一種透明質酸分離純化的方法
【專利摘要】本發明提供一種透明質酸的分離純化方法，該方法主要包括以下步驟：發酵液經預處理后進行乙醇沉淀、沉淀物溶解，溶解液進行乙醇分級沉淀除雜，再經活性炭脫色與乙醇沉淀，沉淀物干燥后即可得到透明質酸成品。該方法工藝簡單，特別能有效去除易造成堵膜現象的菌體懸浮殘渣、蛋白、粘稠的大分子顆粒等雜質，該工藝過程中無有毒害物引入，在透明質酸工業化生產中具有很強的可行性。
【專利說明】
一種透明質酸分離純化的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及透明質酸的分離純化的方法，尤其涉及乙醇分級沉淀純化透明質酸的 方法。
【背景技術】
[0002] 透明質酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)又名玻璃酸，是一種線性大分子黏多糖，透 明質酸廣泛存在于各種組織細胞間質中，如皮膚，臍帶，關節滑液，軟骨，眼玻璃體，卵細胞， 血管壁等。在不同的組織中的HA的生理作用也有所不同，在皮膚中主要表現為保水作用，在 關節滑液中主要為潤滑作用，在血管壁中主要調節通透性，在結締組織中，透明質酸可以與 蛋白結合成分子量更大的蛋白多糖分子，它是保持疏松結締組中水分的重要成分。基于透 明質酸具有良好的保濕性和增強皮膚組織彈性功能，在國際上被公認為是一種生物大分子 保濕劑，用于眼科顯微手術、關節炎治療、高檔化妝品、食品添加劑等領域（帕提古麗.透明 質酸國內外生產現狀及應用前景分析，新疆石油科技，2012，22:66-68)。
[0003]目前，透明質酸常用的制備技術主要有兩種。一種是利用天然原料，即動物組織中 提取，主要的原料是人的臍帶，雞冠和牛眼玻璃體等。用丙酮或乙醇將原料脫脂、脫水、風干 后，用蒸餾水浸泡、過濾，再以氯化鈉溶液和氯仿溶液處理，之后加以胰蛋白酶保溫后得到 混合液，最后以離子交換劑等方法進行精制純化，得到精制透明質酸。該方法的提取率極 低，僅為1%左右，另外，該方法利用動物原料提取透明質酸，由于原料資源有限，制備成本 較高。另一種是利用生物發酵法制備。生物發酵法制備透明質酸具有產品不受原料資源限 制、生產成本低、工藝簡單等優點，目前已得到廣泛使用，并已成為研究HA生產的主要方向， 正逐步取代從動物組織中分離提取HA的傳統方法。目前，應用于醫藥、化妝品等領域的透明 質酸主要由微生物發酵生產。
[0004] 從發酵液中分離純化透明質酸是發酵法生產透明質酸的關鍵步驟之一。透明質酸 發酵液中的菌體殘渣、蛋白質、大分子懸浮物、小分子雜多糖等雜質的存在給透明質酸的提 取和精制帶來極大的困難，同時也降低了透明質酸的品質，限制了其應用范圍。目前報道的 去除HA發酵液中的菌體殘渣、大分子懸浮物和蛋白質等雜質的方法有膜過濾法、凝膠層析 法、離子交換層析法等。膜過濾法具有設備簡單、操作方便、實驗重復性好等優點，但提取效 率相對較低，因為透明質酸發酵液通常比較粘稠，發酵液中懸浮雜質、菌體殘渣等易造成堵 膜現象，影響提取效率和工藝成本。凝膠層析是基于分離組分之間的分子量大小不同而起 到分離效果，有利于分離去除發酵液中與透明質酸性質相似的小分子雜多糖、蛋白質等雜 質，但凝膠層析方法成本較高，且分離純化的透明質酸的提取率也較低。離子交換層析法存 在操作不穩定的問題，不易實現工業化。因此，開發高效的、過程簡單的、容易操作的透明質 酸分離純化方法十分必要。
