一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6及其應用
【專利摘要】本發明提供一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6及其應用。本發明還提供了含有該啟動子的表達盒、重組表達載體和宿主菌。利用本發明的水稻特異性啟動子Psub6驅動抗逆基因表達，使水稻可以抵抗水淹脅迫正常生長，適應日益惡劣的氣候環境，具有重要的現實意義和實用價值。經實驗驗證，本發明的啟動子在與目標基因結合并轉入到水稻植株中之后，在水淹脅迫條件下，水淹3天后即可使目的基因表達量為淹前的6.5倍，水淹6天后可使目的基因表達量達到淹前的14.2倍，進而可以很好地證明，本發明的Psub6啟動子具有顯著的受水淹脅迫誘導性狀。
【專利說明】
一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6及其 應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術和作物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種受水 淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psube及其應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界上重要的糧食作物之一，近年來由于氣候的厄爾尼諾現象，使水稻在 生長階段遭遇干旱或洪澇的極端氣候，嚴重影響了水稻的產量。通過植物基因工程的方法 改良農作物對極端氣候的抗性具有重要的應用前景。啟動子對基因表達的調控啟示我們通 過基因工程改變或添加啟動子來激活抗逆基因的表達，提高農作物的抗逆性。
[0003] 植物工程中常用的啟動子可分為三類:組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導 性啟動子。常用的CaMV35S啟動子就是組成型啟動子，能有效驅動抗逆基因在植物各組織中 表達，增強抗逆性，但在順境中也會大量表達抗逆基因，過量消耗植物能量，降低目標基因 的作用效率，甚至可能產生毒害作用。因此，尋求高效、特異的啟動子是植物基因工程發展 的必然方向。
[0004] 誘導啟動子是指能夠在某些物理或化學信號等的刺激下，顯著地提高轉錄活性的 一類啟動子。與組成型啟動子和組織特異性啟動子相比，誘導啟動子有著獨特的優點：它可 根據需要在植物特定的發育階段、組織器官或生長環境下，快速誘導基因轉錄，適時地調控 "開"與"關"。在植物轉基因研究中，應用誘導啟動子實現在特定環境下啟動目的基因轉錄， 可有效避免因外源基因不必要表達造成的物質能量浪費和對植物的傷害，也能減少人們對 轉基因表達產物長期存留的擔心。目前研究較多的有非生物脅迫誘導啟動子，如光誘導表 達啟動子、溫度誘導表達啟動子和水分誘導表達啟動子，以及生物脅迫誘導啟動子。隨著轉 基因水稻研究的深入，基于轉基因水稻產量、品質與安全性的多元需求，對驅動外源基因表 達的啟動子的要求越來越高。
[0005] 但是，目前對水淹或漬澇脅迫的啟動子的研究并不充分。水稻是一種半水生作物， 對水分的需求量很大，但正常生長的水層深度也有一定范圍，長期沒頂淹水下不能生存。具 體表現為，水稻在淹水條件下，其有氧呼吸收到抑制，水稻由有氧呼吸轉成以生成乙醇的無 氧酵解途徑，進而引發乙醇、R0S、N0等有害物質的生成。同時，淹水條件下，水稻的光合作用 也受到嚴重的抑制，這些都影響了水稻的正常生長，造成減產甚至絕收。
[0006] 而我國水稻產區又主要處在長江淮河流域，經常會有洪澇災害的發生。因此，能夠 開發出在水稻中特異表達的水淹脅迫啟動子具有顯著的經濟和社會價值。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psube及其應 用。
[0008] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性 啟動子Psub6，
[0009] 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列包含序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列；或者
[0010] 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列為與序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者
[0011] 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列為在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或衍生 物;或者
[0012] 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列具有與SEQ ID NO: 1所示的序列雜交的產物。。
[0013] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的序列，本文中稱為Psub6或啟動子Psub6。具體而言，本申請的發明人從日 本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的 DNA序列，并發現這段2122bp的DNA序列能夠驅動目標基因在受水淹脅迫誘導的情況下表 達。
[0014] 優選地，本發明提供的受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psube的DNA序列 為SEQ ID No:l所示的序列，即Psub6或啟動子Psub6。
[0015] 另一方面，本發明還提供一種包含上述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子 Psub6的表達盒。
[0016] 又一方面，本發明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的受水 淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6,在所述重組表達載體中，所述受水淹脅迫誘導 表達的水稻特異性啟動子Psub6連接于待表達的基因序列的上游;優選地，所述待表達的基 因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-Psub6,該重組表達載體為將SEQ ID No:l 所示的序列即Psub6或啟動子Psub6構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱 為pCAMBIA1391-Psub6。
[0017] 或者待表達基因可以為任何對水稻的抗水淹脅迫具有改善能力的基因。
[0018] 再一方面，本發明提供上述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psube在培 育轉基因作物中的應用。所述應用包括將本發明提供的上述受水淹脅迫誘導表達的水稻特 異性啟動子Psube連接于載體的待表達的基因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插 入目標基因之前），從而構建重組表達載體，將所述重組表達載體轉化到作物細胞、組織或 器官中進行培育。
