重組蛋白質的純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白純化領域，更具體地，本發明涉及一種重組蛋白的純化方法。
【背景技術】
[0002] 離子交換層析是一種常用于蛋白質純化的層析技術。在離子交換層析中，如果周 圍緩沖液的離子強度足夠低，溶質表面的帶電部分就被結合在層析基質上的相反電荷所吸 弓丨。通常可提高緩沖液的離子強度（電導值）與溶質競爭離子交換介質的帶電位點，來實 現洗脫。改變pH從而改變溶質帶電荷量是實現溶質洗脫的另一種方法。導電率或pH的改 變可以是逐漸的（梯度洗脫）或分步的（分步洗脫）。在過去，這些改變是漸進的，pH或導 電率單向增大或減小。
[0003]目前已經有許多有關利用陽離子層析純化蛋白的方法，例如中國專利 200410068790. 3公開了使用陽離子交換層析去除酸性污染物，使用提相對高電導值來去除 酸性污染物，然后降低電導平衡，接著再提高電導來洗脫。pH在使用過程中不變。純化結果 為酸性突變體下降了 50%左右，堿性突變體沒有提及。中國專利200880119331. X公開了使 用陽離子交換層析提高pH來洗滌、然后降低pH提高電導來去除抗體中的CHOP (中國倉鼠 卵巢蛋白質)、脫落的蛋白A、DNA、聚體等，并沒有針對抗體中的酸性、堿性相關蛋白。
[0004] 上述方法雖然部分達到了純化蛋白的目的，但存在著酸性和堿性相關蛋白去除率 不高，目標蛋白損失率大的問題。

【發明內容】

[0005] 本發明利用改變緩沖液的pH和鹽的濃度來分離酸性、堿性相關蛋白和目的蛋白， 在酸性低pH和相對高鹽濃度的溶液條件下上樣，在堿性高pH和相對低鹽的溶液的條件下 洗滌、洗脫。最終酸性相關蛋白的去除率大于85%，甚至高達93%，堿性相關蛋白的去除率大 于59%，目標蛋白損失率小于26%。
[0006] 更具體地，本發明公開了一種從包含重組蛋白和其相關蛋白的混合物中純化該重 組蛋白的方法，該方法包括依次進行的下列步驟：
[0007]A、用第一種平衡緩沖液使重組蛋白結合到離子交換介質上，其中第一種平衡液處 于第一電導率和pH ;
[0008] B、用第二種平衡緩沖液繼續平衡已結合蛋白的離子交換介質，其中第二種平衡液 處于第二電導率和pH ;
[0009] C、用不同pH的洗滌液洗滌離子交換介質，從而從離子交換介質上洗脫下第一類 相關蛋白，其中洗滌液處于第三電導率和pH是逐步增加的；
[0010] D、用第一種洗脫液洗脫離子交換介質，從而從離子交換介質上洗脫下目的重組蛋 白，其中第一種洗脫液處于第四電導率和pH ;
[0011] E、用第二種洗脫液繼續洗脫離子交換介質，從而從離子交換介質上洗脫下第二類 相關蛋白，其中第二種洗脫液處于第五電導率和pH。
[0012] 其中，上述離子交換介質是陽離子交換介質，指結合在不同基質上的功能基團 為S03_的填料，可為但不限于羧基-甲基-纖維素、BAKERBOND ABX?、固定在瓊脂糖上的 磺酸丙基（sulphopropyl) (SP)(如 GE 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW? 或 SP-SEPHAR0SE HIGH PERFORMANCE?)、固定在聚苯乙烯二乙烯苯基 Polystyrene/divinyl benzene 上的 S0URCE-30S、S0URCE-15S，AB公司的Poros HS Poros XS和固定在瓊脂糖上的磺酰基（如 Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOW?)和Bio-rad公司的固定在親水性聚丙烯酰胺類上 的 NUVIA-S、UNOsphere-S 等。
[0013] 第一類相關蛋白PI (isoelectric point,等電點）低于重組蛋白PI，重組蛋白 PI低于第二類相關蛋白，更具體地，第一類相關蛋白是重組蛋白的酸性突變體，定義為在 CEX-HPLC上保留時間小于目標蛋白的那一類物質。第二類相關蛋白是重組蛋白的堿性突變 體，定義為在CEX-HPLC上保留時間大于目標蛋白的那一類物質。