[0005] 乙醇沉淀是分離各種多糖常用的一種方法，可以使HA有效脫水、脫色，從而提高HA 產品品質。乙醇沉淀法工藝簡單易于實現工業化生產，目前國內外大多數企業在透明質酸 工業化生產工藝中均用到了乙醇沉淀方法。如公開號為CN 101633701A公開的《一種透明質 酸的純化方法》采用的2倍乙醇沉淀透明質酸，公開號為CN 101357955A公開的《一種發酵液 中提取透明質酸的方法》采用的3倍乙醇沉淀透明質酸。然而，乙醇沉淀不僅能夠沉淀透明 質酸，也能夠沉淀透明質酸發酵液中其他很多的雜質組分如蛋白、懸浮雜質、大分子顆粒， 雜多糖等，盲目的向發酵液中加入乙醇沉淀透明質酸，只會使透明質酸分離效果很差，不能 有效的分離發酵液中易堵膜的懸浮雜質、大分子顆粒、菌體殘渣、蛋白等雜質，增加了后續 透明質酸精制純化的工藝操作。迄今為止，國內外文獻與專利中報道的透明質酸純化工藝 在乙醇沉淀步驟中均未實現透明質酸與易堵膜的懸浮雜質、大分子顆粒、菌體殘渣、蛋白等 雜質很好的分離。
[0006] 分級沉淀法是指在混合組分的溶液中加入與該溶液能互溶的溶劑，通過改變溶劑 的極性而改變混合組分溶液中某些成分的溶解度，使其從溶液中析出。在透明質酸發酵液 中分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，可以達到逐級沉淀出分子量段由大到小的蛋白質、多 糖、多肽，通過合理的控制乙醇加入量，實現易堵膜的懸浮雜質、蛋白、粘稠的大分子顆粒、 小分子雜多糖等雜質與透明質酸的有效分離。

【發明內容】

[0007] 本發明根據上述技術背景的不足，提供了一種透明質酸的分離純化工藝，該工藝 方法簡單、成本低廉，可以有效去除易造成堵膜現象的菌體懸浮殘渣、大部分蛋白、粘稠的 大分子顆粒等雜質。
[0008] 本發明提供了一種透明質酸的純化方法，包含以下步驟：
[0009] (1)發酵液中加入CaCl2進行絮凝預處理；
[0010] (2)乙醇沉淀、沉淀物溶解；
[0011] (3)乙醇對溶解液進行分級沉淀；
[0012] ⑷活性炭脫色除雜；
[0013] (5)乙醇沉淀、干燥。
[0014] 在一些實施方案中，向發酵液中加入0.1~0.5 % (w/v)的CaCl2進行絮凝預處理。 [0015] 在一些實施方案中，步驟(2)、步驟(3)和步驟(5)中使用的乙醇為95%乙醇或無水 乙醇。
[0016] 在一些實施方案中，步驟(2)和步驟(5)加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%。 [0017]在一些實施方案中，使用乙醇進行分級沉淀，即先向預處理的發酵液中加入乙醇 至溶液的乙醇濃度為25%-50%進行醇沉除雜，離心或過濾棄除沉淀物雜質后，上清液或濾 液中加入0.5~1.5% (w/v)的無機鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再向溶液中加入乙醇至溶液 的乙醇濃度為60 % -70 %進行醇沉，收集透明質酸沉淀物。
[0018] 在一些實施方案中，步驟(4)中使用1~10% (w/v)的活性炭脫色除雜。
[0019] 在一些實施方案中，步驟(2)中沉淀物溶解，即用純化水或無機鹽溶液溶解沉淀， 使溶解液的電導值為〇~I OmS/cm 〇
[0020] 在一些實施方案中，無機鹽為NaCUKCl或MgCl2。
[0021] 在一些實施方案中，本發明提供了一種透明質酸的純化方法，包含以下步驟：
[0022] (a)向發酵液中加入0.1~0.5% (w/v)的CaCl2進行絮凝預處理，棄除菌體殘渣，得 清液；
[0023] (b)向清液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進行醇沉，沉淀物使用純化 水溶解；
[0024] (c)向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進行醇沉，離心或過濾棄 除沉淀物雜質，上清液或濾液中加入0.5~1.5 % (w/v)的無機鹽固體粉末，攪拌至溶解后， 再向溶液中加乙醇至溶液的乙醇濃度為60%_70%進行醇沉，收集透明質酸沉淀物，沉淀物 使用純化水進行溶解；
[0025 ] (d)沉淀溶解后，使用無機鹽調節溶解液的電導至15~30mS/cm;