[0019] 再一方面，所述應用可以改良作物抗逆性，所述作物為禾谷類作物:水稻、小麥、高 粱、大麥、燕麥、黑麥等;優選為水稻。
[0020]綜上所述，本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中具有轉錄活性的2122bp的DNA序列，并將其命名為Psub6(序列表中的SEQ ID No: 1)。具體而言，發明人發現該序列具有在受水淹脅迫誘導情況下驅動基因特異性表 達的能力，因而提取出該序列并對上述能力進行了鑒定。發明人將該序列經酶切后連接到 作物雙元表達載體PCAMBIA1391上，獲得相應的重組質粒（即重組表達載體），利用該重組質 粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水 稻植株。對獲得的轉基因水稻進行組織化學檢測發現，水淹處理3天后的Psube-GUS植株葉 片中出現明顯的藍色，代表著Psub6驅動報告基因⑶S表達，而在未處理的Psub6-GUS植株葉 片仍為白色，代表目標啟動子沒有表達。表明Psube啟動子活性受水淹脅迫的誘導，是水淹 誘導啟動子。通過定量PCR檢測報告基因 GUS的表達強度發現，Psub6-GUS植株葉片水淹3天 后GUS表達量為淹前的6.5倍，水淹6天后為淹前的14.2倍，這個結果表明Psub6啟動子受水 淹脅迫的顯著誘導。
[0021 ]技術效果
[0022]本發明所述的受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6可與作物雙元表達 載體連接，用于取代組成型啟動子。在水稻遭遇洪澇災害時，驅動抗逆基因表達，保護水稻 抵抗水淹的逆境脅迫，保障水稻的生產安全，具有重要的理論及實際意義。
【附圖說明】
[0023]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0024] 圖1為將Psub6啟動子構建于pCAMBIA1391載體質粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-Psub6示意圖，其中示出了利用Psub6啟動子驅動位 于其下游的Gus基因表達；
[0025]圖2為對本發明的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。
[0026] 圖3為Psub6-GUS植株⑶S染色結果。水淹處理3天后的Psub6-GUS植株葉片中出現 明顯的藍色，代表著Psub6驅動報告基因⑶S表達，而在未處理的Psub6-GUS植株葉片仍為白 色，代表目標啟動子沒有表達；因此，本實驗表明，Psub6啟動子活性受水淹脅迫的誘導，是 水淹誘導啟動子。圖中標尺為0.2cm 〇
[0027] 圖4為水淹處理不同天數的Psub6-GUS植株中⑶S相對表達強度。Psub6-GUS植株葉 片水淹3天后GUS表達量為水淹前的6.5倍，水淹6天后為水淹前的14.2倍，這個結果表明 Psub6啟動子受水淹脅迫的顯著誘導。
【具體實施方式】
[0028] 以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0029] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0030] 實施例1
[0031] 含有酶切位點的Psub6啟動子的獲得 [0032]步驟1、引物的設計
[0033] 根據NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組 序列，依據水稻啟動子Psube的序列設計擴增引物，并根據選用的載體及靶標基因的特點， 設計引物的酶切位點。
[0034] 本實施例中以水稻雙元表達載體pCAMBIAl 391 (圖1中A部分，來自于CAMBIA，公開 使用載體，安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存） 為例，靶標基因為Gus基因，具體設計的引物為：正向引物5 '端帶酶切位點Hindi 11 (AAGCTT)，反向引物5'端帶酶切位點EcoRI(GAATTC)，引物序列如下(SEQ ID N0:2-3):
[0035] 正向引物：AAGCTTGGACGACTGCTATTGTTGAGAG HindIII
[0036] 反向引物：GAATTCCATGGTGCTCACTACTCACTCA EcoRI [0037]由深圳華大基因公司合成。
[0038]步驟2、啟動子Psub6的獲得
[0039]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴增啟動子Psub6,按常規 PCR體系，采用如下擴增程序：
[0040] 95 °C 預變性 5min; 95 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min30s，35 個循環；最后 72°C 延伸 lOmin。
[00411回收PCR擴增的目的片段，將其連接到PGEM-T-Easy載體(購自Promega公司，按載 體說明書中的比例混合)上，按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞后，經菌落PCR篩 選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用HindIII和EcoRI進行雙酶切驗證，目的片段 長度2122bp，如圖2所示。將經過鑒定的陽性克隆送交Invitrogen公司測序。驗證正確的克 隆即為所要獲得的啟動子Psub6,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0042]重組表達載體的構建和農桿菌的轉化
[0043]從上面"啟動子Psub6的獲得"過程中獲得的陽性克隆中提取質粒，用HindII I和 EcoRI雙酶切，回收啟動子Psub6片段。同時利用HindIII和EcoRI對pCAMBIA1391進行線性化 處理、回收PCAMBIA1391，將上述的Psub6片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA連接酶（購于 TaKaRa公司）進行連接，得到啟動子Psub6與Gus基因融合的作物表達載體pCAMBIA1391-Psub6(圖1B)，利用凍融法將作物表達載體轉入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存）。
[0044] 利用啟動子Psub6驅動Gus報告基因在水稻中表達
[0045] 步驟1:農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0046] 將成熟水稻種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween 20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉 次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種 子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養基上。30°C下暗培養11天后將愈傷組織與 胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養3~5天后用于 農桿菌轉化。
