名為“140072 SEQUENCE LISTING_ST25”的(de)序列表(48KB)創建(jian)于2015年9月16日，并通過引(yin)用并入本文(wen)。

發明領域

本發(fa)(fa)明涉(she)及(ji)(ji)能夠同時(shi)結合組織(zhi)因子途徑抑制劑(TFPI)的N-末端(duan)區域(殘基1-161)內的兩個表位的雙(shuang)特異性抗體(ti)及(ji)(ji)其組合物。本發(fa)(fa)明還(huan)涉(she)及(ji)(ji)這類抗體(ti)的制藥和治(zhi)療用途。

背景

在出(chu)血(xue)(xue)(xue)的(de)(de)個(ge)體中(zhong)(zhong)，當血(xue)(xue)(xue)管(guan)(guan)外TF暴露于血(xue)(xue)(xue)液中(zhong)(zhong)的(de)(de)FVIIa時，組織因子(zi)(zi)/因子(zi)(zi)VIIa(TF/FVIIa)復(fu)合(he)(he)(he)物(wu)引發(fa)凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)。TF/FVIIa復(fu)合(he)(he)(he)物(wu)的(de)(de)形(xing)成導致因子(zi)(zi)X(FX)活(huo)(huo)化為(wei)FXa，該(gai)(gai)FXa與活(huo)(huo)化的(de)(de)因子(zi)(zi)V(FVa)一(yi)起生(sheng)成有限量的(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)。小(xiao)量凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)會激活(huo)(huo)血(xue)(xue)(xue)小(xiao)板(ban)，這繼而導致血(xue)(xue)(xue)小(xiao)板(ban)磷脂(zhi)的(de)(de)表面(mian)暴露，該(gai)(gai)血(xue)(xue)(xue)小(xiao)板(ban)磷脂(zhi)支持由活(huo)(huo)化的(de)(de)因子(zi)(zi)VIII(FVIIIa)和因子(zi)(zi)IX(IXa)組成的(de)(de)tenase復(fu)合(he)(he)(he)物(wu)的(de)(de)裝配和結合(he)(he)(he)。tenase復(fu)合(he)(he)(he)物(wu)是(shi)非常有效(xiao)的(de)(de)FX活(huo)(huo)化催化劑，并且在該(gai)(gai)第二步中(zhong)(zhong)生(sheng)成的(de)(de)FXa充當引起最終凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)爆發(fa)的(de)(de)FVa/FXa凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)原酶(mei)(mei)(mei)(mei)(pro-thrombinase)復(fu)合(he)(he)(he)物(wu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)活(huo)(huo)性蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)。凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)切(qie)割纖(xian)維蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)原產(chan)生(sheng)纖(xian)維蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)單(dan)體，該(gai)(gai)纖(xian)維蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)單(dan)體聚合(he)(he)(he)而形(xing)成密(mi)封滲漏的(de)(de)血(xue)(xue)(xue)管(guan)(guan)并阻止出(chu)血(xue)(xue)(xue)的(de)(de)纖(xian)維蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)網(wang)絡。快速且廣(guang)泛(fan)的(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)(mei)爆發(fa)是(shi)形(xing)成固態和穩(wen)定的(de)(de)纖(xian)維蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)塊的(de)(de)先決條件。

由(you)FVIII或(huo)FIX缺(que)乏引(yin)起的(de)(de)FXa和(he)凝血(xue)酶生(sheng)成(cheng)上不(bu)(bu)充分的(de)(de)放大分別是A型(xing)血(xue)友(you)(you)病和(he)B型(xing)血(xue)友(you)(you)病患(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)出(chu)血(xue)素質的(de)(de)潛在(zai)(zai)原因。在(zai)(zai)血(xue)友(you)(you)病患(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)，FXa生(sheng)成(cheng)主要由(you)TF/FVIIa復(fu)合物驅動(dong)，因為FVIII或(huo)FIX缺(que)乏僅(jin)導(dao)致通過tenase復(fu)合物的(de)(de)不(bu)(bu)完全的(de)(de)FXa生(sheng)成(cheng)。然而，TF/FVIIa介導(dao)的(de)(de)FX向(xiang)FXa的(de)(de)活(huo)(huo)化(hua)是暫時的(de)(de)，因為組織因子途(tu)徑抑(yi)制(zhi)劑(ji)(TFPI)在(zai)(zai)自調節環路中(zhong)(zhong)抑(yi)制(zhi)因子Xa和(he)TF/FVIIa復(fu)合物。反(fan)饋抑(yi)制(zhi)導(dao)致TF/FVIIa/FXa/TFPI復(fu)合物的(de)(de)形成(cheng)。在(zai)(zai)凝血(xue)啟動(dong)過程(cheng)中(zhong)(zhong)，中(zhong)(zhong)和(he)TFPI抑(yi)制(zhi)使TF/FVIIa介導(dao)的(de)(de)FX活(huo)(huo)化(hua)延(yan)長(chang)，從而促進由(you)于tenase活(huo)(huo)性(xing)受損而導(dao)致FXa生(sheng)成(cheng)不(bu)(bu)足的(de)(de)血(xue)友(you)(you)病患(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)中(zhong)(zhong)的(de)(de)止血(xue)，該tenase活(huo)(huo)性(xing)受損是由(you)例如FVIII或(huo)FIX缺(que)乏引(yin)起的(de)(de)。

在(zai)(zai)凝血啟動后，TF/FVIIa介導的(de)(de)FXa生成被(bei)(bei)TFPI緊(jin)密下調。TFPI是一種緩(huan)慢(man)的(de)(de)緊(jin)密結(jie)合(he)的(de)(de)競爭性(xing)(xing)(xing)(xing)抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)，其(qi)通過(guo)抑(yi)(yi)制TF-FVIIa和FXa兩者(zhe)來調節FX活(huo)化和活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。當FXa與TF/FVIIa復(fu)合(he)物(wu)結(jie)合(he)或在(zai)(zai)其(qi)附近結(jie)合(he)到膜上時，TF/FVIIa在(zai)(zai)作(zuo)為限(xian)速步驟涉及FXa的(de)(de)TFPI抑(yi)(yi)制的(de)(de)過(guo)程中被(bei)(bei)TFPI抑(yi)(yi)制(Baugh等人，1998，JBC，273：4378-4386)。FXa的(de)(de)TFPI抑(yi)(yi)制發生在(zai)(zai)兩相反應(ying)中，該(gai)反應(ying)最初(chu)導致松散的(de)(de)TFPI-FXa復(fu)合(he)物(wu)，該(gai)復(fu)合(he)物(wu)緩(huan)慢(man)地(di)重排成緊(jin)密結(jie)合(he)的(de)(de)TFPI-FXa復(fu)合(he)物(wu)，其(qi)中TFPI的(de)(de)第(di)二Kunitz型(xing)抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)結(jie)構(gou)(gou)域(yu)(KPI-2)結(jie)合(he)并阻(zu)斷FXa的(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)位點。TFPI的(de)(de)第(di)一Kunitz型(xing)抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)結(jie)構(gou)(gou)域(yu)(KPI-1)有助于緊(jin)密TFPI-FXa復(fu)合(he)物(wu)的(de)(de)形成，并且其(qi)直接(jie)結(jie)合(he)并阻(zu)斷TF結(jie)合(he)的(de)(de)FVIIa的(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)位點。

能(neng)(neng)(neng)夠結(jie)合(he)TFPI的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)是本領域(yu)已知(zhi)的(de)(de)(de)(de)。例(li)(li)如(ru)，WO2010/072691、WO2012/001087和(he)WO2012/135671公開了單(dan)(dan)(dan)克隆(long)(long)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(mAb)，其(qi)中(zhong)每一種均能(neng)(neng)(neng)夠與TFPI的(de)(de)(de)(de)一個(ge)特(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)表位(wei)(wei)結(jie)合(he)。以下(xia)限制(zhi)可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)適(shi)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)靶向單(dan)(dan)(dan)個(ge)TFPI表位(wei)(wei)(例(li)(li)如(ru)KPI結(jie)構域(yu)上(shang)的(de)(de)(de)(de))的(de)(de)(de)(de)這類抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)，這通常(chang)局限于(yu)(yu)(yu)由單(dan)(dan)(dan)個(ge)可(ke)(ke)變區(qu)(qu)限定的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)互補位(wei)(wei)區(qu)(qu)域(yu)。首先，TF/FVIIa/FXa復合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)最終抑(yi)制(zhi)依賴(lai)于(yu)(yu)(yu)分散在TFPI上(shang)的(de)(de)(de)(de)互補區(qu)(qu)域(yu)與TF/FVIIa/FXa復合(he)物(wu)(wu)之間的(de)(de)(de)(de)幾種相互作(zuo)用(yong)(yong)。這不(bu)僅適(shi)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)TFPI的(de)(de)(de)(de)KPI-1和(he)KPI-2分別與FVIIa和(he)FXa的(de)(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)位(wei)(wei)點的(de)(de)(de)(de)直接結(jie)合(he)，還適(shi)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)與TF/FVIIa/FXa外結(jie)合(he)位(wei)(wei)點(exosite)的(de)(de)(de)(de)相互作(zuo)用(yong)(yong)，該相互作(zuo)用(yong)(yong)涉及TFPI的(de)(de)(de)(de)N-和(he)C-末端區(qu)(qu)的(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域(yu)。例(li)(li)如(ru)結(jie)合(he)單(dan)(dan)(dan)個(ge)KPI的(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)克隆(long)(long)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)不(bu)能(neng)(neng)(neng)完全阻(zu)(zu)斷TFPI的(de)(de)(de)(de)所有抑(yi)制(zhi)功能(neng)(neng)(neng)，特(te)別是在生(sheng)理上(shang)升高的(de)(de)(de)(de)TFPI濃度下(xia)。其(qi)次，單(dan)(dan)(dan)特(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)效力(li)可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)受到抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)親和(he)力(li)和(he)/或TPFI分子柔(rou)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)阻(zu)(zu)礙，這兩(liang)者都將(jiang)需要高劑量的(de)(de)(de)(de)前者。第三，由于(yu)(yu)(yu)TFPI-mAb復合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)腎清除率降低，或由于(yu)(yu)(yu)因(yin)TFPI-mAb復合(he)物(wu)(wu)形成而(er)減弱的(de)(de)(de)(de)其(qi)它清除機制(zhi)，用(yong)(yong)單(dan)(dan)(dan)克隆(long)(long)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)靶向TFPI可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)會導(dao)致TFPI在循環中(zhong)積累(lei)。

本發明(ming)人預期本文公開(kai)的(de)雙(shuang)特異性抗(kang)體可(ke)以解決這些限制。

技術實現要素：

本發明涉及(ji)一種(zhong)能夠(gou)特(te)異性結合人TFPI(SEQ ID NO：1)的(de)位(wei)置1至161內的(de)第(di)一表位(wei)和第(di)二表位(wei)的(de)雙特(te)異性抗體。

在(zai)一(yi)(yi)(yi)個方(fang)面，該雙特異(yi)性(xing)抗體的(de)第一(yi)(yi)(yi)表(biao)位可(ke)在(zai)人(ren)TFPI的(de)位置1-96內，如位置1-76內，如Kunitz型抑制劑1(KPI-1)結(jie)構域(殘基(ji)(ji)26-76)內。該KPI-1表(biao)位可(ke)包含SEQ ID NO：1的(de)氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)Arg 41、Arg 65和/或(huo)Glu 67中(zhong)的(de)一(yi)(yi)(yi)個或(huo)多個，并(bing)且(qie)可(ke)進一(yi)(yi)(yi)步包含SEQ ID NO：1的(de)氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Phe 66、Glu 71和Met 75中(zhong)的(de)一(yi)(yi)(yi)個或(huo)多個。

在一個(ge)方面，該雙特異(yi)性抗體的(de)第二表位(wei)可(ke)在人(ren)TFPI的(de)位(wei)置77-161內，如位(wei)置97-161內，如Kunitz型抑(yi)制(zhi)劑2(KPI-2)結(jie)構(gou)域(殘(can)基(ji)(ji)97-147)內。該KPI-2表位(wei)可(ke)包(bao)含SEQ ID NO：1的(de)氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)Arg 107，并且可(ke)進一步包(bao)含SEQ ID NO：1的(de)氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)Glu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126和Leu 140中的(de)一個(ge)或多個(ge)。

本發(fa)明(ming)的(de)雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)(ti)可(ke)以(yi)是IgG形式(shi)，如(ru)(ru)全(quan)長(chang)IgG形式(shi)，或(huo)者可(ke)以(yi)是兩個抗(kang)體(ti)(ti)片(pian)段的(de)化學綴合物(wu)，如(ru)(ru)兩個Fab片(pian)段或(huo)scFv片(pian)段的(de)綴合物(wu)，或(huo)其組合。該(gai)雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)(ti)優選(xuan)是人抗(kang)體(ti)(ti)或(huo)人源化抗(kang)體(ti)(ti)。

本發明還涉及一種包(bao)含根據本發明的(de)雙特(te)異(yi)性(xing)(xing)抗體和(he)藥學(xue)上可接(jie)受的(de)載體的(de)藥物(wu)組合物(wu)。所述雙特(te)異(yi)性(xing)(xing)抗體或包(bao)含該(gai)抗體的(de)組合物(wu)可用(yong)(yong)作(zuo)藥物(wu)。所述藥物(wu)可用(yong)(yong)于治(zhi)療先(xian)天性(xing)(xing)、獲得性(xing)(xing)和(he)/或醫源(yuan)性(xing)(xing)凝血(xue)障礙，如具(ju)有(you)(you)或不具(ju)有(you)(you)抑制物(wu)的(de)A型血(xue)友(you)病，以及具(ju)有(you)(you)或不具(ju)有(you)(you)抑制物(wu)的(de)B型血(xue)友(you)病。