[0026] (e)使用1~10%(w/v)的活性炭對溶解液進行脫色，抽濾去除活性炭，得濾液；
[0027] (f)向濾液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%進行沉淀，棄去上清液，沉 淀物用乙醇洗滌；
[0028] (g)沉淀物在30~80°C條件下真空干燥即可。
[0029] 在一些實施方案中，向發酵液中加入0.1~0.5% (w/v)的CaCl2進行絮凝預處理。
[0030] 在一些實施方案中，步驟(b)、步驟(c)和步驟(f)使用的乙醇為95%乙醇或無水乙 醇。
[0031] 在一些實施方案中，步驟(b)、步驟(f)加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%。 [0032]在一些實施方案中，步驟(c)使用乙醇對溶解液進行乙醇分級沉淀，即先向溶解液 中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25%-50%進行醇沉除雜，離心或過濾棄除沉淀物雜質后， 上清液或濾液中加入〇. 5~1.5 % (w/v)的無機鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再向溶液中加入 乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進行醇沉，收集透明質酸沉淀物，沉淀物使用純化水進 行溶解。
[0033] 在一些實施方案中，步驟(c)和步驟(d)使用的無機鹽為NaCUKCl或MgCl2。
[0034] 在一些實施方案中，步驟(d)使用無機鹽調節溶液的電導至15~30mS/cm。
[0035]在一些實施方案中，步驟(e)使用1~10% (w/v)的活性炭進行脫色。
[0036]在一些實施方案中，步驟(g)的沉淀物在30~80°C條件下真空干燥。
[0037]本發明有益效果在于：
[0038]本發明提供的對透明質酸發酵液分離純化方法，采用簡單、易行的乙醇分級沉淀 處理，可以有效去除易造成堵膜現象的菌體懸浮殘渣、大部分蛋白、粘稠的大分子顆粒等雜 質，同時，乙醇分級沉淀處理過程中通過調節發酵液的電導，又可保證較高的透明質酸的收 率。
[0039] 本發明提供的透明質酸發酵液分離純化方法為清潔生產工藝，無添加任何毒害物 質，生產的成品因此更加安全、環保。
【具體實施方式】
[0040] 以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限于以下優選實施方 式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和 改進，都屬于本發明的保護范圍。實施例中所用的原料均可以通過商業途徑獲得。
[0041] 本發明中使用的透明質酸發酵液由東陽光研究院采用以枯草芽孢桿菌為宿主菌 構建的工程菌株發酵罐發酵提供。
[0042]實施例中透明質酸干燥物的純度采用咔唑顯色法測定（參考2015年玻璃酸鈉藥 典），蛋白含量照蛋白含量測定法（中國藥典2010年版二部附錄WM第二法），透明質酸的分 子量采用凝膠色譜法測定(參考2015年玻璃酸鈉藥典），純化收率的計算公式為：
[_]透明麵收率=發。
[0044] 下面簡寫詞的使用貫穿本發明：
[0045] CaCl2 氯化鈣
[0046] NaCl 氯化鈉
[0047] MgCl2 氯化鎂
[0048] % 百分比
[0049] w/v 質量/體積，或質量相對于體積的含量
[0050] Γ 攝氏度
[0051] g 克
[0052] L 升
[0053] mL 毫升
[0054] g/L 克/升
[0055] min 分鐘
[0056] h 小時
[0057] rpm 轉 / 分鐘
[0058] 實施例1.
