截短的actriib-fc融合蛋白的制作方法
【專利說明】截短的ACTRI IB-FC融合蛋白
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2010年6月8日，申請號為 201080035960.1 (PCT/US2010/037787)，發明名稱為"截短的 ACTRIIB-FC 融合蛋白"。
[0002] 相關申請的交叉參考
[0003] 本申請要求保護2009年6月12日提交的美國臨時申請序列號61/268, 420、2009 年11月3日提交的61/280, 543的權益。這些申請通過引用以其整體結合到本文中。
[0004] 發明背景
[0005] 轉化生長因子(TGF-β)超家族含有各種生長因子，它們共有共同的序列元件 和結構基序。已知這些蛋白質在脊椎動物和無脊椎動物兩者中對多種細胞類型發揮生物作 用。該超家族的成員在圖式形成和組織特化的胚胎發育期間發揮重要功能，可影響各種分 化過程，包括脂肪形成、肌發生、軟骨發生、心臟發生、血細胞生成、神經發生和上皮細胞分 化。該家族由不同命名的蛋白表示，即激活素和抑制素、TGF-β、生長和分化因子（GDF)和 骨形態發生因子（BMP)。還已知該家族的其它成員例如Nodal和Lefty。通過操控TGF-β 家族成員的活性，常常可引起生物體的重大生理改變。例如Piedmontese和Belgian Blue 牛品種在GDF8(亦稱為肌肉生長抑制素（myostatin))基因中攜帶引起肌肉質量明顯增加 的功能缺失突變。Grobet等，Nat Genet. 1997,17(1) :71-4。此外，在人中，⑶F8的無活 性等位基因與肌肉質量增加和據報道的異常強度有關。Schuelke等，N Engl J Med2004， 350:2682-8。
[0006] 肌肉、骨、脂肪、軟骨和其它組織方面的變化可通過激動或拮抗由適合的TGF-β 家族成員介導的信號轉導來實現。因此，存在對起TGF-β超家族成員的信號轉導的有效調 節劑作用的物質的需要。
[0007] 發明簡述
[0008] 在某些方面，本公開內容提供新型的ActRIIB多肽，特別是氨基端和羧基端截短 物和序列改變物。在一個實施方案中，描述了包含人ActRIIB(SEQ ID Ν0:1)的氨基酸 25-131的多肽或其變體。這樣的多肽被證實在治療多種病癥特別是與肥胖癥、胰島素抵抗 和其它代謝病癥相關的病癥中具有出人意料的功效。本文公開的ActRIIB多肽可用于在患 者中產生各種所需作用，包括例如增加瘦體重、減少白色脂肪質量、增加褐色脂肪質量、減 少血清甘油三酯、減少血清胰島素水平或減少血清游離脂肪酸水平。本文公開的ActRIIB 多肽可用于治療多種病癥或病況，包括肌肉和神經肌肉病癥（例如肌營養不良、肌萎縮側 索硬化（ALS)和肌肉萎縮）、脂肪組織病癥（例如肥胖癥、脂肪性肝病）、代謝病癥（例 如2型糖尿病、胰島素抵抗、代謝綜合征）、神經變性病癥和老年相關的肌肉消耗（muscle wasting)(肌肉衰減綜合征（sarcopenia))、前列腺癌治療（例如雄激素剝奪治療）以及與 多種癌癥相關的惡病質。ActRIIB多肽的實例包括SEQ ID N0:8中所述的人ActRIIB-Fc融 合蛋白，其在本文中描述為ActRIIB (25-131) -hFc。
[0009] 在某些方面，本公開內容提供來源于ActRIIB的新型多肽（被稱作ActRIIB多 肽）。在一些實施方案中，多肽可選自：以下多肽，其包含其中氨基酸序列由SEQ ID N0:8 的序列組成的氨基酸序列或者在不超過1、2、3、4或5個氨基酸位置處不同于SEQ ID N0:8 的氨基酸序列；通過SEQ ID N0:4的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交的核酸在哺乳 動物細胞中表達產生的多肽；通過SEQ ID N0:6的核酸或在嚴格條件下與其互補序列雜交 的核酸在哺乳動物細胞中表達產生的多肽。本文公開的多肽可包含來源于ActRIIB的部分 和一個或多個異源部分，其中來源于ActRIIB的部分可包含由SEQ ID NO: 1氨基酸25-131 的序列組成的氨基酸序列或在不超過1、2、3、4或5個氨基酸位置處不同于SEQ ID NO: 1氨 基酸25-131的序列的氨基酸序列。異源部分可包含免疫球蛋白的恒定結構域、免疫球蛋白 的Fc結構域或者，特別地，人IgGl的Fc結構域（術語"人IgGl"應理解為包括與在人中使 用相容的這類Fc的變體）。ActRIIB多肽可包含來源于ActRIIB的部分，其包含由SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131的序列組成的氨基酸序列。