附圖簡述

圖1：在(zai)TFPI水平升高的(de)(de)A型血(xue)(xue)友病樣條件下(xia)的(de)(de)人(ren)血(xue)(xue)漿中(zhong)，某些TFPI(1-79)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)及TFPI KPI-2抗(kang)(kang)體(ti)(ti)mAb 2021增強(qiang)了凝(ning)血(xue)(xue)酶生成。曲線(xian)(a)顯示了在(zai)沒(mei)(mei)有另(ling)外添(tian)加(jia)的(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia)于(yu)正常人(ren)血(xue)(xue)漿中(zhong)獲得的(de)(de)結(jie)果(guo)。曲線(xian)(b)顯示了通過添(tian)加(jia)100μg/ml FVIII抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(HTI PAHFVIII-S)和(he)20nM全長TFPIα獲得A型血(xue)(xue)友病樣條件時(shi)的(de)(de)結(jie)果(guo)。由20nM TFPIα聯合FVIII中(zhong)和(he)導致的(de)(de)凝(ning)血(xue)(xue)酶生成的(de)(de)抑制不受添(tian)加(jia)200nM TFPI(1-79)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)mAB 1F91(c)的(de)(de)影響。200nM TFPI(1-79)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)mAb 2F22(d)和(he)KPI-2抗(kang)(kang)體(ti)(ti)mAb 2021(e)的(de)(de)添(tian)加(jia)確(que)實逆轉了凝(ning)血(xue)(xue)酶的(de)(de)生成，但沒(mei)(mei)有使其完(wan)全恢復至在(zai)沒(mei)(mei)有FVIII抗(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia)于(yu)正常人(ren)中(zhong)獲得的(de)(de)水平(曲線(xian)(a))。

圖2：在TFPI水平升高的(de)(de)(de)(de)(de)A型血友(you)病樣條件下(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)血漿(jiang)(jiang)中，通過(guo)將TFPI(1-79)與(yu)TFPI-KPI-2抗(kang)(kang)體(ti)組合(he)大(da)大(da)增強(qiang)了凝(ning)血酶生成(cheng)。曲線(a)顯(xian)示了在沒有另外(wai)添加的(de)(de)(de)(de)(de)情況下(xia)(xia)于正(zheng)常(chang)人(ren)血漿(jiang)(jiang)中獲得的(de)(de)(de)(de)(de)結果。曲線(b)顯(xian)示了通過(guo)添加100μg/ml FVIII抗(kang)(kang)體(ti)(HTI PAHFVIII-S)、20nM TFPIα和(he)(he)200nM KPI-2抗(kang)(kang)體(ti)mAb 2021獲得A型血友(you)病樣條件時(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)結果。通過(guo)將100nM mAb 2021與(yu)100nM TFPI(1-79)抗(kang)(kang)體(ti)mAb 1F91(c)或mAb 2F22(d)組合(he)，(b)中采(cai)用200nM mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)不完全中和(he)(he)得到逆轉。(c)和(he)(he)(d)中TFPI(1-79)與(yu)KPI-2抗(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)組合(he)導(dao)致(zhi)了比正(zheng)常(chang)人(ren)血漿(jiang)(jiang)(a)更高的(de)(de)(de)(de)(de)凝(ning)血酶峰值。

圖3：來自TFPI FL與被捕獲的雙特異性抗體(ti)mAb 0421和BiFab 9041結合的結果(guo)。

序列簡述

SEQ ID NO：1代表人TFPIα的氨基酸(suan)序列(lie)。

SEQ ID NO：2代表TFPI(1-161)的氨(an)基酸序列。

SEQ ID NO：3代(dai)表(biao)標記(ji)的(de)跨越KPI-2的(de)TFPI片段的(de)氨基酸序列。

SEQ ID NO：4代表單克隆抗體(mAb)2F3的可變(bian)重鏈(lian)的氨基酸序(xu)列。

SEQ ID NO：5代表單克(ke)隆抗體(mAb)2F3的(de)可(ke)變(bian)輕鏈的(de)氨(an)基酸序列。

SEQ ID NO：6代(dai)表(biao)單克隆(long)抗(kang)體(mAb)2F22的(de)可變(bian)重鏈的(de)氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：7代表單克隆抗(kang)體(ti)(mAb)2F22的可變輕鏈(lian)的氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：8代表單克隆抗體(mAb)2F45的(de)可變重鏈的(de)氨基(ji)酸序(xu)列。

SEQ ID NO：9代(dai)表(biao)單克(ke)隆抗體(mAb)2F45的可變輕鏈的氨基(ji)酸(suan)序列。

SEQ ID NO：10代表單克(ke)隆抗體(ti)(mAb)1F91的(de)可變重鏈的(de)氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：11代表單克隆抗體(mAb)1F91的(de)可變輕鏈的(de)氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：12代(dai)表用于(yu)克隆抗體(ti)重鏈的(de)引(yin)物的(de)核酸序列(lie)。

SEQ ID NO：13代表用于克隆(long)抗(kang)體輕鏈的引物(wu)的核(he)酸序列(lie)。

SEQ ID NO：14代表Fab 0296的(de)(de)截(jie)短的(de)(de)鼠-人(ren)嵌合重鏈的(de)(de)氨基酸序列(lie)。

SEQ ID NO：15代表單克隆抗體mAb 0294、Fab 0296、Fab 0295和mAb 0336的鼠-人嵌合輕鏈的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16代表標(biao)記的TFPI KPI-1/N-末(mo)端(TFPI(1-79))的氨基酸序列(lie)。

SEQ ID NO：17代(dai)表單克隆(long)抗(kang)體mAb 0294的鼠(shu)-人嵌合重鏈的氨(an)基酸序列。

SEQ ID NO：18代(dai)表Fab 0295的(de)(de)截(jie)短的(de)(de)鼠-人嵌合(he)重鏈的(de)(de)氨(an)基酸序列(lie)。

SEQ ID NO：19代表mAb 2021的重鏈可變域(yu)(VH)的氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：20代(dai)表mAb 2021的輕鏈可變域(VL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21代表Fab 0094的(de)重鏈(lian)(HC)的(de)氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：22代表Fab 0094的(de)輕鏈(LC)的(de)氨基酸序列。

SEQ ID NO：23代表Fab 0088的重鏈(HC)的氨基酸(suan)序列(lie)。

SEQ ID NO：24代表Fab 0088的輕(qing)鏈(LC)的氨基(ji)酸序列。

SEQ ID NO：25代(dai)表Fab 0313的(de)重鏈(HC)的(de)氨(an)基酸序列。

SEQ ID NO：26代(dai)表Fab 0313的輕鏈(LC)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27代(dai)表(biao)mAb 0310的重鏈(HC)的氨(an)基酸序列。

SEQ ID NO：28代表(biao)mAb 0310的(de)輕鏈(LC)的(de)氨基(ji)酸序列(lie)。

SEQ ID NO：29代表mAb 0336的(de)重鏈(HC)的(de)氨基酸序列。

詳述

在(zai)體(ti)內(nei)，組(zu)織因子(zi)途徑抑制劑(ji)(TFPI)存(cun)在(zai)于(yu)若干區(qu)室(shi)中(zhong)。TFPI中(zhong)的(de)大(da)部分與血(xue)管內(nei)皮(pi)相關(guan)聯，少部分在(zai)血(xue)液中(zhong)循(xun)環(huan)(huan)。已(yi)經描(miao)述了(le)人類中(zhong)的(de)兩種TFPI剪接變體(ti)：TFPIα和TFPIβ。TFPIβ可(ke)能(neng)是在(zai)內(nei)皮(pi)細胞表面上表達的(de)主要(yao)形式，而TFPIα的(de)胞內(nei)儲存(cun)可(ke)經某些刺(ci)激(ji)被釋放至循(xun)環(huan)(huan)中(zhong)。TFPIα作為全長或截短的(de)蛋(dan)白質在(zai)血(xue)液中(zhong)循(xun)環(huan)(huan)，與脂蛋(dan)白或血(xue)小板相關(guan)聯。

成熟人(ren)TFPIα是由酸(suan)(suan)(suan)性N-末(mo)端區(qu)域(yu)、由連接(jie)(jie)區(qu)穿插的(de)(de)(de)(de)三個(ge)串聯排列的(de)(de)(de)(de)Kunitz型抑(yi)制劑(ji)結構(gou)域(yu)(KPI-1、KPI-2和(he)KPI-3)和(he)堿性C-末(mo)端尾部組成的(de)(de)(de)(de)276個(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)蛋白質(SEQ ID NO：1)。KPI-1、KPI-2和(he)KPI-3結構(gou)域(yu)分(fen)別被定義(yi)為SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)26-76、殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)97-147和(he)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)189-239。成熟人(ren)TFPIβ是經由糖(tang)基(ji)(ji)(ji)(ji)磷脂(zhi)酰肌醇(chun)(GPI)-錨共價連接(jie)(jie)至內皮細(xi)胞表(biao)面的(de)(de)(de)(de)193個(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)蛋白質。TFPIβ的(de)(de)(de)(de)前(qian)161個(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)與(yu)TFPIα相同(tong)(對應(ying)于SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)1-161)，而C-末(mo)端序列的(de)(de)(de)(de)最(zui)后12個(ge)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)與(yu)TFPIα不相關，并且具有連接(jie)(jie)至殘(can)(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(ji)193的(de)(de)(de)(de)GPI-錨。

本發明涉及結(jie)合(he)TFPI的(de)(de)(de)(de)殘(can)基1-161內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)兩個不同和/或獨特表(biao)位(wei)(wei)(wei)的(de)(de)(de)(de)雙特異(yi)(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體。各自具(ju)有(you)獨特抗(kang)(kang)原(yuan)識別位(wei)(wei)(wei)點的(de)(de)(de)(de)兩個單特異(yi)(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體形成本發明雙特異(yi)(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)片(pian)段(duan)或“臂”的(de)(de)(de)(de)基礎。該雙特異(yi)(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)(de)第一抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)片(pian)段(duan)(或“臂”)針(zhen)(zhen)對SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)氨基酸(suan)殘(can)基1-96內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位(wei)(wei)(wei)；即(ji)，針(zhen)(zhen)對位(wei)(wei)(wei)于包含(han)N末端(duan)、KPI-1結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)殘(can)基26-76)以及KPI-1與KPI-2結(jie)構(gou)域(yu)(yu)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)連(lian)接(jie)區(qu)的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)(yu)內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位(wei)(wei)(wei)。所述表(biao)位(wei)(wei)(wei)優選位(wei)(wei)(wei)于包含(han)TFPI的(de)(de)(de)(de)氨基酸(suan)1-76的(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)(yu)內(nei)(nei)(nei)。該雙特異(yi)(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)(de)第二抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)片(pian)段(duan)(或“臂”)針(zhen)(zhen)對SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)氨基酸(suan)77-161內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位(wei)(wei)(wei)；即(ji)，包含(han)KPI-1與KPI-2結(jie)構(gou)域(yu)(yu)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)連(lian)接(jie)區(qu)、KPI-2結(jie)構(gou)域(yu)(yu)以及KPI-2與KPI-3結(jie)構(gou)域(yu)(yu)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)連(lian)接(jie)區(qu)的(de)(de)(de)(de)TFPI區(qu)域(yu)(yu)。所述表(biao)位(wei)(wei)(wei)優選位(wei)(wei)(wei)于TFPI的(de)(de)(de)(de)KPI-2結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)(de)殘(can)基97-147)內(nei)(nei)(nei)。

能夠(gou)在(zai)SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)氨基(ji)酸77-161內，如在(zai)KPI-2結構(gou)域(yu)(yu)內結合(he)的(de)(de)(de)雙特異性(xing)抗(kang)體的(de)(de)(de)單臂本身(shen)可如同單特異性(xing)抗(kang)體一樣，不能顯著阻止TFPI的(de)(de)(de)抑(yi)制活性(xing)。然而(er)，當該(gai)雙特異性(xing)抗(kang)體的(de)(de)(de)另一臂與包含TFPI的(de)(de)(de)氨基(ji)酸1-76的(de)(de)(de)區域(yu)(yu)如TFPI的(de)(de)(de)KPI-1結構(gou)域(yu)(yu)結合(he)時，所述單臂可更顯著地促進TFPI抑(yi)制的(de)(de)(de)特異性(xing)阻斷，反之亦然。

優選(xuan)地，如本文(wen)所公開的(de)(de)雙特異性KPI-1/KPI-2結(jie)合(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)主要結(jie)合(he)模(mo)式(shi)是分(fen)子(zi)內的(de)(de)，即其(qi)中(zhong)該雙特異性KPI-1/KPI-2結(jie)合(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)兩個臂(bei)與(yu)單個TFPI分(fen)子(zi)結(jie)合(he)；而不(bu)(bu)(bu)是分(fen)子(zi)間的(de)(de)，即其(qi)中(zhong)該雙特異性KPI-1/KPI-2結(jie)合(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)兩個臂(bei)與(yu)不(bu)(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)TFPI分(fen)子(zi)結(jie)合(he)。分(fen)子(zi)內結(jie)合(he)形成(cheng)1∶1TFPI抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)復(fu)合(he)物，而分(fen)子(zi)間結(jie)合(he)模(mo)式(shi)可(ke)導致不(bu)(bu)(bu)希望的(de)(de)TFPI和雙特異性抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)較(jiao)大裝配體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)形成(cheng)。可(ke)通過降低其(qi)中(zhong)一個抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)臂(bei)如KPI-1結(jie)合(he)臂(bei)的(de)(de)親和力來刺激分(fen)子(zi)內結(jie)合(he)模(mo)式(shi)。

當比較(jiao)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)雙(shuang)特(te)異(yi)性抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)促凝血作(zuo)用與(yu)衍生出該(gai)(gai)抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)單特(te)異(yi)性抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)預期(qi)累加作(zuo)用時，前(qian)者可(ke)具(ju)有優異(yi)的(de)(de)(de)(de)表現。例如(ru)，即使(shi)當TFPI的(de)(de)(de)(de)濃度(du)相對于(yu)例如(ru)正(zheng)常生理水平升高時，該(gai)(gai)雙(shuang)特(te)異(yi)性抗(kang)體也可(ke)具(ju)有阻斷TFPI所(suo)有抑制功能(neng)的(de)(de)(de)(de)能(neng)力。為(wei)了獲得(de)雙(shuang)特(te)異(yi)性抗(kang)體如(ru)Fab-Fab綴合物(wu)(本(ben)(ben)文(wen)也稱為(wei)BiFab)，針對本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)兩(liang)個不(bu)同(tong)表位的(de)(de)(de)(de)兩(liang)個抗(kang)原結合片段的(de)(de)(de)(de)連接，由于(yu)親合力效應，可(ke)導致比通(tong)過(guo)這(zhe)兩(liang)個不(bu)同(tong)抗(kang)原結合部分的(de)(de)(de)(de)組合效應所(suo)獲得(de)的(de)(de)(de)(de)更強的(de)(de)(de)(de)TFPI活性中和(he)。