[0059] (1)取透明質酸發酵液500mL，加0 · 5% (w/v)CaCl2，充分溶解后3900rpm、20min離 心去除菌體殘渣，得上清液；
[0060] (2)向上清液中加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60 %進行醇沉，沉淀物使用等 體積純化水溶解；
[0061 ] (3)先向溶解液中緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為25 %，邊加邊攪拌， 3900rpm、20min離心棄除沉淀物，上清液中加入1.5% (w/v)的NaCl固體粉末，攪拌至完全溶 解;再緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h后分離沉淀 物，用等體積水溶解沉淀物；
[0062] (4)向溶解液中加 NaCl調節溶解液電導至30mS/cm;
[0063] (5)再向溶解液中加入10% (w/v)303A活性炭攪拌IOmin，抽濾棄去活性炭；
[0064] (6)向濾液中緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60 %，邊加邊攪拌，4 °C下靜 置2h后分離沉淀物，沉淀物加入IOOmL無水乙醇進行洗滌；
[0065] (7)在30°C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0066]第(5)步抽濾過程中沒有堵塞現象，得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質酸 分子量及工藝收率的測定與計算結果如表1所示。
[0067] 實施例2.
[0068] (1)取透明質酸發酵液500mL，加0.1 % (w/v)CaCl2，充分溶解后，抽濾去除菌體殘 渣，得濾液；
[0069] (2)向濾液中加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為70 %進行醇沉，沉淀物使用等體 積純化水溶解；
[0070] (3)先向溶解液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為50 %，邊加邊攪拌，抽濾 去除沉淀物雜質，濾液中加入1.5 % (w/v)的KCl固體粉末，攪拌至完全溶解;再加入95 %乙 醇至溶液的乙醇濃度為70%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h后分離沉淀物，用等體積水溶解沉 淀物；
[0071] (4)向溶解液中加 KCl調節溶解液電導至15mS/cm;
[0072] (5)再向溶解液中加入1 % (w/v)303A活性炭攪拌處理IOmin，抽濾棄去活性炭；
[0073] (6)向濾液中緩慢加入95%乙醇至溶液酒精度為70%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h 后分離沉淀物，沉淀物用IOOmL 95%乙醇進行洗滌；
[0074] (7)在80°C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0075] 得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質酸分子量及工藝收率的測定與計算結 果如表1所示。
[0076] 實施例3.
[0077] (1)取透明質酸發酵液IL，加0 · 5% (w/v)CaCh，充分溶解后，3900rpm、20min離心 去除菌體殘渣，得上清液；
[0078] (2)向上清液中加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %進行醇沉，沉淀物使用等 體積純化水溶解；
[0079] (3)先向溶解液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為40 %，邊加邊攪拌， 3900rpm、20min離心去除沉淀物雜質，上清液中加入1.5% (w/v)的MgCh固體粉末，攪拌至 完全溶解;再向過濾后的濾液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %，邊加邊攪拌， 4 °C下靜置2h后分離沉淀物，用等體積水溶解沉淀物；
[0080] (4)向溶解液中加 MgCl 2調節溶解液電導至25mS/cm;
[0081 ] (5)再向溶解液中加入6% (w/v)303A活性炭攪拌處理lOmin，抽濾棄去活性炭；
[0082] (6)向濾液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %，邊加邊攪拌，4°C下靜 置2h后分離沉淀物，沉淀物用IOOmL 95 %乙醇進行洗滌；
[0083] (7)在50 °C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0084] 得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質酸分子量及工藝收率的測定與計算結 果如表1所示。
[0085] 對比實施例1.