[0014] 上述的第二種平衡緩沖液的電導率比第一種平衡緩沖液低，但pH兩者相同，具體 地，第一種平衡液為含鹽的緩沖液，一般使用的緩沖液有PB、MES、醋酸，最好選擇醋酸緩沖 液，緩沖液濃度控制范圍在10-50mmol/L，最好在20mmol/L。pH控制在pH4. 0-6. 0,比較好 的控制范圍在pH4. 9-5. 1，最好在pH5. 0。鹽的種類有氯化鈉、硫酸銨、氯化鉀、氯化銨、硫酸 鉀等鹽，最好選擇硫酸銨。鹽濃度控制范圍在10_70mm〇l/L，最好在40_60mmol/L，電導控制 范圍在8-13ms/cm。使用60mmol/L的硫酸銨更有利于酸性相關蛋白的流出；第二種平衡液 為不含鹽的緩沖液，一般使用的緩沖液有PB、MES、醋酸，最好選擇醋酸緩沖液，緩沖液濃度 控制范圍在10-50mmol/L，最好在20mmol/L。pH控制在pH4. 0-6. 0,比較好的控制范圍在 pH4. 9-5. 1，最好在 pH5. 0。電導一般在 l_2ms/cm，最好在 1. lms/cm。
[0015] 洗滌液的電導率比第一種平衡緩沖液低，但pH高于第一和/或第二種平衡緩沖 液。
[0016] 第一種洗脫液的pH比洗滌液高，但電導率基本相同。第二種洗脫液的pH和/或 電導率比第一種洗脫液高。
[0017] 洗滌液和第一種洗脫液是通過調整兩種不同pH的含鹽的緩沖液的混合比例來實 現的。緩沖液可以選擇磷酸鹽、ffiPES、BICINE等，最好選擇磷酸鹽。緩沖液濃度控制范圍 在10_50mmol/L，最好在10mmol/L，電導范圍一般在l_2ms/cm，一般不控制。一種緩沖液A 的pH可以在7. 0-7. 8,最好在7. 5, 一種緩沖液B的pH在9. 3-9. 4。鹽的種類有氯化鈉、 硫酸銨、氯化鉀、氯化銨、硫酸鉀等鹽；更具體地，洗滌液和第一種洗脫液的pH改變是通過 25%Na 2HP04pH7. 5+75%Na2HP04 pH9. 3-9. 4 改變到 15%Na2HP04 pH7. 5+85%Na2HP04 pH9. 3-9. 4 來實現的。
[0018] 第二種洗脫液是高鹽的水溶液，鹽的種類有氯化鈉、硫酸銨、氯化鉀、氯化銨、硫酸 鉀等鹽，優選氯化鈉。
[0019] 各種緩沖液存放一般在4-30攝氏度，最好在4-8攝氏度。
[0020] 重組蛋白，優選重組抗體(例如重組抗HER2抗體）經過CH0細胞表達后，使用碟式 離心技術和深層過濾收集上清液。然后通過protein-A親和層析，使用pH酸性的檸檬酸來 洗脫，獲得含目標蛋白、酸性、堿性相關蛋白的均一混合液。此混合液即是陽離子層析(例如 Nuvia-S)的上樣液。
[0021] 將上樣液通過TRIS-base/氫氧化鈉等堿性物質調節至pH4. 0-6. 0,比較好的控制 范圍在pH4. 9-5. 1，最好在pH5.0, pH調節完成后，加入氯化鈉/硫酸銨等鹽析鹽來調節電 導，使用帶溫度補償的電導率儀，例如梅特勒公司的seven-easy電導率儀，使用20攝氏度 為參比溫度，調節電導控制范圍在6. 0-18. Oms/cm，最好控制在8. 0-12. 5ms/cm。
[0022] 本發明使用兩種不同的上樣電導，一種為8.4ms/cm，另一種為12. Oms/cm，在相同 pH下采用高電導上樣有利于酸性相關蛋白的流出，一般可以有10-20%比例的酸性峰流出 而目的蛋白流失率可以忽略不計。樣品pH和電導調節完畢后放于4攝氏度，這樣可以減緩 目的蛋白的進一步水解。
[0023] 層析柱經裝填后需要達到使用要求，一般控制柱效在2000每米塔板數以上。層析 過程流速一般控制在5cm/min。層析柱載量控制在10-20mg/ml，最好控制在15mg/ml。蛋 白定量使用280nm紫外分光光度計，重組抗體，比如抗HER2人源化單克隆抗體消光系數為 1. 50。
[0024] 層析控制上先使用第一種平衡液平衡層析柱，一般3CV可以平衡完畢即可上樣。 上樣后繼續使用第一種平衡液平衡至少1CV，再用第二種平衡液平衡至少1CV，此步的目的 在于去除平衡液中的鹽以防止影響洗滌步驟。接著使用100%A的洗滌液洗滌2CV以提高 pH。使用60%B-75%B的洗滌液來洗滌層析柱，用以去除酸性相關蛋白。洗滌步驟可以單步洗 滌也可以多步洗滌，一般情況至少使用75%B單步洗滌，多步洗滌