本(ben)發明(ming)的雙特異(yi)性(xing)(xing)抗體可具(ju)有調節所有TFPI集合的活性(xing)(xing)的能力。

如(ru)本(ben)文中所(suo)使用(yong)(yong)的(de)(de)術語(yu)“TFPI”包括(kuo)可(ke)(ke)來源(yuan)于(yu)任(ren)何合適生物(wu)體的(de)(de)天(tian)然(ran)存在(zai)形式的(de)(de)組織因子(zi)途(tu)徑抑(yi)制劑(TFPI)。例如(ru)，如(ru)本(ben)文所(suo)述使用(yong)(yong)的(de)(de)TFPI可(ke)(ke)以是(shi)(shi)哺(bu)乳動(dong)物(wu)TFPI，如(ru)人、小鼠、大(da)鼠、靈(ling)長(chang)類、牛(niu)、羊、兔或(huo)(huo)豬TFPI。優選地(di)，該(gai)TFPI是(shi)(shi)人TFPI。該(gai)TFPI可(ke)(ke)以是(shi)(shi)成(cheng)熟(shu)形式的(de)(de)TFPI，如(ru)在(zai)合適的(de)(de)細胞(bao)內經歷翻譯后加工的(de)(de)TFPI蛋白(bai)質(zhi)。這樣的(de)(de)成(cheng)熟(shu)TFPI蛋白(bai)質(zhi)例如(ru)可(ke)(ke)被糖(tang)基化。該(gai)TFPI可(ke)(ke)以是(shi)(shi)全長(chang)TFPI蛋白(bai)質(zhi)。術語(yu)TFPI還(huan)包括(kuo)這樣的(de)(de)TFPI分子(zi)的(de)(de)變(bian)體、同(tong)種(zhong)型和(he)其(qi)它同(tong)源(yuan)物(wu)。TFPI活性(xing)是(shi)(shi)指(zhi)其(qi)抑(yi)制活性(xing)。變(bian)異TFPI分子(zi)的(de)(de)特征通常在(zai)于(yu)具有與天(tian)然(ran)存在(zai)的(de)(de)TFPI相同(tong)類型的(de)(de)活性(xing)，如(ru)中和(he)FXa的(de)(de)催化活性(xing)的(de)(de)能(neng)力或(huo)(huo)抑(yi)制TF-FVIIa/FXa復合物(wu)的(de)(de)能(neng)力。

本文中的(de)(de)術語“抗(kang)體(ti)”是(shi)指自免疫球蛋(dan)白(bai)序(xu)列衍生的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，其(qi)能夠與抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)或其(qi)一(yi)(yi)部(bu)分(fen)特(te)異性結(jie)(jie)(jie)合。術語抗(kang)體(ti)包括(kuo)但(dan)不限(xian)于任何類別(bie)(或同種(zhong)型)的(de)(de)全長抗(kang)體(ti)，即(ji)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和/或IgY。該術語也可包括(kuo)全長抗(kang)體(ti)的(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)或多個(ge)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)結(jie)(jie)(jie)合片段。與抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)或其(qi)一(yi)(yi)部(bu)分(fen)特(te)異性結(jie)(jie)(jie)合的(de)(de)抗(kang)體(ti)可僅(jin)與該抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)或其(qi)一(yi)(yi)部(bu)分(fen)結(jie)(jie)(jie)合，或者其(qi)可以與有(you)限(xian)數(shu)目(mu)的(de)(de)同源(yuan)性抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)或其(qi)部(bu)分(fen)結(jie)(jie)(jie)合。

天然的全長抗體通常包含至少四條多肽鏈：通過二硫鍵連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。在一些情況下，天然抗體包含少于四條鏈，如在駱駝科動物中發現的僅含重鏈的抗體(V_HH片段)和(he)(he)在軟骨魚類(lei)(lei)(Chondrichthyes)中發現的(de)IgNAR的(de)情況。藥學上特別(bie)感興趣(qu)的(de)一(yi)類(lei)(lei)免疫球蛋白(bai)是IgG。在人(ren)類(lei)(lei)中，根據(ju)其(qi)重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)恒定(ding)(ding)區(qu)(qu)(qu)的(de)序(xu)列(lie)，IgG類(lei)(lei)別(bie)可被(bei)(bei)(bei)細分為(wei)(wei)四個亞類(lei)(lei)：IgG1、IgG2、IgG3和(he)(he)IgG4。根據(ju)其(qi)序(xu)列(lie)組成(cheng)(cheng)的(de)差異，輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)可被(bei)(bei)(bei)分為(wei)(wei)兩(liang)(liang)種類(lei)(lei)型：κ和(he)(he)λ鏈(lian)(lian)(lian)(lian)。IgG分子由(you)兩(liang)(liang)條通過兩(liang)(liang)個或更多個二硫鍵(jian)相互(hu)連(lian)接(jie)的(de)重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)和(he)(he)兩(liang)(liang)條各(ge)自(zi)通過二硫鍵(jian)連(lian)接(jie)至重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)的(de)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)組成(cheng)(cheng)。IgG重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)可包(bao)含一(yi)個重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)可變(bian)(bian)區(qu)(qu)(qu)(VH)和(he)(he)最(zui)多三個重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)恒定(ding)(ding)(CH)區(qu)(qu)(qu)：CH1、CH2和(he)(he)CH3。輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)可包(bao)含輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)可變(bian)(bian)區(qu)(qu)(qu)(VL)和(he)(he)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)恒定(ding)(ding)區(qu)(qu)(qu)(CL)。VH和(he)(he)VL區(qu)(qu)(qu)可進(jin)一(yi)步細分為(wei)(wei)被(bei)(bei)(bei)稱(cheng)為(wei)(wei)互(hu)補決定(ding)(ding)區(qu)(qu)(qu)(CDR)或高變(bian)(bian)區(qu)(qu)(qu)(HvR)的(de)高變(bian)(bian)性區(qu)(qu)(qu)域，其(qi)中散(san)布有(you)被(bei)(bei)(bei)稱(cheng)為(wei)(wei)框架區(qu)(qu)(qu)(FR)的(de)更加(jia)保守的(de)區(qu)(qu)(qu)域。VH和(he)(he)VL區(qu)(qu)(qu)通常由(you)三個CDR和(he)(he)四個FR組成(cheng)(cheng)，它們(men)從氨基(ji)末端到(dao)羧基(ji)末端以如下(xia)順序(xu)排列(lie)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重(zhong)(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)和(he)(he)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)的(de)具有(you)高變(bian)(bian)區(qu)(qu)(qu)的(de)可變(bian)(bian)域構成(cheng)(cheng)能夠(gou)與抗原相互(hu)作用的(de)結構域，而抗體的(de)恒定(ding)(ding)區(qu)(qu)(qu)可以介導免疫球蛋白(bai)與宿主(zhu)組織(zhi)或因(yin)子的(de)結合(he)，該宿主(zhu)組織(zhi)或因(yin)子包(bao)括但不限于(yu)免疫系(xi)(xi)統的(de)各(ge)種細胞(效應細胞)、Fc受(shou)體和(he)(he)經典補體系(xi)(xi)統的(de)C1復(fu)合(he)物的(de)第(di)一(yi)組分(C1q)。

如本文(wen)所使用的(de)，術語“單特異(yi)性抗體”是指具有單一(yi)抗原識別位點(即，為單價)或各自對一(yi)個(ge)共同靶(ba)抗原具有特異(yi)性的(de)兩個(ge)相同抗原識別位點(即，為二價)的(de)抗體。

本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)(de)單(dan)特異性抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)可(ke)以(yi)(yi)是單(dan)克隆抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，從(cong)這種(zhong)(zhong)意(yi)義上(shang)講，它們代表由(you)單(dan)個B細(xi)胞或(huo)由(you)B細(xi)胞的(de)(de)(de)克隆群表達(da)(da)的(de)(de)(de)一(yi)組獨特的(de)(de)(de)重鏈和(he)(he)輕鏈可(ke)變域(yu)序列(lie)。本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)可(ke)采用(yong)本(ben)領域(yu)技(ji)術人員(yuan)已知的(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)方法來(lai)生(sheng)(sheng)產和(he)(he)純化。例如，抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)可(ke)由(you)雜交瘤細(xi)胞產生(sheng)(sheng)。抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)可(ke)通(tong)過(guo)B細(xi)胞擴增來(lai)產生(sheng)(sheng)。抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)或(huo)其(qi)(qi)片段可(ke)以(yi)(yi)在哺乳動物(wu)或(huo)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)表達(da)(da)系統(tong)中或(huo)通(tong)過(guo)體(ti)(ti)(ti)外翻譯重組表達(da)(da)。抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)或(huo)其(qi)(qi)片段還(huan)可(ke)通(tong)過(guo)例如噬菌體(ti)(ti)(ti)展示(shi)、細(xi)菌展示(shi)、酵母展示(shi)、哺乳動物(wu)細(xi)胞展示(shi)或(huo)核糖(tang)體(ti)(ti)(ti)或(huo)mRNA展示(shi)重組表達(da)(da)為細(xi)胞表面結合分子(zi)。一(yi)旦產生(sheng)(sheng)，可(ke)以(yi)(yi)針對其(qi)(qi)結合TFPI(1-161)、全長(chang)TFPIα和(he)(he)TFPIβ，如人TFPI(1-161)、全長(chang)人TFPIα和(he)(he)人TFPIβ的(de)(de)(de)能力篩選抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)。

抗體的抗原結合片段也可以是根據本發明的單特異性抗體，因為已經證明，抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來行使。術語抗體的“抗原結合片段”是指一個或多個保留特異性結合或識別抗原的能力的抗體片段，該抗原例如是TFPIα如人TFPIα(SEQ ID NO：1)，如人TFPI(1-161)(SEQ ID NO：2)，如人TFPI KPI-2構建體(SEQ ID NO：3)，或另一種靶分子，如本文所述。抗原結合片段的例子包括Fab、Fab′、Fab₂、Fab′₂、FabS、Fv(一般為(wei)抗(kang)(kang)體(ti)單臂(bei)的(de)VL和(he)(he)(he)(he)VH域(yu)(yu)(yu))、單鏈Fv(scFv；參見(jian)例(li)如Bird等人(ren)，Science(1988)242：42S-426；和(he)(he)(he)(he)Huston等人(ren)PNAS (1988)85：5879-5883)、dsFv、Fd(一般為(wei)VH和(he)(he)(he)(he)CH1域(yu)(yu)(yu))和(he)(he)(he)(he)dAb(一般為(wei)VH域(yu)(yu)(yu))片段(duan)；VH、VL、VhH和(he)(he)(he)(he)V-NAR域(yu)(yu)(yu)；包含單條(tiao)VH和(he)(he)(he)(he)單條(tiao)VL鏈的(de)單價分(fen)子；微體(ti)(minibodies)、雙(shuang)抗(kang)(kang)體(ti)(diabodies)、三抗(kang)(kang)體(ti)(triabodies)、四抗(kang)(kang)體(ti)(tetrabodies)和(he)(he)(he)(he)κ體(ti)(kappa bodies)(參見(jian)例(li)如Ill等人(ren)Protein Eng(1997)10：949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以(yi)及一個或多個分(fen)離(li)的(de)CDR或功能互補(bu)位，其中分(fen)離(li)的(de)CDR或抗(kang)(kang)原結合(he)殘(can)基或多肽可(ke)以(yi)締合(he)或連(lian)接在(zai)一起，從而形成功能抗(kang)(kang)體(ti)片段(duan)。各種類型的(de)抗(kang)(kang)體(ti)片段(duan)已(yi)在(zai)例(li)如Holliger和(he)(he)(he)(he)Hudson，Nat Biotechnol(2005)23：1126-1136、WO2005040219以(yi)及公(gong)開的(de)美國專(zhuan)利申請20050238646和(he)(he)(he)(he)20020161201中描述或綜(zong)述。這些抗(kang)(kang)體(ti)片段(duan)可(ke)采(cai)用(yong)本領域(yu)(yu)(yu)技(ji)術人(ren)員已(yi)知的(de)常(chang)規技(ji)術獲得，并且可(ke)以(yi)以(yi)與完整抗(kang)(kang)體(ti)相同(tong)的(de)方(fang)式針對應用(yong)性篩選這些片段(duan)。

抗體的“Fab片段”，包括“Fab”、“Fab”’和“Fab’₂”片段，可通過在連接抗體重鏈的鉸鏈半胱氨酸殘基的N-末端或C-末端側上的鉸鏈區中切割重鏈而由所述抗體得到。“Fab”片段包括輕鏈的可變域和恒定域以及重鏈的可變域和第一個恒定域(CH1)。“Fab′₂”片段包含一對通常通過其鉸鏈半胱氨酸共價連接的“Fab”’片段。Fab′通過切割Fab′₂中連接重鏈的鉸鏈二硫鍵而在形式上衍生自Fab′₂片段。除了抗體片段的二硫鍵連接以外的其它化學偶聯也是本領域已知的。Fab片段保留了親本抗體與其抗原結合的能力，潛在地具有更低的親和力。Fab′₂片段能夠二價結合，而Fab和Fab’片段可以單價結合。通常，Fab片段缺乏恒定CH2和CH3域，即在其中將發生與Fc受體的相互作用的Fc部分。因此，Fab片段通常缺乏效應子功能。Fab片段可以通過本領域已知的方法通過抗體的酶切而產生，例如使用木瓜蛋白酶以獲得Fab或使用胃蛋白酶以獲得Fab′₂，包括Fab、Fab′、Fab′₂在內(nei)的(de)Fab片段(duan)可(ke)以使用(yong)本領(ling)域技術人員公知的(de)技術重組產(chan)生(sheng)。