[0086]如實施例1所述透明質酸分離純化方法，考察乙醇分級沉淀除雜時發酵液的電導 對乙醇分級沉淀及終產品的影響，其區別在于加入乙醇進行分級沉淀前，分別用NaCl調節 發酵液的電導至2mS/cm、5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm及25mS/cm。得到的干燥物的純度、蛋白 含量、透明質酸分子量及工藝收率的測定與計算結果如表2所示。
[0087]結果表明，發酵液的電導對透明質酸的收率有一定的影響。當加入乙醇至溶液的 乙醇濃度為25%-50%進行沉淀分離雜質時，如果發酵液電導過高，發酵液中部分的透明質 酸也隨大分子顆粒、雜多糖等懸浮雜質一起沉淀下來，造成收率下降，而發酵液低電導條件 下，透明質酸不易沉淀下來，透明質酸保持較高的收率。
[0088] 對比實施例2.
[0089]如實施例1所述透明質酸分離純化方法，考察不使用乙醇分級沉淀對終產品品質 的影響，其區別在于向第⑵步得到的溶解液中加入1.5% (w/v)的NaCl固體粉末，第⑶步 的乙醇分級沉淀改為直接加入無水乙醇至溶液乙醇濃度為60%沉淀。得到的干燥物的純度 僅為56.32 %、蛋白含量為0.67 %、透明質酸分子量為1.3 X 106及工藝收率為70.86%。操作 過程中第(5)步抽濾速度很慢，膜堵塞嚴重，主要原因是發酵液中未去除的懸浮雜質堵膜造 成。 「00901 丟1播昍席釀純麼、令子量乃蛋白僉量涮宙結里
【主權項】
1. 一種透明質酸的分離純化方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 發酵液中加入CaCl 2進行絮凝預處理； (2) 乙醇沉淀、沉淀物溶解； (3) 乙醇對溶解液進行分級沉淀； (4) 活性炭脫色除雜； (5) 乙醇沉淀、干燥。2. 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，向發酵液中加入0.1~0.5% (w/ v)的CaCl2進行絮凝預處理。3. 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(5)加入乙醇至溶 液的乙醇濃度為60%-70%。4. 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(3)中乙醇對溶解液進行分 級沉淀，即先向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進行醇沉除雜，離心或過 濾棄除沉淀物雜質后，上清液或濾液中加入〇. 5~1.5% (w/v)的無機鹽固體粉末，攪拌至溶 解后，再加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%進行醇沉，收集透明質酸沉淀物。5. 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(4)中使用1~10% (w/v)的 活性炭脫色除雜。6. 根據權利要求1-5任意一項所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中沉淀物溶 解，即用純化水或無機鹽溶液溶解沉淀，使溶解液的電導值為0~10mS/cm。7. 根據權利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，其中的無機鹽為NaCl、KCl或 MgCbo8. 根據權利要求1任意一項所述的分離純化方法，其特征在于，包含以下步驟： (a) 向發酵液中加入0.1~0.5%(w/v)的CaCl2進行絮凝預處理，棄除菌體殘渣，得清液； (b) 向清液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進行醇沉，沉淀物使用純化水溶 解； (c) 向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進行醇沉，離心或過濾棄除沉 淀物雜質后，上清液或濾液中加入0.5~1.5% (w/v)的無機鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再 加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進行醇沉，收集透明質酸沉淀物，沉淀物使用純化 水進彳丁溶解； (d) 沉淀溶解后，使用無機鹽調節溶解液的電導至15~30mS/cm; (e) 使用1~10%(w/v)的活性炭對溶解液進行脫色，抽濾去除活性炭，得濾液； (f) 向濾液中加入乙醇至溶液乙醇濃度為60 % -70 %進行沉淀，棄去上清液，沉淀物用 乙醇洗滌； (g) 沉淀物在30~80°C條件下真空干燥即可。9. 根據權利要求8所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(c)和步驟(d)中的無機鹽為 NaCl、KCl 或 MgCh。
【文檔編號】C08B37/08GK105859911SQ201610228235
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月12日
【發明人】石江水, 王海剛, 林小鵲, 趙裕棟, 張鴻
【申請人】廣東東陽光藥業有限公司