在線工業魯棒化調控細胞狀態生產第八因子的裝置與方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物工程領域中可在線調節和控制細胞狀態生產重組凝血八因子的裝置與方法，尤其涉及一種可在線工業魯棒化(industrially robust)連續監控、連續灌注生物反應器及培養瓶/袋系統的細胞培養環境中各項理生化指標，并可直接在線調節和控制細胞狀態的細胞培養、擴增和制備重組凝血八因子的方法。
【背景技術】
[0002]甲型血友病是一種伴性遺傳疾病，人群中該病的總發病率為6人/每10萬人，由于診斷方法的進步和醫療水平的提高，血友病發病率(統計數字)有明顯的升高趨勢，有些國家已超過10/10萬，據此估計，我國甲型血友病人數在6萬到10萬人左右，病人由于凝血機制缺陷，偶遇內外傷往往流血不止，需要輸注足量的第八因子制劑，由于第八因子在機體內的半衰期不長，(僅在8-12小時)故止血效果雖然顯著，但不能持久，再次出血需再次輸注；又因對該病至今尚無根治之術，故病人在一生中都需要第八因子的支持，所以這類病人的總數雖然不多，但需求量卻很大。
[0003]我國本土生產的第八因子都來源于人血漿，該工藝具有操作復雜，容易污染，蛋白活性較低的缺點；此外由于原料血漿嚴重不足，第八因子供應持續緊張，從提高血友病患者的治療率和保障急診用藥計，國內第八因子的缺口為現有產量的約20倍。
[0004]幾年前Bayer公司的基因重組人第八因子(rhFVIII)在我國上市，理論上緩解了藥品不足和用藥安全的問題，但是進口 rhFVIII價格昂貴，多數患者難以負擔。(血友病的第八因子治療不在醫保范圍)。而目前我國并無公司有能力生產重組人凝血制品，無論是技術水平還是產量，都與國外公司存在巨大差距，并且無法彌補國內患者需求的缺口。并且類似rhFVIII這樣的進口產品也為我國生物醫藥產業帶來了生存壓力。因此，開發具有自主知識產權的動物細胞培養生產重組人凝血八因子的工藝具有重要的社會和經濟價值。
[0005]就重組人凝血八因子的產業化工藝而言，現代動物細胞生物反應器培養表達技術是上述產品的關鍵核心技術，該技術工藝復雜、難度大。這些先進的重組蛋白生產技術掌握在國外少數制藥公司手中，幫助這些跨國公司攫取高額利潤。而我國比世界先進技術水平相差懸殊，是牽扯到一系列技術的整體性工業的差距。因此，我們不僅需要快速追趕，縮小差距，更需要加快技術研發，在相關領域取得跨越式發展，形成真正具有自主知識產權的重組凝血八因子生產的核心關鍵技術。
[0006]就重組凝血八因子的產業化工藝而言，現代動物細胞生物反應器培養表達技術是上述產品的關鍵核心技術，該技術工藝復雜、難度大。目前，重組凝血八因子的生產表達方法通常為采用批培養，分批補料培養等。這些重組蛋白生產工藝雖然已經被放大至1000L以上，但是工藝本身存在如下缺點:
[0007]I)培養，表達過程的參數控制較少，不能完全或只能部分程度的控制培養環境的理化條件如溫度，pH, C02和02濃度，營養物質濃度等；
[0008]2)即使通過反應器對理生化條件進行精確控制，但這種控制方法仍然缺乏對細胞狀態本身的精確調節和控制。處于生長和蛋白過程中的細胞狀態可以極大地影響最終表達的重組蛋白質量(如蛋白質的糖基化水平，蛋白二級、三級結構的正確形成)，而細胞狀態并不僅僅是通過上述理生化等參數對細胞的影響所能決定的，對于重組凝血八因子這樣的蛋白來說，生產獲得的蛋白活性更加是遠遠比單純的蛋白質量重要；
[0009]3)批次培養獲得的細胞的重復性較低，且極大地受到不同實驗和生產技術人員個人操作的影響，在試驗和生產中會出現較大的批次間差異(batch to batch variat1n),這也是目前藥物品質控制和監管領域的難題之一。因此，一種具有簡便可靠性的魯棒化(robust)可大規模化(scalable)應用于工業化(industrial)的重組凝血八因子的生產裝置和工藝是目前表達工藝(process development)研究領域的瓶頸。
[0010]此外，對于傳統工藝用細胞狀態“好”與“壞”來描述細胞是一種口語化的表達，而“延遲期”，“對數生長期”和“平臺期”等言語也是一個較為籠統的概念，不夠精確和準確。據公開報導，細胞生長的狀態與整個群體的細胞周期分布具有一定的相關性。按照細胞在分裂過程中表現出的顯著性差異的行為，細胞周期可以大致分為三個階段，參見圖1:
[0011]gaplphase (Glphase, Gl期)是一個細胞周期的起始階段,在這個階段,細胞內部進行相關蛋白質的合成等行為，細胞體積和基因組不產生任何變化；
[0012]隨后，細胞會根據自身所處的環境來判斷是否跨越過限制點(restrict1npoint),進入DNA合成期(DNA synthesis phase, S phase, S期),在S期,細胞主要進行自身基因組DNA的合成復制，復制完畢后，細胞成為2倍體，即基因組翻倍；
[0013]隨后細胞進入有絲分裂期(gap2/mitotic phase, G2/M phase, G2/M期),在此時期，細胞完成有絲分裂，得到兩個相同的子細胞，完成了一個細胞周期；
[0014]當細胞所處環境不佳，不利于細胞生長時，細胞無法跨過限制點，從而跳出細胞周期，進入一個額外的沉默期(resting phase, GOphase),成為不分裂細胞。
[0015]根據細胞在上述不同周期的細胞行為，通過細胞核染色試劑檢測細胞核的DNA含量，配合流式細胞儀即可分辨單個細胞所處的細胞周期并繪制整個群體的細胞周期分布圖。
[0016]對于正常培養過程中的細胞而言，細胞整體是一個異步培養體系(asynchronousculture)，即在培養過程中細胞整體并不處于細胞周期的相同位置，而是隨機分布在細胞周期的各個位置。由于處于細胞周期不同時期的細胞在蛋白過程中表現出的特性可能并不相同，因此細胞整體所呈現的結果可能實質上是由處于不同細胞周期、不同狀態的細胞的所占比例的動態變化一即細胞周期分布導致的。

【發明內容】

[0017]由于細胞生長狀態本身極大地影響最終表達的重組蛋白質量，而傳統的細胞培養和蛋白表達方法如批培養和補料培養工藝中對于細胞狀態的控制相對缺乏，同時細胞狀態并不僅僅是通過上述理化參數對細胞的影響所能決定的。因此，實現對細胞生長狀態(即細胞生長，細胞周期分布等具體參數)的精確控制，是建立具有簡便可靠性的魯棒化(robust)可大規模化(scalable)應用于工業化(industrial)重組凝血八因子表達工藝(processdevelopment)的重要工作。
[0018]本發明的目的在于，針對目前重組凝血八因子傳統制備工藝中的上述缺點，提供一種既可在線、連續、監控細胞培養環境中多種理生化指標，又可以直接調節和控制細胞狀態(包括細胞周期等)的生物反應器類細胞培養裝置及由該裝置生產重組凝血八因子的方法，使其降低染菌風險，維持細胞生長環境穩定，保持細胞恒定生長活力，達到高質、高效連續生產重組凝血八因子的目的。
[0019]對于傳統工藝用細胞狀態“好”與“壞”來描述細胞是一種口語化的表達，而“延遲期”，“對數生長期”和“平臺期”等言語也是一個較為籠統的概念，不夠精確和準確。本發明使用細胞比生長速率(μ )作為精確描述細胞生長的動力學參數，可以在一定程度上反映細胞狀態。據發明人的研究結果，這一生長動力學參數與細胞周期分布、細胞在細胞周期內停留時間呈密切關系，通過特定裝置組成聯動系統調節，可以實現精確調控細胞狀態的目標。
[0020]本發明的上述發明目的是通過以下技術方案實現的:
[0021]一種在線工業魯棒化調節和控制細胞狀態生產重組凝血八因子的裝置，用以趨向性調節和控制細胞狀態，該裝置至少包括:培養液儲存罐、可監控細胞生物反應器、產品收獲罐、若干理生化指標檢測器、在線監控系統、細胞狀態調節控制裝置及聯動系統、細胞截留裝置、若干流體無菌控速推動器和若干可控速管道體系，其中，所述培養液儲存罐通過所述可控速管道體系經所述流體無菌控速推動器與所述可監控細胞生物反應器連接，所述細胞截留裝置連接所述可監控細胞生物反應器，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統通過所述可控速管道體系經所述流體控速推動器選擇性與所述可監控細胞生物反應器或所述細胞截留裝置連接，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統通過所述可控速管道體系經所述流體無菌控速推動器連接所述產品收獲罐，所述可監控細胞生物反應器通過所述理生化指標檢測器連接所述在線監控系統，所述在線監控系統與所述流體無菌控速推動器連接并發送控速指令給所述流體無菌控速推動器，上述所有容器類裝置均通過可控速管道體系進行連接，其中，所述細胞狀態調節控制裝置及聯動系統用于所述可監控細胞生物反應器內不同細胞比生長速率及不同細胞狀態的調控。
[0022]優選地，所述細胞截留裝置包