“Fv”片(pian)段(duan)是(shi)含有完(wan)全抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)識別(bie)和結(jie)(jie)合(he)(he)位點(dian)的(de)抗(kang)(kang)體(ti)片(pian)段(duan)，且一(yi)般包含締合(he)(he)(其在(zai)(zai)性質上可(ke)以(yi)(yi)是(shi)共價(jia)的(de))的(de)一(yi)個(ge)(ge)重(zhong)鏈可(ke)變(bian)域和一(yi)個(ge)(ge)輕鏈可(ke)變(bian)域的(de)二聚體(ti)，例(li)如在(zai)(zai)單(dan)鏈可(ke)變(bian)域片(pian)段(duan)(scFv)中。以(yi)(yi)這(zhe)種構型，每個(ge)(ge)可(ke)變(bian)域的(de)三(san)個(ge)(ge)高(gao)變(bian)區(qu)相互(hu)作用，以(yi)(yi)在(zai)(zai)VH-VL二聚體(ti)表面(mian)上限(xian)定抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)結(jie)(jie)合(he)(he)位點(dian)。六個(ge)(ge)高(gao)變(bian)區(qu)或其亞組共同地對抗(kang)(kang)體(ti)賦予(yu)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)結(jie)(jie)合(he)(he)特(te)異性。然(ran)而，即使僅包含三(san)個(ge)(ge)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)異性高(gao)變(bian)區(qu)的(de)單(dan)個(ge)(ge)可(ke)變(bian)域也可(ke)保留識別(bie)并結(jie)(jie)合(he)(he)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)能力，盡管其親和力通常(chang)低于完(wan)整(zheng)的(de)結(jie)(jie)合(he)(he)位點(dian)(Cai和Garen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：6280-6285)。例(li)如，僅具有重(zhong)鏈可(ke)變(bian)域(VHH)的(de)天(tian)然(ran)存在(zai)(zai)的(de)駱駝(tuo)科(ke)抗(kang)(kang)體(ti)可(ke)以(yi)(yi)結(jie)(jie)合(he)(he)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(Desmyter等(deng)(deng)人(ren)，J.Biol.Chem.，(2002)277：23645-23650；Bond等(deng)(deng)人(ren)，J.Mol.Biol.(2003)332：643-655)。

“單(dan)鏈(lian)Fv”或“scFv”抗體片段包含(han)抗體的(de)VH和VL域(yu)，其中這些結構域(yu)存(cun)在(zai)于(yu)單(dan)條多(duo)(duo)肽(tai)(tai)鏈(lian)中。通常，Fv多(duo)(duo)肽(tai)(tai)進一步在(zai)VH和VL域(yu)之間包含(han)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)接頭，該接頭使得scFv能夠形成用(yong)于(yu)抗原結合的(de)所需(xu)結構。關(guan)于(yu)scFv的(de)綜述，參(can)見Pluckthun，1994，In：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，Vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315。

術語(yu)“雙(shuang)抗(kang)體(ti)(diabodies)”是(shi)指(zhi)具有(you)兩(liang)個抗(kang)原結(jie)合位(wei)(wei)點的小抗(kang)體(ti)片段，其中(zhong)片段包含同一多肽鏈(lian)(VH和VL)中(zhong)連接(jie)至輕鏈(lian)可(ke)變(bian)(bian)(bian)(bian)域(yu)(VL)的重鏈(lian)可(ke)變(bian)(bian)(bian)(bian)域(yu)(VH)。通(tong)過(guo)使用由(you)于過(guo)短(duan)而(er)無法(fa)允(yun)許在(zai)(zai)同一條(tiao)鏈(lian)上(shang)的兩(liang)個可(ke)變(bian)(bian)(bian)(bian)域(yu)之(zhi)間配對的接(jie)頭，使得這些可(ke)變(bian)(bian)(bian)(bian)域(yu)與(yu)另一條(tiao)鏈(lian)的互補結(jie)構域(yu)配對，從而(er)產生兩(liang)個抗(kang)原結(jie)合位(wei)(wei)點。雙(shuang)抗(kang)體(ti)在(zai)(zai)例(li)如EP 404,097、WO 93/11161以(yi)及(ji)Hollinger等人(ren)，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448中(zhong)更全(quan)面地描述。

表述(shu)“線(xian)性抗體”是指(zhi)如(ru)在Zapata等人，1995，Protein Eng.8(10)：1057-1062中描述(shu)的(de)抗體。簡言之，這些抗體含有一對串聯的(de)Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，該區段與互補的(de)輕鏈多肽一起形成一對抗原結合(he)區。線(xian)性抗體可(ke)以是雙特異(yi)性的(de)或單(dan)特異(yi)性的(de)。

可采用常規(gui)的(de)重組或(huo)蛋白質工程技(ji)術獲得抗體(ti)片段，并且可以(yi)以(yi)與完整抗體(ti)相同(tong)的(de)方式，如本文所述(shu)，針對(dui)與TFPI(1-161)、全長TFPIα和(he)TFPIβ或(huo)TFPI另一部分(fen)的(de)結(jie)合(he)篩選這些片段。

本發(fa)明的抗體片段(duan)可通過截短(duan)，例(li)如通過從多肽的N-末端(duan)和(he)/或(huo)C-末端(duan)去除一個或(huo)多個氨基酸來(lai)制備。也(ye)可以通過一個或(huo)多個內部(bu)缺失來(lai)生(sheng)成片段(duan)。

本文中的(de)(de)術語“雙(shuang)特(te)(te)異性(xing)(xing)抗(kang)(kang)(kang)體”是指具(ju)有兩個(ge)(ge)不(bu)(bu)同(tong)(tong)和/或(huo)(huo)獨(du)特(te)(te)的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)識別位(wei)(wei)點的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體，這使(shi)抗(kang)(kang)(kang)體能(neng)夠結合(he)兩種不(bu)(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)同(tong)(tong)一(yi)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)上(shang)的(de)(de)兩個(ge)(ge)不(bu)(bu)同(tong)(tong)表位(wei)(wei)。術語“多(duo)(duo)特(te)(te)異性(xing)(xing)抗(kang)(kang)(kang)體”是指具(ju)有結合(he)兩種或(huo)(huo)更多(duo)(duo)種不(bu)(bu)同(tong)(tong)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)者同(tong)(tong)一(yi)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)上(shang)兩個(ge)(ge)或(huo)(huo)更多(duo)(duo)個(ge)(ge)不(bu)(bu)同(tong)(tong)表位(wei)(wei)的(de)(de)能(neng)力的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體。因此(ci)，多(duo)(duo)特(te)(te)異性(xing)(xing)抗(kang)(kang)(kang)體包括雙(shuang)特(te)(te)異性(xing)(xing)抗(kang)(kang)(kang)體。

本發(fa)明的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)IgG形式(shi)的(de)(de)(de)(de)全長(chang)雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)。可(ke)(ke)通(tong)(tong)過融(rong)合兩(liang)個(ge)(ge)單獨(du)的(de)(de)(de)(de)雜(za)(za)交(jiao)瘤(liu)以(yi)形成產(chan)生包括雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)抗(kang)體(ti)(ti)一(yi)部分的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)混合物的(de)(de)(de)(de)雜(za)(za)交(jiao)四(si)源雜(za)(za)交(jiao)瘤(liu)(quadroma)，來(lai)產(chan)生模擬天(tian)然抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)全長(chang)IgG形式(shi)的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)(Chelius D.等人(ren)；MAbs.2010年5-6月；2(3)：309-319)。或者，可(ke)(ke)通(tong)(tong)過使用(yong)重組技術產(chan)生雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)抗(kang)體(ti)(ti)。也可(ke)(ke)通(tong)(tong)過工(gong)(gong)程改造(zao)Fc區的(de)(de)(de)(de)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)界面以(yi)促進(jin)(jin)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)來(lai)實現異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)。其中(zhong)一(yi)個(ge)(ge)實例(li)是(shi)所謂的(de)(de)(de)(de)杵臼(knob-in-hole)突(tu)變(bian)，其中(zhong)將(jiang)空(kong)間(jian)(jian)上大的(de)(de)(de)(de)側(ce)鏈(lian)(lian)(杵)引入一(yi)個(ge)(ge)Fc中(zhong)，該Fc與相(xiang)(xiang)對(dui)Fc上空(kong)間(jian)(jian)上小的(de)(de)(de)(de)側(ce)鏈(lian)(lian)(臼)相(xiang)(xiang)匹配，從而(er)創建促進(jin)(jin)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)空(kong)間(jian)(jian)互補(bu)。用(yong)于工(gong)(gong)程改造(zao)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)Fc界面的(de)(de)(de)(de)其它(ta)方(fang)法是(shi)靜電互補(bu)，與非IgG異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)結構域融(rong)合，或利(li)用(yong)人(ren)IgG4的(de)(de)(de)(de)天(tian)然Fab-臂交(jiao)換(huan)現象來(lai)控制異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)。異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)實例(li)在文獻中(zhong)詳細描述，例(li)如(ru)，(Klein C等人(ren)；MAbs.2012年11-12月；4(6)：653-663)。必須特(te)(te)別(bie)注意異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)體(ti)(ti)抗(kang)體(ti)(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)輕鏈(lian)(lian)。可(ke)(ke)通(tong)(tong)過使用(yong)共同的(de)(de)(de)(de)輕鏈(lian)(lian)來(lai)實現LC與HC的(de)(de)(de)(de)正確配對(dui)。此外(wai)，LC/HC界面的(de)(de)(de)(de)工(gong)(gong)程化(hua)(hua)可(ke)(ke)用(yong)來(lai)促進(jin)(jin)異(yi)二(er)(er)(er)(er)聚(ju)(ju)化(hua)(hua)或如(ru)CrossMab中(zhong)的(de)(de)(de)(de)輕鏈(lian)(lian)交(jiao)叉工(gong)(gong)程化(hua)(hua)。來(lai)自含有適(shi)當突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)(ge)單獨(du)IgG的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)在溫和還(huan)原(yuan)條件下的(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)重裝配還(huan)可(ke)(ke)用(yong)來(lai)產(chan)生雙(shuang)特(te)(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)(例(li)如(ru)，Labrijn等人(ren)，PNAS，110，5145-5150(2013))。還(huan)報道了天(tian)然Fab-臂交(jiao)換(huan)方(fang)法以(yi)確保正確的(de)(de)(de)(de)輕鏈(lian)(lian)配對(dui)。

還可(ke)將(jiang)基于(yu)多(duo)特(te)異性(xing)抗(kang)體(ti)的(de)分子重組表達為組合(he)了IgG的(de)天然模塊(kuai)的(de)融(rong)合(he)蛋白，以(yi)形成如文獻中所(suo)述的(de)多(duo)特(te)異性(xing)和(he)多(duo)價抗(kang)體(ti)衍生物。融(rong)合(he)抗(kang)體(ti)的(de)實例是(shi)DVD-Ig、IgG-scFV、雙(shuang)抗(kang)體(ti)、DART等(Kontermann，MAbs.2012年3-4月4(2)：182-197)。可(ke)將(jiang)特(te)異性(xing)檢測(ce)或純化標簽、半衰期(qi)延長部分或其(qi)它組分并入(ru)融(rong)合(he)蛋白中。也可(ke)將(jiang)其(qi)它非IgG模塊(kuai)并入(ru)融(rong)合(he)蛋白中。不論(lun)LC配(pei)對方法如何，通常都將(jiang)基于(yu)FC異二(er)聚化的(de)雙(shuang)特(te)異性(xing)全長抗(kang)體(ti)稱為不對稱IgG。

還可通過化學綴合或偶聯各個全長IgG或偶聯IgG的片段來產生基于多特異性抗體的分子，以形成如文獻中所述的多特異性和多價抗體衍生物。融合抗體的實例是化學偶聯的Fab’₂、IgG二聚體(ti)等(Kontermann，MAbs.2012年(nian)3-4月4(2)：182-197)。可(ke)將(jiang)特異性(xing)檢測或純化標簽(qian)、半(ban)衰期延長分(fen)子(zi)或其它組分(fen)并(bing)入綴(zhui)合蛋白中(zhong)。還可(ke)將(jiang)其它非IgG多(duo)肽并(bing)入融合蛋白中(zhong)。在實(shi)施例中(zhong)提供了這(zhe)類雙特異性(xing)抗體(ti)的(de)實(shi)例。

還可(ke)通過組合(he)包括上(shang)述方(fang)法在內的重組和化學方(fang)法來產生多(duo)特異性分子。

本(ben)發明的(de)雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)(ti)可(ke)以是(shi)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)抗(kang)原結(jie)(jie)合(he)片(pian)(pian)段(duan)的(de)化(hua)學(xue)綴(zhui)(zhui)合(he)物，如兩(liang)(liang)個(ge)(ge)Fab片(pian)(pian)段(duan)(BiFab)或兩(liang)(liang)個(ge)(ge)scFv片(pian)(pian)段(duan)的(de)綴(zhui)(zhui)合(he)物。可(ke)通(tong)過本(ben)領域技(ji)術人員(yuan)已知的(de)方(fang)法來產生(sheng)結(jie)(jie)合(he)TFPI上(shang)的(de)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)獨(du)特表位(wei)的(de)雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)(ti)或兩(liang)(liang)種(zhong)單(dan)特異(yi)性抗(kang)體(ti)(ti)。例如，可(ke)通(tong)過兩(liang)(liang)個(ge)(ge)抗(kang)體(ti)(ti)片(pian)(pian)段(duan)，如兩(liang)(liang)個(ge)(ge)Fab或scFv片(pian)(pian)段(duan)的(de)直接化(hua)學(xue)綴(zhui)(zhui)合(he)或經由(you)為正常功能提供所需柔性的(de)接頭的(de)化(hua)學(xue)綴(zhui)(zhui)合(he)來制備雙特異(yi)性形式(shi)。一種(zhong)用于偶聯Fab片(pian)(pian)段(duan)的(de)具體(ti)(ti)方(fang)法是(shi)使用置于Fab片(pian)(pian)段(duan)適當(dang)位(wei)置的(de)半胱氨酸殘基中的(de)巰(qiu)基官(guan)能團(tuan)。

可通過兩個抗(kang)體或其(qi)片段(duan)(與TFPI的不同(tong)表(biao)位結合)的化學綴合來(lai)獲得本發明的雙特(te)異性(xing)或雙功能(neng)性(xing)抗(kang)體，如J Immunol 1987；139：2367-2375或J Immunol 2001；166：1320-1326中(zhong)所(suo)述，或如下所(suo)述：

mAb1(或片段)-mAb2(或片段)

mAb1(或片(pian)段)-接頭-mAb2(或片(pian)段)

連(lian)接(jie)可以是(shi)單個共價(jia)鍵(jian)(直接(jie)連(lian)接(jie))或包含二價(jia)基(ji)(ji)團，該二價(jia)基(ji)(ji)團通常描述為：

其中X至少是但不限(xian)于一個(ge)選自(zi)碳(tan)、氧、硫、磷(lin)和氮的(de)原子。*表示(shi)該二(er)價基(ji)團(tuan)的(de)連接位(wei)置。術語“二(er)價基(ji)團(tuan)”是指具有兩個(ge)彼此獨立起作用的(de)自(zi)由(you)基(ji)中心的(de)偶電子化學化合(he)物。