本文公開的ActRIIB多肽可為氨基端具有 序列ETR的那些。本文公開的ActRIIB多肽可導致小鼠的瘦體重在以10mg/kg的劑量水平 每周兩次治療四周后統計上顯著增加。瘦組織質量的平均增加可為至少1、2、3、4或5或更 多克。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食喂飼的小鼠的脂肪質量在以10mg/kg的劑 量水平每周兩次治療四周后統計上顯著減少。脂肪質量的平均減少可為5、7、10、15或更多 克。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食喂飼的小鼠的血清甘油三酯水平在以IOmg/ kg的劑量水平每周兩次治療四周后統計上顯著減少。血清甘油三酯的平均減少可為至少 50、75、100、125或150或更多mg/dl。本文公開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食喂飼的小 鼠的血清游離脂肪酸水平在以l〇mg/kg的劑量水平每周兩次治療四周后統計上顯著減少。 游離脂肪酸的平均減少可為至少500、750、1000或更多的微摩爾/dl游離脂肪酸。本文公 開的ActRIIB多肽可導致高脂飲食喂飼的小鼠的血清胰島素水平在以10mg/kg的劑量水平 每周兩次治療四周后統計上顯著減少。血清胰島素的平均減少可為至少〇.5、1、1.5、2或更 多ng/ml胰島素。本文所用術語"統計上顯著的"一般是指p值或者>0. 05,但顯著性的其 它衡量可被認可用于統計檢驗的各種類型，并且在這樣的情況下，術語"統計上顯著的"應 使用用于評價數據顯著性的最廣泛使用的公式。ActRIIB多肽可包含至少一個N聯糖，并且 可包含兩個、三個或更多個N聯糖。此類多肽還可包含0聯糖。ActRIIB多肽可在以適于患 者應用的方式糖基化蛋白的多種細胞系中產生，所述細胞系包括工程改造的昆蟲細胞或酵 母細胞以及哺乳動物細胞例如COS細胞、CHO細胞、HEK細胞和NSO細胞。ActRIIB多肽可 形成共價或非共價的二聚體，包括同二聚體。一般而言，Fc融合蛋白易于形成共價連接的 同二聚體。任一種前述多肽可摻入藥物制劑中。
[0010] 在某些方面，本文公開的ActRIIB多肽結合ActRIIB配體，例如⑶F8、⑶F11、激活 素、BMP7、⑶F3或nodal。ActRIIB多肽任選以少于10微摩爾或少于1微摩爾、100納摩爾、 10納摩爾、1納摩爾或0. 1納摩爾的Kd結合ActRIIB配體。與天然存在的ActRIIB多肽相 比，本文公開的ActRIIB多肽在氨基酸序列中（例如在配體結合域中）可包括1、2、3、4、5個 或更多個改變。氨基酸序列的改變可例如改變所述多肽的糖基化（當在哺乳動物、昆蟲或 其它真核細胞中產生時），或者與天然存在的ActRIIB多肽相比，改變所述多肽的蛋白酶剪 切。ActRIIB多肽可為融合蛋白，其具有來源于ActRIIB的氨基酸序列（例如ActRIIB的配 體結合域或其變體）作為一個結構域和一個或多個提供所需性質（例如藥代動力學改進、 更容易純化、靶向特定組織等）的額外的結構域。例如，融合蛋白的結構域可提高以下性質 中的一種或多種：體內穩定性、體內半衰期、攝取/給予、組織定位或分布、蛋白質復合體的 形成、融合蛋白的多聚化和/或純化。ActRIIB融合蛋白可包含免疫球蛋白Fc結構域（野 生型或突變型）或血清白蛋白。在某些實施方案中，ActRIIB-Fc融合物包含位于Fe結構 域和胞外ActRIIB結構域之間相對松散的接頭。該松散接頭可相當于ActRIIB胞外域的C 端的大約15個氨基酸的松散區（"尾巴"），或者其可為介于5和15、20、30、50個或更多個 氨基酸之間相對缺乏二級結構的人工序列。接頭可富含甘氨酸和脯氨酸殘基，并可含有例 如蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復序列（例如TG4或SG4重復序列）。在SEQ ID NO:8的 多肽的情形中，采用短的柔性接頭似乎是有利的，例如1、2、3、4或5個甘氨酸殘基，任選帶 有一個或多個小殘基例如丙氨酸、蘇氨酸或絲氨酸。融合蛋白可包含純化亞序列，例如表位 標簽、FLAG標簽、聚組氨酸序列和GST融合物。任選ActRIIB多肽包含一個或多個選自以 下的修飾氨基酸殘基：糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、 生物素化氨基酸、與脂質部分綴合的氨基酸和與有機衍生劑綴合的氨基酸。
[0011] 在某些方面，ActRIIB多肽可作為藥物制劑配制。優選藥物制劑是無致熱原的（意 指無致熱原至由控制用于治療應用的產品質量的規章所要求的程度）。藥物制劑還可包含 一種或多種其它的化合物，例如用于