表達人血清白蛋白的靶向載體及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種可利用轉基因雞的雞蛋生產人血清白蛋白的靶向載體，涉及自主 設計、克隆多個適合人血清白蛋白在雞蛋蛋清中表達的調控反應元件以及能夠使人血清白 蛋白重組于雞卵清白蛋白序列的元件，并進行基因工程克隆，構成人血清白蛋白在雞輸卵 管組織特異性表達的基因打靶載體R〇SA26-shALBl，此載體的構建是后期獲得能夠在蛋清 中表達人血清白蛋白的轉基因雞的核心技術，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 人血清白蛋白是由585個氨基酸組成的單鏈蛋白質，分子量為67kDa，白蛋白是血 漿中含量最高的蛋白質。白蛋白具有維持血液滲透壓、抗休克、運輸與解毒、促進肝細胞修 復與再生等作用，是國際上使用最多的血液制品。臨床上主要用于燒傷、失血性休克、水腫、 低蛋白血癥等的治療。
[0003] 醫用血清白蛋白的傳統獲得方法是從健康人血漿中提取，但由于血漿制品具有污 染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使該方法受到很大限制，難以得到足夠的血液 制品。目前我們國家每年需要白蛋白120噸，而通過獻血能制備的白蛋白僅為所需求量的 1/3,因此，白蛋白供應嚴重緊缺。
[0004] 目前重組生物制藥中普遍采用酵母、大腸桿菌發酵制備，但此方法存在諸多的缺 點，例如：微生物與人體環境差異大，表達產品生物活性低、摻雜的微生物毒素難以徹底去 除，生產工藝復雜，很難形成規模化生產。因此，迄今為止，還沒有相關產品上市。最近也有 國際公司利用轉基因技術制備轉基因動物來制備人重組蛋白產品，與傳統的微生物表達系 統相比，動物生物反應器具有以下特點：1)生產的蛋白質生物活性高，能夠對重組蛋白質進 行多種翻譯后加工，非常接近天然產品；2)表達量大、成本低；3)產品易提純、質量高，避免 了其他生產方式的化學及生物毒素的污染，安全可靠；4)易產業化：轉移的目的基因能夠 遺傳，使某一群體都具有同一特性，可通過動物繁殖擴群，進行規模化生產。但人類基因是 隨機插入動物的基因組內，雖然與微生物發酵相比有很大優勢，但也存在著很多不可控的 因素和缺陷，有很大的改進空間：1)目的基因的整合與表達的效率較低；2)有可能引起宿 主細胞基因突變；3)轉基因模型與預期結果不符，或表達個體的機能紊亂；4)動物本身的 相應的蛋白仍在表達，純化中很難去掉，容易引起人類的過敏反應。因此，轉基因動物還不 是理想的生物反應器。
[0005] 綜上，尋求一種合適的表達人血清白蛋白的方法是亟需解決的問題。

【發明內容】

[0006] 針對上述現有技術，本發明提供了一種表達人血清白蛋白的靶向載體及其構建方 法。本發明構建的載體能夠使人血清白蛋白整合在雞基因組中并以雞的卵清白蛋白為標靶 的進行基因敲入，將該載體轉化入雞的生殖細胞、得到轉基因雞后，其產生的卵（雞蛋）中將 特異性地表達人血清白蛋白。本發明通過基因重組技術對雞進行遺傳修飾，改變其基因組 的組成，培育出能夠在雞卵(雞蛋）中表達人類血清白蛋白的轉基因雞，并且確保這種遺傳 修飾的改變能夠被子代繼承，長久的傳遞下去。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 為滿足上述的實驗設計，本發明將適合人血清白蛋白在雞蛋蛋清中表達的調控反 應元件以及人血清白蛋白的基因重組于雞卵清白蛋白序列的元件，并進行基因工程克隆， 構成人血清白蛋白在雞輸卵管組織特異性表達的基因打靶載體R〇SA26-shALBl，具體技術 方案如下：
[0009] -種表達人血清白蛋白的靶向載體，構建圖譜如圖1所示，結構為：包含有人血清 白蛋白基因（序列如SEQ ID NO. 2所不，所表達的蛋白序列如SEQ ID NO. 1所不)，以及進打 同源重組的雞源的兩個同源序列：5'同源臂、3'同源臂，5'同源臂為1.7kb (SEQ ID NO. 3 所示)，3'同源臂為5. 2kb (SEQ ID NO. 4所示)，人血清白蛋白基因的5'端連接有kozak序 列，kozak序列為GCCACC，同時還包含有進行藥物篩選的neo基因和報告基因 EGFP。
[0010] 所述表達人血清白蛋白的靶向載體的構建方法，該方法的關鍵在于構建一種可以 準確的將人血清白蛋白插入到PGC細胞的基因組中并能夠成功表達人血清白蛋白的基因 定點插入的載體，應用這種載體通過顯微注射技術將完成遺傳物質修飾的PGC細胞轉入胚 胎中，能夠獲得轉基因雞。該轉基因雞的輸卵管細胞以及生殖細胞可由被修飾的PGC細胞 發育而成，在形成卵的過程中表達產生人血清白蛋白，并且在其后代中穩定的傳遞轉基因 修飾，產生子代轉基因雞。構建方法具體如下 ：
[0011] 通過NCBI進行檢索，得到目的基因（人血清白蛋白的基因）后，設計特異性引物， 進行5'同源臂、3'同源臂和人血清白蛋白基因的擴增（人血清白蛋白基因擴增后，在5' 端增加了一個kozak序列）；然后，以EGFP-R0SA-26基因打靶載體(該載體記載在參考文 獻：Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Sasaki et al (Immunity. 2006Jun. 24(6) :729-39. PubMed))為基礎，用于進行定點插入人血清白蛋 白基因整合：用pBluescript II SK( + )載體(商品化的載體)構建同源臂與人血清白蛋白基 因融合(先將5'同源臂重組到pBluescript II SK( + )載體上，再將人血清白蛋白基因重組 到pBluescript II SK ( + )載體上，利用特異性引物將5'同源臂與人血清白蛋白基因的融 合基因克隆下來)，然后將融合基因連接到EGFP-R0SA-26基因打靶載體上(利用infusion 試劑，該試劑為商品化產品），再將3'同源臂連接到EGFP-R0SA-26基因打靶載體上，即得表 達人血清白蛋白的靶向載體；所有序列經過PCR獲得。