在一個實施(shi)方案中，接頭是由不多于40個原(yuan)子組成的鏈(lian)。

在一個實施方案中，在接頭中使用的化(hua)學部分(fen)包括(kuo)具有以下(xia)結構的二價(jia)基團：

在一個實(shi)施方案中，接頭部(bu)分包含具有對稱結構的二價基團(同(tong)型雙功能化接頭)。

接(jie)頭還可以是具有(you)與以上(shang)描(miao)述(shu)類似的結構的聚合(he)物。

在一個實施方案中(zhong)，在接頭中(zhong)使用的化(hua)學部分包(bao)括(kuo)聚合物(wu)：由通過共價化(hua)學鍵連接的兩個或(huo)更多個重復結構(gou)單元組成(cheng)的大分子。這樣(yang)的聚合物(wu)可以是親水的。

術(shu)語親水(shui)的(de)或“水(shui)溶(rong)(rong)性的(de)”是指在水(shui)中(zhong)具(ju)有某(mou)種可檢測(ce)程度的(de)溶(rong)(rong)解(jie)度的(de)部(bu)分。檢測(ce)和/或定量水(shui)溶(rong)(rong)解(jie)度的(de)方法是本(ben)領域公知的(de)。

根據本發明的示(shi)例(li)(li)性(xing)水溶性(xing)聚(ju)(ju)(ju)(ju)合物(wu)包括肽、糖、(聚(ju)(ju)(ju)(ju))醚、(聚(ju)(ju)(ju)(ju))胺(an)(an)、(聚(ju)(ju)(ju)(ju))羧酸(suan)(suan)等。肽可具有混合序列或可由單種氨基酸(suan)(suan)組成，例(li)(li)如(聚(ju)(ju)(ju)(ju))賴氨酸(suan)(suan)。一種示(shi)例(li)(li)性(xing)多糖是(聚(ju)(ju)(ju)(ju))唾液酸(suan)(suan)。一種示(shi)例(li)(li)性(xing)(聚(ju)(ju)(ju)(ju))醚是(聚(ju)(ju)(ju)(ju))乙二醇。(聚(ju)(ju)(ju)(ju))乙烯亞胺(an)(an)是一種示(shi)例(li)(li)性(xing)聚(ju)(ju)(ju)(ju)胺(an)(an)，而(聚(ju)(ju)(ju)(ju))丙烯酸(suan)(suan)是一種典型的(聚(ju)(ju)(ju)(ju))羧酸(suan)(suan)。

許多其它聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)物也(ye)適用(yong)于(yu)本發(fa)明。水(shui)溶(rong)性(xing)的聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)物主鏈在本發(fa)明中特(te)別有用(yong)。合(he)適的聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)物的實例包括但(dan)不限于(yu)，其它聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(亞烷(wan)基(ji)二(er)(er)醇(chun))如聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(丙(bing)二(er)(er)醇(chun))(“PPG”)、乙二(er)(er)醇(chun)和丙(bing)二(er)(er)醇(chun)的共聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)物等，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(氧乙基(ji)化(hua)多元(yuan)醇(chun))，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(乙烯(xi)吡(bi)咯(ge)烷(wan)酮)，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(羥丙(bing)基(ji)甲(jia)基(ji)丙(bing)烯(xi)酰胺)，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(α-羥酸)，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(乙烯(xi)醇(chun))，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)膦腈(jing)，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)噁唑啉，聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)(N-烯(xi)丙(bing)酰嗎啉)，如第5,629,384號美國(guo)專(zhuan)利中所(suo)述，其整體通過引用(yong)并入本文(wen)，以及它們的共聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)物、三元(yuan)共聚(ju)(ju)(ju)(ju)(ju)物及混合(he)物。

聚合接(jie)頭優(you)選是線性的。

盡管每一(yi)單獨(du)聚合物(wu)鏈(lian)的(de)(de)分(fen)子(zi)(zi)量(liang)可以(yi)變化，但(dan)聚合物(wu)的(de)(de)平均分(fen)子(zi)(zi)量(liang)通常在約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)1000Da(1kDa)至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)40,000Da(40kDa)的(de)(de)范圍(wei)內(nei)，諸如約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)1000Da至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)12,000Da，如約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)2,000Da至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)11,000Da，如約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)2000Da至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)3,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)3000Da至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)4,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)4000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)5,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)5000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)6,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)6,000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)7,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)7,000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)8,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)8,000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)9,000Da；約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)9,000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)10,000Da；或(huo)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)10,000至(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)(yue)11,000Da。應當(dang)理解，這些大小表(biao)示估計值而非精確測量(liang)值。根據優選的(de)(de)實施方案，本發明的(de)(de)分(fen)子(zi)(zi)與親水性聚合物(wu)的(de)(de)異質群體綴合。

在(zai)一個具體(ti)實(shi)施方案(an)中(zhong)，在(zai)接頭(tou)中(zhong)使用的化學部分包括聚乙(yi)二醇(PEG)。

本文中(zhong)的(de)術語“PEG”是指包(bao)含以下結構的(de)二價基團(tuan)：

其中n’是大于(yu)1的整數。

PEG通過環氧乙(yi)烷的(de)聚合反應來制(zhi)備，并(bing)且可在大范圍的(de)分子量下商購獲得(de)。根據本發(fa)明使用(yong)的(de)PEG優選是(shi)線性的(de)。

此外，“PEG”可指具(ju)(ju)有(you)或(huo)不(bu)具(ju)(ju)有(you)偶聯劑、偶聯或(huo)活化(hua)(hua)(hua)部(bu)分(fen)(例如，具(ju)(ju)有(you)羧(suo)酸(suan)/活性(xing)酯(zhi)(zhi)(zhi)、酮(tong)基(ji)(ji)、烷(wan)氧(yang)基(ji)(ji)胺(an)、硫醇、三氟(fu)甲磺酸(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、三氟(fu)乙(yi)基(ji)(ji)磺酸(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)(tresylate)、吖(a)丙啶(ding)(ding)、環氧(yang)乙(yi)烷(wan)、炔(gui)、疊(die)氮(dan)化(hua)(hua)(hua)物(wu)或(huo)馬(ma)來酰亞胺(an)部(bu)分(fen))的(de)聚乙(yi)二醇化(hua)(hua)(hua)合(he)物(wu)或(huo)其(qi)衍生(sheng)物(wu)。本文(wen)提(ti)及(ji)的(de)其(qi)它(ta)接頭也可以(yi)具(ju)(ju)有(you)或(huo)不(bu)具(ju)(ju)有(you)偶聯劑、偶聯或(huo)活化(hua)(hua)(hua)部(bu)分(fen)(例如，具(ju)(ju)有(you)羧(suo)酸(suan)/活性(xing)酯(zhi)(zhi)(zhi)、酮(tong)基(ji)(ji)、烷(wan)氧(yang)基(ji)(ji)胺(an)、硫醇、三氟(fu)甲磺酸(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、三氟(fu)乙(yi)基(ji)(ji)磺酸(suan)酯(zhi)(zhi)(zhi)、吖(a)丙啶(ding)(ding)、環氧(yang)乙(yi)烷(wan)、炔(gui)、疊(die)氮(dan)化(hua)(hua)(hua)物(wu)或(huo)馬(ma)來酰亞胺(an)部(bu)分(fen))

在(zai)一個具體(ti)實(shi)施方案中，根(gen)據本發明(ming)使(shi)用的(de)PEG是單(dan)分(fen)散的(de)。在(zai)另(ling)一具體(ti)實(shi)施方案中，根(gen)據本發明(ming)使(shi)用的(de)PEG是多分(fen)散的(de)。

多分(fen)(fen)散PEG由具有不同分(fen)(fen)子(zi)量的PEG分(fen)(fen)子(zi)組成。大小分(fen)(fen)布可通過其(qi)(qi)重均分(fen)(fen)子(zi)量(Mw)和(he)其(qi)(qi)數均分(fen)(fen)子(zi)量(Mn)在統計學(xue)上表征(zheng)，其(qi)(qi)比(bi)值被稱為多分(fen)(fen)散性指數(Mw/Mn)(參見例如“Polymer Synthesis and Characterization”，J.A.Nairn，University of Utah，2003)。可通過質譜法(fa)來(lai)測量Mw和(he)Mn。

多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)可以是大于(yu)(yu)或等(deng)于(yu)(yu)1的(de)數(shu)(shu)值，并(bing)且(qie)可由凝膠(jiao)滲透色譜數(shu)(shu)據估算。當多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)為1時，產物是單(dan)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)的(de)，并(bing)因(yin)此由具(ju)有單(dan)一分(fen)(fen)(fen)子(zi)量的(de)化合物組(zu)成。當多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)大于(yu)(yu)1時，聚合物是多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)的(de)，并(bing)且(qie)該(gai)多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)表明(ming)具(ju)有不(bu)同分(fen)(fen)(fen)子(zi)量的(de)聚合物的(de)分(fen)(fen)(fen)布廣(guang)泛性(xing)(xing)。多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)通(tong)常隨著PEG分(fen)(fen)(fen)子(zi)量的(de)增加(jia)而增加(jia)。在具(ju)體實施方案(an)中，根據本發明(ming)使用的(de)PEG的(de)多(duo)(duo)分(fen)(fen)(fen)散(san)(san)(san)性(xing)(xing)指(zhi)(zhi)數(shu)(shu)：i)低(di)于(yu)(yu)1.06，ii)低(di)于(yu)(yu)1.05，iii)低(di)于(yu)(yu)1.04，iv)低(di)于(yu)(yu)1.03，或v)在1.02與1.03之間。

根據用于聚(ju)合過程的(de)起(qi)始劑(ji)，可獲得不同形(xing)式的(de)PEG。

在Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54，459-476，Nature Reviews Drug Discovery，2003，2，214-221DOI：10.1038/nrd1033，Adv Polym Sci，2006，192，95-134，DOI 10.1007/12_022，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg，2005，以(yi)及其中的參考文獻(xian)中描述(shu)了(le)用于PEG取(qu)代(dai)基綴(zhui)合的多種方法。或者，可通過使用酶(mei)促方法來(lai)進(jin)行親(qin)水聚合物取(qu)代(dai)基的綴(zhui)合。這樣的方法例如是使用如WO2006134148中所(suo)述(shu)的轉谷氨酰胺(an)酶(mei)。

為了(le)(le)(le)實現聚(ju)合(he)(he)物(wu)分(fen)(fen)子(zi)(zi)與(yu)多肽的(de)共價連接，以活(huo)(huo)化(hua)(hua)(hua)形式提(ti)供聚(ju)合(he)(he)物(wu)分(fen)(fen)子(zi)(zi)的(de)端基，即(ji)具有(you)(you)反應性官能團。合(he)(he)適的(de)活(huo)(huo)化(hua)(hua)(hua)聚(ju)合(he)(he)物(wu)分(fen)(fen)子(zi)(zi)可(ke)商(shang)購(gou)獲得(de)，例(li)如來自(zi)Aldrich Corporation，St.Louis，MO，USA，Rapp Polymere GmbH，Tübingen，Germany或來自(zi)PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。或者，可(ke)通過(guo)本領域已知的(de)常規方(fang)法激(ji)活(huo)(huo)聚(ju)合(he)(he)物(wu)分(fen)(fen)子(zi)(zi)，例(li)如，如WO 90/13540中(zhong)所(suo)公(gong)開(kai)(kai)的(de)。在第5,932,462和(he)5,643,575號美國專利中(zhong)公(gong)開(kai)(kai)了(le)(le)(le)活(huo)(huo)化(hua)(hua)(hua)的(de)PEG聚(ju)合(he)(he)物(wu)的(de)具體實例(li)。此(ci)外(wai)，下(xia)列公(gong)開(kai)(kai)文本公(gong)開(kai)(kai)了(le)(le)(le)有(you)(you)用的(de)聚(ju)合(he)(he)物(wu)分(fen)(fen)子(zi)(zi)和(he)/或聚(ju)乙二醇化(hua)(hua)(hua)化(hua)(hua)(hua)學(xue)反應：WO2003/031464，WO2004/099231。

可通過(guo)使用任何常規方法(fa)(fa)來進行單克隆抗(kang)體或(huo)其(qi)片段(duan)與活(huo)(huo)化(hua)的(de)(de)聚(ju)合物分(fen)子(zi)的(de)(de)綴(zhui)合，例(li)如，如下列參(can)考文獻(其(qi)也描述(shu)了用于聚(ju)合物分(fen)子(zi)活(huo)(huo)化(hua)的(de)(de)合適方法(fa)(fa))所(suo)述(shu)：R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等(deng)人，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.，Bioconjugate Techniques，第二版，Greg T.Hermanson，2008，Amsterdam，Elsevier。熟練(lian)的(de)(de)技術人員將意識(shi)到(dao)，待使用的(de)(de)活(huo)(huo)化(hua)方法(fa)(fa)和(he)/或(huo)綴(zhui)合化(hua)學(xue)反應(ying)取決于多(duo)(duo)肽(tai)的(de)(de)連接(jie)基(ji)(ji)(ji)團(其(qi)實例(li)在上(shang)文進一步(bu)給出)以及(ji)聚(ju)合物的(de)(de)官能團(例(li)如，為胺、羥基(ji)(ji)(ji)、羧基(ji)(ji)(ji)、醛(quan)、巰(qiu)基(ji)(ji)(ji)、琥珀酰亞胺基(ji)(ji)(ji)、馬來酰亞胺、乙烯基(ji)(ji)(ji)砜或(huo)鹵代(dai)乙酸(suan)酯)。聚(ju)乙二醇化(hua)可針對與多(duo)(duo)肽(tai)上(shang)可用的(de)(de)連接(jie)基(ji)(ji)(ji)團(即暴露(lu)在多(duo)(duo)肽(tai)表面的(de)(de)這類連接(jie)基(ji)(ji)(ji)團)綴(zhui)合，或(huo)者可針對一個或(huo)多(duo)(duo)個特定連接(jie)基(ji)(ji)(ji)團，例(li)如N-末端(duan)氨基(ji)(ji)(ji)或(huo)巰(qiu)基(ji)(ji)(ji)。此外，可在一個步(bu)驟中或(huo)以逐步(bu)的(de)(de)方式實現綴(zhui)合。

在(zai)另一實施方(fang)案中(zhong)，用作(zuo)接頭的(de)化(hua)學部分是羥乙基(ji)淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)。如本(ben)文中(zhong)所用的(de)術語“羥乙基(ji)淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)”(HES/HAES)是指非離子淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)衍生物。不(bu)同類型的(de)羥乙基(ji)淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)通(tong)常(chang)通(tong)過它(ta)們的(de)平(ping)均分子量(liang)進行(xing)描述，通(tong)常(chang)約為130至200kDa。

