白質)作為SEREX抗原，用其各種質粒進行免疫時，小瘤數130-170，不進行此種免疫時小瘤數為30-50。與此相反，用編碼即使反復進行SEREX分析也未檢測出的3種小鼠分子、葡萄糖調節蛋白質、分泌型微管連接蛋白及含有TCP-1 zeta 1亞基(Cctz-1)侶伴蛋白的質粒免疫時，未觀察到促進轉移(圖1a、1b)。另外，用編碼3種人SEREX抗原(Homo sapiens HMBA誘導蛋白質、人視黃酸應答蛋白質和H.sapiens肝炎δ抗原反應蛋白質A)和卵清白蛋白等異種蛋白質的質粒免疫時未觀察到促進轉移(圖1a)。也就是說，提示用作為自身抗原的SEREX抗原單獨致敏時可以促進轉移。
于是，分析了與促進轉移相關的細胞表型。用抗CD4單克隆抗體和抗CD25單克隆抗體對小鼠進行前處理，全然沒有由Dna J-like2致敏造成的轉移促進(圖2a、2b)。僅用抗CD25單克隆抗體進行前處理時，與未進行前處理的相比，轉移小瘤數大大減少(圖2b)。另外，用抗CD8單克隆抗體進行前處理，用Dna J-like2致敏時，與未進行抗體前處理時相比，可觀察到同等程度的轉移促進(圖2c)。這些結果表示轉移的促進由CD4+細胞或CD4+CD25+T細胞所承擔。
實施例2 用SEREX抗原致敏的CD4+CD25+T細胞促進肺轉移為了直接確認實施例1中所得結果，將用SEREX抗原致敏的CD4+CD25+T細胞移植給腫瘤接種小鼠，觀察有無轉移的促進。也就是說，將CD4+CD25+T細胞從用Dna J-like2抗原免疫的小鼠移植到荷瘤小鼠時，明顯促進肺轉移，但移植CD4+CD25-T細胞時幾乎沒觀察到肺轉移的促進。另外，移植未致敏的CD4+CD25+T細胞時，與未移植時相比，可觀察到有意義的轉移促進，但與移植致敏的CD4+CD25+T細胞相比轉移促進要少很多(圖3)。
實施例3 用SEREX抗原進行前處理，抑制CD4+T細胞的活性，而不抑制CD8+T細胞本發明者們先前曾報道過給腫瘤接種小鼠施用各種腫瘤抗原和編碼SEREX抗原的質粒，引發強烈的抗腫瘤免疫應答，并且在該過程中CD4+T細胞的輔助功能顯著增強，CD8+T細胞應答性擴增依賴于CD4+T細胞(H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814571-14576(2001)；WO 03/000894 A1)。
于是，對實施例2中確認的抗腫瘤免疫應答的抑制中，CD8+T細胞和CD4+T細胞免疫應答是否有變化的問題進行了研究。用突變的9-mer的激酶ERK2的肽(即mERK2 9m)作為腫瘤抗原。用DnaJ-like2先免疫小鼠，然后單獨用編碼mERK2 9m的質粒或使之與編碼Dna J-like2的質粒一起使用進行免疫，通過ELISPOT分析mERK2 9m特異性的CD8+T細胞。單獨應用mERK2 9m時，與DnaJ-like2先處理未造成CD8+T細胞變化(圖4a)，但一起使用時，在沒有進行Dna J-like2沒處理時所觀察到的輔助活性增強，通過Dna J-like2的前處理而完全消失(圖4b)。這些結果表明，用SEREX抗原進行免疫時，抑制CD4+T細胞的輔助活性，而不抑制CD8+T細胞的輔助活性。通過α-GalCer-CD1d四聚體分析可以看到局部自然殺傷性T(NKT)細胞的數量減少。
通過以上實施例1、實施例2和實施例3可實驗性證明，以小鼠腫瘤轉移模型中抗腫瘤免疫應答為例，通過用編碼SEREX抗原的質粒單獨處理，可活化CD4+CD25+調節性T細胞，結果抑制CD4+T輔助細胞的活性，從而抑制整體的免疫應答。
實施例4 通過調控調節性T細胞活性而抑制同種免疫應答本發明者用荷瘤小鼠的血清，通過SEREX法，鑒定出荷瘤個體的免疫系統識別的未發生突變的野生型自身抗原(SEREX鑒定自身抗原)。
由于SEREX鑒定自身抗原是由IgG識別的，所以可以認為能被CD4細胞所識別。用ヘリオス型基因槍(Helios社Gene Gun)共免疫這些SEREX鑒定自身抗原和細胞毒性T細胞(CTL)識別的癌排斥抗原時，發揮強的輔助效果。
另一方面，用SEREX鑒定自身抗原單獨免疫時，在小鼠肉瘤肺轉移模型中能見到腫瘤惡化，故認為可對免疫進行了抑制性調控。
認為該機制由于用SEREX鑒定自身抗原單獨免疫時，活化CD4+CD25+調節性T細胞，使NKT減少所致。本實施例中為了探討因SEREX鑒定自身抗原單獨免疫造成的免疫抑制效果與移植等同種免疫應答有何種關系，給進行SEREX鑒定自身抗原單獨免疫的小鼠接種其它系小鼠來源的腫瘤，探討對其增殖的影響。
(1)材料及方法小鼠使用BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠。
質粒將SEREX鑒定自身抗原基因(DnaJ-like2、Mus DNALigase1(Ligase1)、Mus poly(A)結合蛋白，胞質1(Poly A))整合到pBK-CMV質粒中，包被到膠體金上。