[0012] 所述特異性引物如下：
[0013] 用于擴增5'同源臂的引物為F1、F2:
[0014] Fl :5, -CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3,；如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0015] F2 :5, -CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3,；如 SEQ ID NO. 6 所示；
[0016] 用于擴增人血清白蛋白基因的引物為F3、F4 :
[0017] F3 :5' -CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3' ；如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0018] F4 :5' -CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3' ；如 SEQ ID NO. 8 所示；
[0019] 用于擴增3'同源臂的引物為F5、F6 :
[0020] F5 :5, -TTCCACATCCACCGGTTGGTTTATTTAGAGTGGCA-3,；如 SEQ ID NO. 9 所示；
[0021] F6 :5, -GTTGGCGCCTACCGGACTGGCAGGGCTTATTTTCA-3,；如 SEQ ID NO. 10 所示；
[0022] 引物F7, F8用于將連接到pBluescript II SK ( + )載體上的5'同源臂+人血清 白蛋白基因克隆并加上infusion試劑連接所需的同源臂：
[0023] F7 :5, -TCTTTCCAGTGGTTAGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3,；如 SEQ ID NO. 11 所示；
[0024] F8 :5, -ATACGAAGTTATTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3,；如 SEQ ID NO. 12 所示。
[0025] 上述方法中：
[0026] 5'同源臂與人血清白蛋白融合基因上包含（5' -3'順序）5'同源臂（1.7kb)， 為雞卵清蛋白基因上游序列，包含有卵清蛋白啟動子，5'同源臂兩端引入兩個酶切位點 5, NotI/3, XmaI ;
[0027] Kozak (9bp)+人血清白蛋白cDNA序列（1.8kb)含有終止密碼子，kozak序列存在 于真核生物mRNA的一段序列，其在翻譯的起始中有重要作用能夠增強基因表達，酶切位點 引入 5, XmaI/3, ClaI ;
[0028] 3'同源臂（5. 2kb)雞卵清白蛋白序列中不引入酶切位點，通過infusion試劑連 接。
[0029] 5'同源臂，kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列和3'同源臂均為PCR擴展產物，將 kozak序列設計到引物中連接到人血清白蛋白cDNA序列的5'端；5'同源臂、kozak9bp+人 血清白蛋白cDNA序列先連接到pBluescript II SK ( + )再連接到EGFP-R0SA-26載體上。
[0030] 所述表達人血清白蛋白的靶向載體在制備轉基因雞中的應用：將上述的表達人 血清白蛋白的靶向載體轉化雞的原始生殖細胞，經過培養篩選后，利用顯微注射技術，將轉 化成功的原始生殖細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞，該轉基因雞繁殖后，其產生的卵 (雞蛋）中將會特異性地表達人血清白蛋白，而轉基因雞的其它細胞并不會表達人血清白蛋 白。
[0031] 一種獲得表達人血清白蛋白的轉基因雞的方法，步驟為：通過同源重組的方法(原 理圖如圖3所示)將上述表達人血清白蛋白的靶向載體重組入雞的卵清白蛋白基因中，然后 將轉化成功的重組細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞，該轉基因雞繁殖后，其產生的卵 (雞蛋）中將會特異性地表達人血清白蛋白（以雞輸卵管為生物反應發生器)，而轉基因雞的 其它細胞并不會表達人血清白蛋白。
[0032] -種制備生物反應器的方法，所述生物反應器由轉基因雞輸卵管組成，方法包括 用上述構建的表達人血清白蛋白的靶向載體制備轉基因雞。
[0033] -種從轉基因雞輸卵管產生人血清白蛋白的方法，步驟為：通過同源重組的方法 將上述表達人血清白蛋白的靶向載體重組入雞的卵清白蛋白基因中，然后將轉化成功的重 組細胞注射入雞胚胎中，培育出轉基因雞，培育轉基因雞雌雄性個體至性成熟并傳代(為增 加產量，可分析或Fl代雌性轉基因雞個體所產的雞蛋蛋清組分中人血清白蛋白的含量， 選擇高產個體作為生物反應器的宿主動物或作為生物反應器種雞)，然后從轉基因雞雌性 個體所產的雞蛋中分離純化人血清白蛋白。
[0034] 本發明通過基因敲入的方法將人血清白蛋白基因定點的插入到雞的基因組中，以 雞的輸卵管作為生物反應器表達目的蛋白。本發明通過同源重組的方法選擇性的將目的片 段插入雞卵清蛋白基因中，這樣的操作不會產生宿主其它部位基因的突變，而且能夠很好 的破壞其本身的卵清白蛋白表達，更重要的是，雞的卵清白蛋白只在輸卵管中表達，本發明 引入的基因不會在雞體內其他的部位表達。因此，相對于其它方法，本發明利用轉基因雞 生產人血清白蛋白有