在另一實施方案中(zhong)，在接頭(tou)中(zhong)使用的(de)化學部分包括聚唾液(ye)酸。

在另一實施(shi)方案中，在接(jie)頭(tou)中使用的(de)化學部(bu)分包括(kuo)在例如Glycobiology(2011)21：1331-1340中描述的(de)肝素前體(heparosan)聚合物。

在(zai)另(ling)一實施方案中(zhong)，使(shi)用接(jie)頭中(zhong)的(de)化學部分(fen)使(shi)至少一種蛋白(bai)質(zhi)(zhi)與聚(ju)糖(tang)連接(jie)：與蛋白(bai)質(zhi)(zhi)連接(jie)的(de)多(duo)糖(tang)或(huo)寡糖(tang)。

在另(ling)一實施方案(an)中，使(shi)用接頭中的化學(xue)部分使(shi)至少一種蛋(dan)白質與O-連(lian)接的聚糖(tang)連(lian)接。

在(zai)另一實施方案中，使用接頭中的化學部分使至(zhi)少(shao)一種(zhong)蛋白質與N-連(lian)接的聚糖(tang)連(lian)接。

通過產生(sheng)這些蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)細(xi)胞使(shi)(shi)N-聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)和O-聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)均與(yu)(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)如抗體(ti)連接。當新生(sheng)蛋(dan)白(bai)從核糖(tang)(tang)(tang)體(ti)轉移至內質(zhi)(zhi)網(wang)時，細(xi)胞N-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)機制(zhi)識別氨基(ji)(ji)酸(suan)鏈中(zhong)的(de)(de)N-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)信(xin)號(N-X-S/T基(ji)(ji)序)并使(shi)(shi)其糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)(Kiely等人(ren)，J.Biol.Chem.1976，251：5490；Glabe等人(ren)，J.Biol.Chem.，1980，255，9236)。同樣，使(shi)(shi)O-聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)連接至氨基(ji)(ji)酸(suan)鏈中(zhong)的(de)(de)特(te)異(yi)性O-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)位(wei)點(dian)，但是觸發O-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)的(de)(de)基(ji)(ji)序比N-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)信(xin)號更異(yi)質(zhi)(zhi)，并且我們(men)預(yu)測氨基(ji)(ji)酸(suan)序列中(zhong)O-糖(tang)(tang)(tang)基(ji)(ji)化(hua)位(wei)點(dian)的(de)(de)能力仍然不(bu)足(Julenius等人(ren)，Glycobiology，2005，15：153)。例如在WO0331464中(zhong)描(miao)述(shu)了使(shi)(shi)多(duo)肽與(yu)(yu)各種聚(ju)合的(de)(de)側基(ji)(ji)綴合的(de)(de)方法。

在另一實施方案(an)中，在接(jie)(jie)頭(tou)中使用的化學部分包(bao)括用來連接(jie)(jie)所述接(jie)(jie)頭(tou)與(yu)至少一種蛋白質的化學部分，具有以(yi)下二(er)價(jia)基團的所選(xuan)結構：

本發明(ming)的雙特(te)異性抗體可(ke)以是人、人源化、嵌(qian)合或工程抗體。

如(ru)本文所(suo)用的(de)(de)，術語“人抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)”旨(zhi)在包括具有可變區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)，在該(gai)可變區(qu)(qu)(qu)中，框架區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)至(zhi)(zhi)少一(yi)部(bu)分和/或CDR區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)至(zhi)(zhi)少一(yi)部(bu)分來(lai)源(yuan)于(yu)人種(zhong)系(xi)免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)白序列(lie)(lie)。(例如(ru)，人抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)可具有其中框架區(qu)(qu)(qu)和CDR區(qu)(qu)(qu)均來(lai)源(yuan)于(yu)人種(zhong)系(xi)免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)白序列(lie)(lie)的(de)(de)可變區(qu)(qu)(qu)。)此外(wai)，如(ru)果抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)含有恒定區(qu)(qu)(qu)，則該(gai)恒定區(qu)(qu)(qu)或其一(yi)部(bu)分也(ye)來(lai)源(yuan)于(yu)人種(zhong)系(xi)免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)白序列(lie)(lie)。本發明(ming)的(de)(de)人抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)可包括不(bu)是由人種(zhong)系(xi)免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)(dan)白序列(lie)(lie)編碼的(de)(de)氨基酸殘基(例如(ru)，通過(guo)體(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)隨機(ji)或位點特異性突變或通過(guo)體(ti)(ti)(ti)(ti)內(nei)體(ti)(ti)(ti)(ti)細胞突變引入的(de)(de)突變)。

這樣的人(ren)(ren)雙特異性抗(kang)體(ti)可以(yi)來源于兩種(zhong)人(ren)(ren)單克隆抗(kang)體(ti)。人(ren)(ren)單克隆抗(kang)體(ti)可以(yi)由雜交瘤產(chan)生(sheng)，該(gai)雜交瘤包(bao)括與無限增(zeng)殖化細胞(bao)(bao)融(rong)合(he)的B細胞(bao)(bao)，該(gai)B細胞(bao)(bao)從轉(zhuan)基因非人(ren)(ren)類動物例如轉(zhuan)基因小鼠(shu)獲得，具(ju)有包(bao)含人(ren)(ren)免(mian)疫球蛋白重鏈(lian)和(he)輕鏈(lian)基因區段的所有組成成分的基因組。

人抗體可以從(cong)基(ji)于人種系序(xu)列的(de)選擇而(er)建立(li)的(de)、用天然和合成(cheng)序(xu)列多(duo)樣性進一步多(duo)樣化的(de)序(xu)列文庫中分離。

人抗體可通過人淋巴細胞(bao)的體外免疫及隨后用(yong)EB病毒(du)轉(zhuan)化該淋巴細胞(bao)來制備(bei)。

術語(yu)“人抗體衍生(sheng)物”是(shi)指人抗體的(de)任(ren)何(he)修(xiu)飾形式，如(ru)抗體與另一種物質或(huo)抗體的(de)綴合物。

如(ru)(ru)(ru)本文所用(yong)(yong)的，術(shu)語“人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)”是指(zhi)含有(you)(you)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于非(fei)人(ren)免(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋白的序列元(yuan)件(CDR區或(huo)(huo)其部分)的人(ren)/非(fei)人(ren)嵌合(he)(he)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)。因此，人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)是這樣的人(ren)免(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋白(接(jie)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti))，其中至(zhi)少來(lai)(lai)自(zi)該(gai)接(jie)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的高(gao)變(bian)(bian)(bian)區的殘基(ji)(ji)(ji)(ji)被(bei)來(lai)(lai)自(zi)非(fei)人(ren)類物種(zhong)(zhong)如(ru)(ru)(ru)小鼠、大(da)鼠、兔或(huo)(huo)非(fei)人(ren)靈長類動物的抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(供(gong)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti))的高(gao)變(bian)(bian)(bian)區的、具(ju)有(you)(you)所需特異性(xing)、親(qin)和力、序列組(zu)成和功(gong)能(neng)性(xing)的殘基(ji)(ji)(ji)(ji)所替代(dai)。在一些情況下，人(ren)免(mian)疫(yi)(yi)球(qiu)蛋白的框(kuang)架(jia)(jia)(FR)殘基(ji)(ji)(ji)(ji)被(bei)相應的非(fei)人(ren)類殘基(ji)(ji)(ji)(ji)所替代(dai)。這種(zhong)(zhong)修飾的一個實(shi)例是一個或(huo)(huo)多個所謂的回(hui)復(fu)突(tu)變(bian)(bian)(bian)的引(yin)(yin)入，該(gai)回(hui)復(fu)突(tu)變(bian)(bian)(bian)一般是來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于供(gong)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的氨基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)(ji)(ji)。抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)可(ke)(ke)(ke)采用(yong)(yong)本領域技術(shu)人(ren)員(yuan)已知的重組(zu)技術(shu)進行(xing)(參見，例如(ru)(ru)(ru)，Antibody Engineering，Methods in Molecular Biology，vol.248，由Benny K.Lo編著)。對(dui)輕鏈(lian)和重鏈(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)(bian)域均適合(he)(he)的人(ren)類接(jie)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)框(kuang)架(jia)(jia)可(ke)(ke)(ke)通(tong)過(guo)例如(ru)(ru)(ru)序列或(huo)(huo)結構同源(yuan)(yuan)(yuan)性(xing)來(lai)(lai)鑒(jian)定(ding)(ding)(ding)。或(huo)(huo)者，例如(ru)(ru)(ru)，可(ke)(ke)(ke)基(ji)(ji)(ji)(ji)于對(dui)結構、生物物理學和生物化(hua)(hua)(hua)(hua)學性(xing)質(zhi)的了解使(shi)用(yong)(yong)固定(ding)(ding)(ding)的接(jie)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)框(kuang)架(jia)(jia)。該(gai)接(jie)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)框(kuang)架(jia)(jia)可(ke)(ke)(ke)以是種(zhong)(zhong)系(xi)衍生的或(huo)(huo)衍生自(zi)成熟的抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序列。來(lai)(lai)自(zi)供(gong)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的CDR區可(ke)(ke)(ke)以通(tong)過(guo)CDR移植進行(xing)轉(zhuan)移。可(ke)(ke)(ke)通(tong)過(guo)確定(ding)(ding)(ding)關(guan)鍵框(kuang)架(jia)(jia)位置來(lai)(lai)進一步在例如(ru)(ru)(ru)親(qin)和力、功(gong)能(neng)性(xing)和生物物理學性(xing)質(zhi)方面優化(hua)(hua)(hua)(hua)CDR移植的人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，在該(gai)關(guan)鍵框(kuang)架(jia)(jia)位置處再次引(yin)(yin)入(回(hui)復(fu)突(tu)變(bian)(bian)(bian))來(lai)(lai)自(zi)供(gong)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的氨基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)(ji)(ji)對(dui)人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的性(xing)質(zhi)具(ju)有(you)(you)有(you)(you)利(li)影(ying)響。除了來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)于供(gong)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的回(hui)復(fu)突(tu)變(bian)(bian)(bian)外，還可(ke)(ke)(ke)通(tong)過(guo)在CDR或(huo)(huo)框(kuang)架(jia)(jia)區中引(yin)(yin)入種(zhong)(zhong)系(xi)殘基(ji)(ji)(ji)(ji)、消除免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)性(xing)表位、定(ding)(ding)(ding)點突(tu)變(bian)(bian)(bian)、親(qin)和力成熟等對(dui)人(ren)源(yuan)(yuan)(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)進行(xing)工程化(hua)(hua)(hua)(hua)。

此外，人(ren)(ren)源化抗(kang)體(ti)(ti)可(ke)包(bao)(bao)含在接受體(ti)(ti)抗(kang)體(ti)(ti)或供體(ti)(ti)抗(kang)體(ti)(ti)中未發現的殘基(ji)。進(jin)行這些修(xiu)飾以進(jin)一(yi)步改(gai)善(shan)抗(kang)體(ti)(ti)性能。通常，人(ren)(ren)源化抗(kang)體(ti)(ti)將包(bao)(bao)含至少一(yi)個(ge)-一(yi)般兩個(ge)-可(ke)變域(yu)，其(qi)中全(quan)(quan)部(bu)(bu)或基(ji)本(ben)上(shang)全(quan)(quan)部(bu)(bu)的CDR區對(dui)應于(yu)非人(ren)(ren)免疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)的CDR區，并且(qie)其(qi)中全(quan)(quan)部(bu)(bu)或基(ji)本(ben)上(shang)全(quan)(quan)部(bu)(bu)的FR殘基(ji)是人(ren)(ren)免疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)序列的FR殘基(ji)。人(ren)(ren)源化抗(kang)體(ti)(ti)也可(ke)任(ren)選地包(bao)(bao)含免疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)恒定(ding)區的至少一(yi)部(bu)(bu)分(Fc)，一(yi)般是人(ren)(ren)免疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)的相應部(bu)(bu)分。

術語“人(ren)源化抗體(ti)(ti)衍生物”是指人(ren)源化抗體(ti)(ti)的(de)任何修(xiu)飾形式，如抗體(ti)(ti)與另(ling)一種化學(xue)劑或抗體(ti)(ti)或抗體(ti)(ti)片(pian)段(duan)或多(duo)肽的(de)綴合物。

如(ru)本(ben)文(wen)所(suo)用的(de)(de)，術語“嵌合抗(kang)體(ti)(ti)”是指(zhi)這樣的(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)，其輕鏈(lian)和重鏈(lian)基因已(yi)經從起源于不(bu)同(tong)物種的(de)(de)免疫球(qiu)蛋(dan)白可(ke)變(bian)區和恒定(ding)(ding)區基因構建，一般是通過遺(yi)傳工程化構建。例如(ru)，來自小鼠單克隆(long)抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)基因的(de)(de)可(ke)變(bian)區段可(ke)連接到人恒定(ding)(ding)區。