基因導入(免疫)用ヘリオス型基因槍，以2周的間隔，單獨將SEREX鑒定自身抗原導入小鼠腹部皮內進行免疫。
腫瘤接種第2次單獨用SEREX鑒定自身抗原免疫1周后，將C57BL/6來源的黑色素瘤細胞株B16接種給BALB/c小鼠；將BALB/c來源的纖維肉瘤細胞株CMS5a接種給C57BL/6小鼠，分別接種1×106個細胞，接種到背部皮下。
接種腫瘤后，測定小鼠背部腫瘤的直徑隨時間變化的情況。(參照圖6-9)抗體抗CD25抗體是從雜交瘤PC61中經過硫酸銨分級濃縮而成，施用0.25mg。抗GITR(Glucocorticoid-induced TNF receptorsuperfamily 18)抗體是雜交瘤DTA-1(京都大學坂口志文教授提供)腹水8倍稀釋的產物，施用200μl(25μl)。抗CD4抗體是雜交瘤GK1.5腹水8倍稀釋的產物，施用200μl(25μl)。對于抗體施用，所有抗體均在腫瘤接種之前立即施用，只施用1次。
(2)結果與考察BALB/c小鼠中，由于用SEREX鑒定自身抗原進行了免疫，C57BL/6小鼠來源的腫瘤排斥被耽誤，一部分小鼠因腫瘤死亡。
該現象可通過抗CD25抗體的施用、抗GITR抗體的施用而解除，所以可以認為與CD4+CD25+調節性T細胞相關。
通過由SEREX鑒定自身抗原的免疫而引起的對免疫應答進行抑制性調控的結果分析可以認為同種免疫應答也有所降低。
權利要求
1.一種組合物，其包含CD4+CD25+調節性T細胞識別的抗原。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中CD4+CD25+調節性T細胞識別的抗原是用SEREX方法鑒定的分子。
3.一種組合物，它包含編碼CD4+CD25+調節性T細胞識別的抗原的表達載體。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中CD4+CD25+調節性T細胞識別的抗原是用SEREX方法鑒定出分子。
5.根據權利要求2或4所述的組合物，其中用SEREX方法鑒定出分子是自身抗原。
6.根據權利要求2、4和5中任意一項所述的組合物，其中用SEREX方法鑒定出分子選自DnaJ-like2(GenBank Accession No.NM_005494，XM_028966，XM_172161，XM_052862，XM_062754，XM_093388，NM_016306，NM_012328，NM_005880)、Galectin8(GenBank Accession No.AH008815，AF193806，AF193805)、PolyA結合蛋白(GenBank Accession No.XM_067844)、連接酶1(GenBankAccession No.NM_000234)中的一種。
7.權利要求3-6中任意一項所述的組合物，其中用基因槍施用該組合物。
8.權利要求1-7中任意一項所述的組合物，其用于預防和/或治療自身免疫性疾病。
9.權利要求1-8中任意一項所述的組合物，其用于預防和/或治療過敏性疾病。
10.權利要求1-9中任意一項所述的組合物，其用于抑制臟器或組織移植中排斥反應和/或移植物抗宿主反應。
11.一種抑制哺乳動物中免疫應答的方法，該方法包括給哺乳動物施用權利要求1-10中任意一項所述的組合物。
12.一種調控哺乳動物免疫的方法，它包括給哺乳動物施用權利要求1-10中任意一項中的組合物，抑制哺乳動物中的免疫應答，再施用IFN-γ恢復該哺乳動物的免疫應答。
13.一種調控哺乳動物免疫的方法，它包括對哺乳動物施用權利要求1-10中任意一項所述組合物，抑制哺乳動物中的免疫應答，再施用IL-12和IL-18恢復哺乳動物的免疫應答。
14.一種預防和/或治療自身免疫性疾病的方法，該方法包括給哺乳動物施用藥學有效量的權利要求1的組合物。
15.權利要求1-10中任意一項所述的組合物在制備預防和/或治療自身免疫性疾病的藥劑中的用途。
16.一種預防和/或治療過敏性疾病的方法，該方法包括給哺乳動物施用藥學有效量的權利要求1的組合物。
17.權利要求1-10中任意一項所述的組合物在制備預防和/或治療過敏性疾病的藥劑的中的用途。
18.一種抑制臟器或組織移植中的排斥反應和/或移植物抗宿主反應的方法，該方法包括對哺乳動物施用藥學有效量的、如權利要求1所述的組合物。
19.權利要求1-10中任意一項所述的組合物在制備預防和/或治療抑制臟器或組織移植中的排斥反應和/或移植物抗宿主反應的藥劑中的用途。
全文摘要
本發明提供調控調節性T細胞活性的組合物以及調控方法。即涉及含有CD文檔編號A61K38/00GK1678338SQ0382037
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月29日 優先權日2002年8月30日
發明者珠玖洋 申請人:株式會社免疫新領域