[0047] 采用上述"重組表達載體的構建和農桿菌的轉化"過程中轉入了重組表達載體的 根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參 照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.) [J] .Plant Cell Report，2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。獲得 Psub6-GUS株系植株。
[0048] 步驟2、水淹脅迫實驗
[0049] 1 · Psub6_GUS 株系 GUS 染色
[0050] 將Psube-GUS株系種子消毒后，于無菌條件下在浸潤有超純水的濾紙上萌發，注意 超純水不要沒過種子。在萌發5天后，將材料按數量均分為兩份，其中一份繼續在濾紙上有 氧萌發3天作為對照；另一份置于IOcm深無菌水底部，在28°C，16小時光照/8小時黑暗條件 下水淹處理3天。剪取對照和水淹處理材料的葉片，用于⑶S組織化學染色，參照Jefferson (Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J] .EMBO J.，1987,6:3901_3907)等提出的方法。 將需要染色的組織抽真空，然后浸入染色液中，在⑶S染液中染色0.5小時后，即可觀察結果 (見圖3)。水淹處理3天后的Psub6-GUS植株葉片中出現明顯的藍色，代表著Psub6驅動報告 基因 GUS表達，而在未處理的Psub6-GUS植株葉片仍為白色，代表目標啟動子沒有表達；因 此，本實驗表明，Psub6啟動子活性受水淹脅迫的誘導，是水淹誘導啟動子。
[0051 ] 2 · Psub6-GUS株系⑶S定量分析
[0052]取萌發后21天的水稻植株，將全株完全置于水面下進行水淹處理。分別在水淹前 (0天），淹后3天和6天剪取葉片材料，通過定量PCR檢測報告基因⑶S的表達強度。RT-PCR采 用天根生化科技有限公司的SuperReal熒光定量預混液試劑盒（TIANGEN SYBR Green， FP205)。以水稻ACTIN基因作為內參基因對所用RNA模板量進行定量。每個基因做3次重復。 本實驗用到的基因的定量引物為(SEQ ID NO 4-7):
[0053] ACTIN-FP:5 '-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'，
[0054] ACTIN-RP:5 '-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3 '
[0055] 用于ACTIN的擴增；
[0056] Gus-FP:5 '-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3 '
[0057] Gus-RP:5 '-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3 '
[0058] 用于⑶S的擴增。
[0059] 實驗結果見圖4，？8仙6-61^植株葉片水淹3天后^3表達量為淹前的6.5倍，水淹6 天后為淹前的14.2倍，這個結果表明Psub6啟動子受水淹脅迫的顯著誘導。
[0060] 以上對本發明【具體實施方式】的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本 發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范 圍。
【主權項】
1. 一種受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6,其特征在于，所述啟動子 Psub6能夠驅動目的基因在水淹脅迫條件下誘導表達。2. 根據權利要求1所述的受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6,其特征在 于， 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列;或者 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列為與序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列為在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或衍生物； 或者 所述受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6的DNA序列具有與SEQ ID N0:1所 示的序列雜交的產物。3. -種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求2所述的受水淹脅迫誘導表達的 水稻特異性啟動子Psub6。4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權利要求2所述的受水淹脅 迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6,在所述重組表達載體中，所述受水淹脅迫誘導表達 的水稻特異性啟動子Psub6連接于載體中待表達的基因序列的上游。5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為 pCAMBIA1391-Psub6,其中pCAMBIA1391為作物雙元表達載體，所述待表達的基因為Gus基 因；或者所述待表達的基因是抗逆境脅迫基因。6. -種根據權利要求2所述的受水淹脅迫誘導表達的水稻特異性啟動子Psub6在培育 轉基因作物中的應用，其特征在于，所述應用包括:將權利要求2所述的受水淹脅迫誘導表 達的水稻特異性啟動子Psub6連接于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載 體;將所述重組表達載體轉化到作物細胞、組織或器官中進行培育，進而獲得相應轉基因植 株。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用用于改良作物抗逆性，所述作物 為禾谷類作物:水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥或黑麥。8. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，在對所述重組表達載體進行轉化時，所采 用的轉化方法為農桿菌介導方法。9. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用包括： A) 、以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴增所述受水淹脅迫誘導 表達的水稻特異性啟動子Psub6; B) 、將所擴增的目的片段與待表達的基因相連，進而獲得相應重組表達載體； C) 、利用凍融法將所獲得的重組表達載體轉入根癌農桿菌中； D) 、通過農桿菌介導方法利用所獲得的根癌農桿菌對水稻愈傷組織進行遺傳轉化； E) 、利用轉化后的水稻愈傷組織培育相應的水稻植株。
【文檔編號】C12N15/84GK105861507SQ201610389753
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】秦瑞英, 楊劍波, 李 浩, 李娟 , 魏鵬程, 楊亞春, 李莉, 許蓉芳
【申請人】安徽省農業科學院水稻研究所