抗(kang)體(ti)(ti)的(de)片段可(ke)(ke)結(jie)晶區(qu)(“Fc區(qu)”/“Fc域(yu)”)是包(bao)(bao)含(han)(han)恒定(ding)CH2和CH3域(yu)的(de)抗(kang)體(ti)(ti)C-末端區(qu)。Fc域(yu)可(ke)(ke)與(yu)被稱為(wei)Fc受(shou)體(ti)(ti)的(de)細胞表面受(shou)體(ti)(ti)以(yi)(yi)及補體(ti)(ti)系(xi)統的(de)一(yi)些(xie)蛋白質相互(hu)(hu)作用。Fc區(qu)使得抗(kang)體(ti)(ti)能夠與(yu)免(mian)疫系(xi)統相互(hu)(hu)作用。在本(ben)(ben)發明的(de)一(yi)個(ge)方面，可(ke)(ke)對(dui)抗(kang)體(ti)(ti)進行(xing)(xing)工程化(hua)以(yi)(yi)在Fc區(qu)內包(bao)(bao)含(han)(han)修飾，一(yi)般用于改(gai)變(bian)其(qi)(qi)一(yi)種(zhong)或(huo)(huo)多種(zhong)功(gong)能性質，如血(xue)清半衰期、補體(ti)(ti)固(gu)定(ding)、Fc受(shou)體(ti)(ti)結(jie)合、蛋白質穩定(ding)性和/或(huo)(huo)抗(kang)原依賴性細胞毒性，或(huo)(huo)這些(xie)性質的(de)缺乏，等等。此外，可(ke)(ke)對(dui)本(ben)(ben)發明的(de)抗(kang)體(ti)(ti)進行(xing)(xing)化(hua)學修飾(例如，可(ke)(ke)將(jiang)一(yi)個(ge)或(huo)(huo)多個(ge)化(hua)學部分(fen)連接(jie)至(zhi)該抗(kang)體(ti)(ti))或(huo)(huo)進行(xing)(xing)修飾以(yi)(yi)改(gai)變(bian)其(qi)(qi)糖基化(hua)，從而再次改(gai)變(bian)該抗(kang)體(ti)(ti)的(de)一(yi)種(zhong)或(huo)(huo)多種(zhong)功(gong)能性質。IgG1抗(kang)體(ti)(ti)可(ke)(ke)攜帶修飾的(de)Fc域(yu)，該Fc域(yu)包(bao)(bao)含(han)(han)以(yi)(yi)下(xia)突變(bian)中(zhong)的(de)一(yi)個(ge)或(huo)(huo)多個(ge)以(yi)(yi)及可(ke)(ke)能全部，這些(xie)突變(bian)將(jiang)分(fen)別導致對(dui)某些(xie)Fc受(shou)體(ti)(ti)的(de)親和力降(jiang)低(L234A、L235E和G237A)以(yi)(yi)及C1q介導的(de)補體(ti)(ti)固(gu)定(ding)減少(A330S和P331S)(殘基根據(ju)EU索引編號)。

本發(fa)明抗體(ti)的同(tong)種型可以(yi)是IgG，如(ru)(ru)IgG1，如(ru)(ru)IgG2，如(ru)(ru)IgG4。如(ru)(ru)果需要，抗體(ti)的類別可通過(guo)已(yi)知技術進(jin)行“轉(zhuan)換(huan)”。例如(ru)(ru)，最(zui)初作為IgM分子產生的抗體(ti)可類別轉(zhuan)換(huan)為IgG抗體(ti)。類別轉(zhuan)換(huan)技術還可用(yong)來(lai)將一(yi)個(ge)IgG亞(ya)類轉(zhuan)換(huan)成另一(yi)個(ge)亞(ya)類，例如(ru)(ru)：從(cong)IgG1轉(zhuan)換(huan)成IgG2或IgG4；從(cong)IgG2轉(zhuan)換(huan)成IgG1或IgG4；或從(cong)IgG4轉(zhuan)換(huan)成IgG1或IgG2。還可以(yi)進(jin)行通過(guo)來(lai)自不(bu)同(tong)IgG亞(ya)類的區域的組合而生成恒定(ding)區嵌合分子的抗體(ti)工程化(hua)。

在一個(ge)實施方案中，對(dui)CH1的鉸鏈區(qu)(qu)進行修飾(shi)，使得(de)該(gai)鉸鏈區(qu)(qu)中的半(ban)胱(guang)氨酸殘基的數目(mu)改(gai)變，例(li)如(ru)增加或(huo)減少(shao)。該(gai)方法在例(li)如(ru)Bodmer等人的第5,677,425號美國專利中進一步描述(shu)。

可對(dui)恒(heng)定區進(jin)行修飾以(yi)使(shi)抗(kang)體穩(wen)定化，例(li)如(ru)(ru)，降低二價抗(kang)體分離成兩個單(dan)價VH-VL片段的風險。例(li)如(ru)(ru)，在lgG4恒(heng)定區中，殘基S228(根(gen)據EU編號索引，根(gen)據Kabat為S241)可突變成脯氨酸(P)殘基，以(yi)使(shi)鉸(jiao)鏈處(chu)的重(zhong)鏈間(jian)二硫鍵形(xing)成穩(wen)定化(參見(jian)，例(li)如(ru)(ru)，Angal等人，Mol Immunol.1993；30：105-8)。

本(ben)發明的(de)雙特異性抗(kang)體可包含mAb 2F3抗(kang)體、mAb 2F22抗(kang)體(如Fab 0295或(huo)Fab 0296)、mAb 2F45抗(kang)體或(huo)mAb 1F91抗(kang)體的(de)抗(kang)原結合片段或(huo)其變體。

本發明的(de)雙特異性抗(kang)體可進一步包含mAb 2021抗(kang)體的(de)抗(kang)原結(jie)合(he)片段(duan)或其(qi)變體，該抗(kang)體是在(zai)WO2010/072691中首(shou)次描(miao)(miao)述(shu)(shu)的(de)人源化單(dan)克隆(long)抗(kang)體，并且由此通過(guo)引用(yong)而并入(ru)。這(zhe)類抗(kang)原結(jie)合(he)片段(duan)或其(qi)變體的(de)實(shi)例包括如本文描(miao)(miao)述(shu)(shu)的(de)Fab 0088、Fab 0094或Fab 0313。衍生出mAb 2021的(de)單(dan)克隆(long)鼠抗(kang)體可以如WO2010/072691所(suo)述(shu)(shu)產生。

包含(han)mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45或(huo)mAb 1F91的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)片段(duan)或(huo)其(qi)變(bian)(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)(he)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)片段(duan)或(huo)其(qi)變(bian)(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)上述雙(shuang)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)任一種(zhong)可(ke)(ke)(ke)以是(shi)IgG形(xing)式的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全長雙(shuang)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)或(huo)由抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)片段(duan)組成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)特(te)異(yi)性(xing)分子。抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)或(huo)其(qi)片段(duan)可(ke)(ke)(ke)按(an)照其(qi)互補(bu)決(jue)定(ding)區(qu)(qu)(CDR)來(lai)(lai)定(ding)義(yi)(yi)。術語(yu)“互補(bu)決(jue)定(ding)區(qu)(qu)”或(huo)“高(gao)(gao)變(bian)(bian)區(qu)(qu)”在本文(wen)中(zhong)(zhong)使(shi)用(yong)時是(shi)指參與(yu)抗(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)位于(yu)其(qi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)區(qu)(qu)域(yu)(yu)。高(gao)(gao)變(bian)(bian)區(qu)(qu)或(huo)CDR可(ke)(ke)(ke)被(bei)鑒(jian)定(ding)為(wei)在抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸比對(dui)(dui)中(zhong)(zhong)具有(you)最高(gao)(gao)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域(yu)(yu)。數據(ju)(ju)庫如(ru)Kabat數據(ju)(ju)庫可(ke)(ke)(ke)用(yong)于(yu)CDR鑒(jian)定(ding)，例如(ru)，CDR被(bei)定(ding)義(yi)(yi)為(wei)包含(han)輕鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)24-34(L1)、50-56(L2)和(he)(he)89-97(L3)以及(ji)重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)31-35(H1)、50-65(H2)和(he)(he)95-102(H3)；(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第(di)五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。或(huo)者，CDR可(ke)(ke)(ke)被(bei)定(ding)義(yi)(yi)為(wei)來(lai)(lai)自“高(gao)(gao)變(bian)(bian)環”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)那(nei)些殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)(輕鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)26-33(L1)、50-52(L2)和(he)(he)91-96(L3)以及(ji)重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)26-32(H1)、53-55(H2)和(he)(he)96-101(H3)；Chothia和(he)(he)Lesk，J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。通(tong)常，該區(qu)(qu)域(yu)(yu)中(zhong)(zhong)氨(an)(an)基(ji)酸殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)編(bian)號通(tong)過在Kabat等人(同(tong)上)中(zhong)(zhong)描述的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法進(jin)行(xing)。本文(wen)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)短(duan)語(yu)如(ru)“Kabat位置”、“Kabat殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)”和(he)(he)“根(gen)(gen)據(ju)(ju)Kabat”是(shi)指用(yong)于(yu)重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)或(huo)輕鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)這(zhe)一編(bian)號體(ti)(ti)(ti)(ti)系。通(tong)過使(shi)用(yong)Kabat編(bian)號體(ti)(ti)(ti)(ti)系，肽的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)際線性(xing)氨(an)(an)基(ji)酸序列(lie)可(ke)(ke)(ke)含(han)有(you)較(jiao)少的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)額外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸，這(zhe)對(dui)(dui)應(ying)于(yu)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)框架(FR)或(huo)CDR的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)縮(suo)短(duan)或(huo)向其(qi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)插(cha)入。例如(ru)，重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)可(ke)(ke)(ke)變(bian)(bian)域(yu)(yu)可(ke)(ke)(ke)包含(han)在CDR H2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)52后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸插(cha)入(根(gen)(gen)據(ju)(ju)Kabat的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)52a、52b和(he)(he)52c)以及(ji)在重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)FR殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)82后(hou)插(cha)入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)(例如(ru)，根(gen)(gen)據(ju)(ju)Kabat的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)82a、82b和(he)(he)82c等)。可(ke)(ke)(ke)通(tong)過將抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)序列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)同(tong)源性(xing)區(qu)(qu)域(yu)(yu)與(yu)“標準的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)”Kabat編(bian)號的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)序列(lie)進(jin)行(xing)比對(dui)(dui)，來(lai)(lai)確定(ding)給(gei)定(ding)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)(can)(can)(can)基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Kabat編(bian)號。

術語“框(kuang)架區”或“FR”殘(can)基是指如本文定義的不在CDR內的那些(xie)VH或VL氨基酸(suan)殘(can)基。

本發(fa)明雙特異性抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)抗(kang)原識(shi)別(bie)位(wei)點(dian)可包含來自一種或多種本文公開(kai)的(de)(de)特異性抗(kang)體(ti)(ti)或抗(kang)體(ti)(ti)片段的(de)(de)CDR區，如(ru)來自SEQ ID NO：4至(zhi)(zhi)(zhi)11、14至(zhi)(zhi)(zhi)15、17至(zhi)(zhi)(zhi)26內(nei)的(de)(de)CDR區，如(ru)根據本文公開(kai)的(de)(de)連續氨(an)基酸編號(hao)或使用Kabat編號(hao)所定(ding)義的(de)(de)。

所述(shu)雙特異性(xing)抗體的(de)第一抗原識別位點可具有(you)重鏈，該重鏈包含：

●對應于SEQ ID NO：4的氨基(ji)酸31至35(SYGVH)的CDR1序(xu)列，其中這些氨基(ji)酸殘(can)基(ji)中的一個(ge)可被不同的氨基(ji)酸殘(can)基(ji)置換；和/或

●對(dui)應于SEQ ID NO：4的(de)(de)氨(an)基酸(suan)(suan)50至65(VIWRGGSTDFNAAFMS)的(de)(de)CDR2序列，其(qi)中這些氨(an)基酸(suan)(suan)中的(de)(de)一個、兩個或(huo)三個可被(bei)不同的(de)(de)氨(an)基酸(suan)(suan)殘(can)基置換；和/或(huo)

●對應于(yu)SEQ ID NO：4的(de)氨(an)基酸(suan)98至110(NSHGNYVGYAMDY)的(de)CDR3序列，其中這些氨(an)基酸(suan)殘(can)基中的(de)一個或兩個可被不同的(de)氨(an)基酸(suan)置換。

并且所述第一抗原識別(bie)位(wei)點可(ke)具有輕鏈，該輕鏈包含：

●對(dui)應(ying)于SEQ ID NO：5的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)24至34(KASENVGAAVA)的(de)CDR1序(xu)列，其中(zhong)這些氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)中(zhong)的(de)一個(ge)、兩個(ge)或三個(ge)可(ke)被不同(tong)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)置換；和(he)/或

●對應于SEQ ID NO：5的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)50至56(SASNRYT)的(de)CDR2序列，其中(zhong)這些氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)中(zhong)的(de)一個可(ke)被不同的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)殘(can)(can)基(ji)置換；如(ru)/或

●對應于(yu)SEQ ID NO：5的(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)酸89至(zhi)96(QQYTNYPT)的(de)CDR3序列，其中這些氨(an)(an)基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)中的(de)一個可被不(bu)同的(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)置換(huan)。

所述(shu)雙(shuang)特(te)異性抗體的第一抗原識(shi)別位點可具有重鏈，該重鏈包含：

●對應(ying)于(yu)SEQ ID NO：6的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)31至35(NYGVH)的(de)CDR1序列，其中這些(xie)氨(an)基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)中的(de)一(yi)個(ge)可被(bei)不(bu)同(tong)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)置換；和(he)/或

●對(dui)應于SEQ ID NO：6的(de)(de)氨(an)基(ji)酸50至(zhi)65(VIWRGGSIDYNAAFMS)的(de)(de)CDR2序(xu)列(lie)，其中(zhong)這些氨(an)基(ji)酸中(zhong)的(de)(de)一個(ge)、兩個(ge)或三個(ge)可被(bei)不同(tong)的(de)(de)氨(an)基(ji)酸殘基(ji)置換；和(he)/或

●對應(ying)于SEQ ID NO：6的氨(an)基酸(suan)(suan)98至110(NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列(lie)，其中這些氨(an)基酸(suan)(suan)殘基中的一個或兩個可被不同的氨(an)基酸(suan)(suan)置換。

并且所述第(di)一(yi)抗(kang)原(yuan)識別位(wei)點可(ke)具有(you)輕鏈，該輕鏈包含(han)：

●對應于(yu)SEQ ID NO：7的(de)(de)氨(an)基酸(suan)24至34(KASQSVGPAVA)的(de)(de)CDR1序列，其中(zhong)這些氨(an)基酸(suan)殘(can)基中(zhong)的(de)(de)一個、兩個或三個可(ke)被不同的(de)(de)氨(an)基酸(suan)殘(can)基置換；和/或

●對(dui)應于SEQ ID NO：7的氨基(ji)(ji)酸50至56(SASNRYT)的CDR2序(xu)列，其中這些氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)中的一(yi)個可(ke)被不同(tong)的氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)置換(huan)；和/或

●對應(ying)于(yu)SEQ ID NO：7的(de)氨基(ji)酸89至96(QQYTSYPT)的(de)CDR3序(xu)列，其中這些氨基(ji)酸殘基(ji)中的(de)一個可被不同的(de)氨基(ji)酸殘基(ji)置(zhi)換。

所述雙(shuang)特異性抗(kang)(kang)體的第一抗(kang)(kang)原識(shi)別位點(dian)可(ke)具(ju)有重(zhong)(zhong)鏈(lian)，該(gai)重(zhong)(zhong)鏈(lian)包含：

●對應于(yu)SEQ ID NO：8的氨基酸31至35(GYGVH)的CDR1序列，其中這些氨基酸殘(can)基中的一個(ge)可(ke)被不(bu)同的氨基酸殘(can)基置換；和(he)/或

●對應(ying)于SEQ ID NO：8的氨(an)基酸50至65(VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列，其(qi)中(zhong)這些氨(an)基酸中(zhong)的一個、兩個或三個可被不同的氨(an)基酸殘基置換；和/或

●對應于SEQ ID NO：8的(de)氨基(ji)(ji)酸98至110(NSHGNYVGYAMDY)的(de)CDR3序列，其中這些氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)中的(de)一個或兩個可被不同的(de)氨基(ji)(ji)酸置換。

并且所述(shu)第一抗原(yuan)識別位點可具有輕(qing)鏈，該輕(qing)鏈包含(han)：

●對應于SEQ ID NO：9的(de)氨基(ji)(ji)酸(suan)24至34(KASQNVGTAVA)的(de)CDR1序列，其(qi)中(zhong)(zhong)這些(xie)氨基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)的(de)一(yi)個(ge)、兩個(ge)或(huo)三(san)個(ge)可(ke)被不同(tong)的(de)氨基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)置換；和/或(huo)

●對(dui)應(ying)于SEQ ID NO：9的(de)氨基酸(suan)50至56(SASNRYT)的(de)CDR2序列(lie)，其中這些氨基酸(suan)殘基中的(de)一個可被不同的(de)氨基酸(suan)殘基置(zhi)換；和(he)/或(huo)

●對應(ying)于SEQ ID NO：9的氨基(ji)酸(suan)89至96(QQYTSYPT)的CDR3序列，其中這些氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)中的一個可被不同的氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)置(zhi)換(huan)。

所述雙(shuang)特異性抗(kang)體的第一抗(kang)原識(shi)別位點可具有重鏈，該重鏈包含：

●對應(ying)于SEQ ID NO：10的氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)31至36(SDYAWN)的CDR1序(xu)列，其中(zhong)這(zhe)些氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(ji)中(zhong)的一個(ge)可被不同(tong)的氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(ji)置換；和(he)/或

●對應于(yu)SEQ ID NO：10的氨基(ji)酸51至66(YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列，其中這些氨基(ji)酸中的一個、兩(liang)個或(huo)三(san)個可被不(bu)同的氨基(ji)酸殘基(ji)置換；和/或(huo)

●對(dui)應于SEQ ID NO：10的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)99至104(WAYDGP)的(de)(de)(de)CDR3序列，其中這些氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(ji)中的(de)(de)(de)一個可(ke)被(bei)不(bu)同的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)置換。

并且所述第一抗原識別位點可具有輕(qing)鏈，該輕(qing)鏈包含：

●對應于(yu)SEQ ID NO：11的氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)24至33(RASSSVSHMH)的CDR1序列，其中(zhong)這些氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)中(zhong)的一個(ge)或兩個(ge)可被不同的氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)置換；和(he)/或

●對應于(yu)SEQ ID NO：11的氨基酸49至(zhi)55(ATSNLAS)的CDR2序(xu)列(lie)，其中這些氨基酸殘(can)基中的一(yi)個可被不同的氨基酸殘(can)基置換；和(he)/或

●對應于SEQ ID NO：11的氨基(ji)酸(suan)88至96(QQWSSNPFT)的CDR3序列(lie)，其中(zhong)這(zhe)些氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)中(zhong)的一個可(ke)被不同(tong)的氨基(ji)酸(suan)殘基(ji)置換。

所述(shu)雙特異性抗體的第二抗原(yuan)識別位點(dian)可具有重(zhong)鏈，該重(zhong)鏈包(bao)含(han)：

●對應(ying)于SEQ ID NO：19的(de)(de)氨基酸31至(zhi)35(NYAMS)的(de)(de)CDR1序列，其中(zhong)這(zhe)些(xie)氨基酸中(zhong)的(de)(de)一個可被不同的(de)(de)氨基酸置(zhi)換；和/或

●對應于SEQ ID NO：19的氨(an)基酸(suan)50至(zhi)(zhi)66(TISRSGSYSYFPDSVQG)、SEQ ID NO：21的氨(an)基酸(suan)50至(zhi)(zhi)66(TISRSGSYSYYPDSVKG)或SEQ ID NO：25的氨(an)基酸(suan)50至(zhi)(zhi)66(TISRSGSYSYYADSVKG)的CDR2序列(lie)，其中這(zhe)些氨(an)基酸(suan)中的一個(ge)(ge)、兩個(ge)(ge)或三(san)個(ge)(ge)可被不(bu)同的氨(an)基酸(suan)置換；和(he)/或

●對應于SEQ ID NO：19的氨基(ji)(ji)酸99至110(LGGYDEGDAMDS)的CDR3序列，其中(zhong)這些(xie)氨基(ji)(ji)酸中(zhong)的一個(ge)、兩(liang)個(ge)或三個(ge)可被(bei)不同的氨基(ji)(ji)酸置換。

并且所述第(di)二抗(kang)原識別位點(dian)可具(ju)有輕(qing)鏈(lian)，該輕(qing)鏈(lian)包含：

●對應(ying)于SEQ ID NO：20的(de)(de)氨基酸24至39(KSSQSLLESDGKTYLN)的(de)(de)CDR1序列，其中(zhong)這些氨基酸中(zhong)的(de)(de)一(yi)個(ge)、兩個(ge)或三個(ge)可被不(bu)同的(de)(de)氨基酸置(zhi)換；和/或

●對應于SEQ ID NO：20的(de)氨(an)基酸(suan)(suan)55至61(LVSILDS)的(de)CDR2序(xu)列(lie)，其中這些氨(an)基酸(suan)(suan)中的(de)一(yi)個(ge)或(huo)兩個(ge)可被不同(tong)的(de)氨(an)基酸(suan)(suan)置(zhi)換(huan)；和/或(huo)

●對應于SEQ ID NO：20的氨基酸(suan)94至102(LQATHFPQT)的CDR3序列，其(qi)中(zhong)這(zhe)些(xie)氨基酸(suan)中(zhong)的一(yi)個(ge)(ge)或兩個(ge)(ge)可被不同的氨基酸(suan)置換。

所述(shu)氨(an)基酸置換(huan)可以(yi)是如(ru)下(xia)描述(shu)的保守置換(huan)。

因此(ci)，TFPI(1-79)特(te)異(yi)性抗體(ti)片段與(yu)其(qi)KPI-2結(jie)構域特(te)異(yi)性抗體(ti)片段組合(he)以形(xing)成尤其(qi)為融合(he)形(xing)式(shi)、IgG片段形(xing)式(shi)、全長IgG形(xing)式(shi)或作為Fab-Fab綴合(he)物(BiFab)的雙特(te)異(yi)性抗體(ti)。

在一(yi)個這樣的(de)實施方案中，攜帶mAb 1F91的(de)VH和(he)VL區(SEQ ID NO：10，11)的(de)Fab片(pian)段與攜帶mAb 2021的(de)VH、VL區(SEQ ID NO：19，20)的(de)Fab片(pian)段組(zu)合。

在一個這樣的(de)實施方案(an)中(zhong)，攜帶mAb 1F91的(de)VH和VL區(SEQ ID NO：10，11)的(de)Fab片段與Fab片段0094(SEQ ID NO：21，22)組合(he)。

在一(yi)個這樣的(de)實施方案(an)中，攜帶mAb 1F91的(de)VH和(he)VL區(SEQ ID NO：10，11)的(de)Fab片段與Fab片段0313(SEQ ID NO：25，26)組(zu)合(he)。

在一個這樣(yang)的(de)實施方(fang)案中，攜(xie)帶(dai)mAb 2F3的(de)VH和VL區(qu)(SEQ ID NO：4，5)的(de)Fab片段與(yu)攜(xie)帶(dai)mAb 2021的(de)VH、VL區(qu)(SEQ ID NO：19，20)的(de)Fab片段組合。

在一個(ge)這樣的(de)實施方案中，攜帶mAb 2F3的(de)VH和VL區(SEQ ID NO：4，5)的(de)Fab片段與(yu)Fab片段0094(SEQ ID NO：21，22)組合。

在一個這樣(yang)的實(shi)施方案中，攜帶mAb 2F3的VH和VL區(SEQ ID NO：4，5)的Fab片段與Fab片段0313(SEQ ID NO：25，26)組合。

在一個這樣的(de)實施方(fang)案(an)中(zhong)，攜帶mAb 2F22的(de)VH和VL區(SEQ ID NO：6，7)的(de)Fab片(pian)段與攜帶mAb 2021的(de)VH、VL區(SEQ ID NO：19，20)的(de)Fab片(pian)段組合。

在一個這樣的(de)實施方案(an)中，攜(xie)帶mAb 2F22的(de)VH和VL區(SEQ ID NO：6，7)的(de)Fab片段與Fab片段0094(SEQ ID NO：21，22)組合。

在一個(ge)這樣的實施方(fang)案中，攜(xie)帶mAb 2F22的VH和VL區(qu)(SEQ ID NO：6，7)的Fab片(pian)段(duan)與Fab片(pian)段(duan)0313(SEQ ID NO：25，26)組合。

在一個這樣的實(shi)施(shi)方(fang)案中，攜帶mAb 2F45的VH、VL區(qu)(SEQ ID NO：8，9)的Fab片段(duan)與mAb 2021的Fab片段(duan)(SEQ ID NO：19，20)組合(he)。

在一個這樣(yang)的(de)實施方案中，攜帶mAb 2F45的(de)VH和(he)VL區(SEQ ID NO：8，9)的(de)Fab片段與Fab片段0094(SEQ ID NO：21，22)組合。

在一個(ge)這樣的實施(shi)方案中，攜(xie)帶mAb 2F45的VH和(he)VL區(SEQ ID NO：8，9)的Fab片(pian)段與Fab片(pian)段0313(SEQ ID NO：25，26)組合。

根據(ju)本發明(ming)的一種Fab-Fab綴合物(BiFab)可以是(shi)與Fab 0295(SEQ ID NO：15，18)綴合的BiFab 9041(Fab 0088(SEQ ID NO：23，24)。

根據(ju)本發明的另一種Fab-Fab綴(zhui)合(he)物(BiFab)可以是(shi)BiFab 9042，即與Fab 0295(SEQ ID NO：15，18)綴(zhui)合(he)的Fab 0313(SEQ ID NO：25，26)。

在一(yi)個(ge)實施方案中(zhong)，全長形式的(de)(de)(de)雙特異性(xing)(xing)抗體(ti)(mAb 0421)由來自mAb 0310(SEQ ID NO：27，28)和mAb 0336(SEQ ID NO：15，29)的(de)(de)(de)單(dan)獨(du)臂組(zu)成。變(bian)(bian)(bian)異抗體(ti)可以包(bao)(bao)含1、2、3、4、5、可達10個(ge)或(huo)(huo)更多個(ge)相對(dui)于以上討論(lun)的(de)(de)(de)特定(ding)(ding)序列(lie)和片段的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)置(zhi)(zhi)換(huan)和/或(huo)(huo)缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)和/或(huo)(huo)插(cha)入(ru)(ru)(ru)。“缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)”變(bian)(bian)(bian)體(ti)可以包(bao)(bao)含單(dan)獨(du)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)，小組(zu)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)如(ru)(ru)1、2、3、4或(huo)(huo)5個(ge)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)，或(huo)(huo)更大(da)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)區域(yu)的(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)，諸如(ru)(ru)特定(ding)(ding)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)結構(gou)域(yu)或(huo)(huo)其(qi)它特征的(de)(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)(shi)。“插(cha)入(ru)(ru)(ru)”變(bian)(bian)(bian)體(ti)可以包(bao)(bao)含單(dan)獨(du)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)插(cha)入(ru)(ru)(ru)，小組(zu)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)如(ru)(ru)1、2、3、4或(huo)(huo)5個(ge)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)插(cha)入(ru)(ru)(ru)，或(huo)(huo)更大(da)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)區域(yu)的(de)(de)(de)插(cha)入(ru)(ru)(ru)，諸如(ru)(ru)特定(ding)(ding)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)結構(gou)域(yu)或(huo)(huo)其(qi)它特征的(de)(de)(de)插(cha)入(ru)(ru)(ru)。“置(zhi)(zhi)換(huan)”變(bian)(bian)(bian)體(ti)優選地(di)涉及用相同(tong)數(shu)目的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)替(ti)(ti)換(huan)一(yi)個(ge)或(huo)(huo)多個(ge)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，以及進(jin)行(xing)保守氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)置(zhi)(zhi)換(huan)。例(li)如(ru)(ru)，可以將氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)置(zhi)(zhi)換(huan)為具有(you)類似性(xing)(xing)質(zhi)的(de)(de)(de)替(ti)(ti)代氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，例(li)如(ru)(ru)，另一(yi)個(ge)堿性(xing)(xing)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)性(xing)(xing)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)中(zhong)性(xing)(xing)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)帶電荷的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)親水氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)疏水氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)極性(xing)(xing)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、另一(yi)個(ge)芳(fang)族氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)或(huo)(huo)另一(yi)個(ge)脂族氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。可以用來選擇(ze)合適的(de)(de)(de)取代基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)20種主要(yao)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)某些性(xing)(xing)質(zhi)如(ru)(ru)下：

優選的(de)(de)“衍生(sheng)物(wu)”或(huo)“變(bian)體”包括這樣的(de)(de)“衍生(sheng)物(wu)”或(huo)“變(bian)體”，其中(zhong)出(chu)現(xian)在序列(lie)中(zhong)的(de)(de)氨(an)基(ji)酸不(bu)是天然存在的(de)(de)氨(an)基(ji)酸，而是它們的(de)(de)結(jie)構類(lei)似物(wu)。也可(ke)(ke)以衍生(sheng)化或(huo)修飾，例如標記在序列(lie)中(zhong)使用的(de)(de)氨(an)基(ji)酸，只要(yao)抗體的(de)(de)功能(neng)不(bu)會顯著地受(shou)到不(bu)利影響即可(ke)(ke)。

置換可以是(shi)但(dan)不限于保(bao)守置換。

在(zai)抗(kang)體(ti)合成過(guo)程中，或(huo)通(tong)過(guo)生(sheng)產后(hou)修飾，或(huo)當(dang)抗(kang)體(ti)為(wei)重(zhong)組形(xing)式時，可(ke)以(yi)使(shi)用定點突變(bian)、隨機突變(bian)或(huo)核酸的(de)酶(mei)切和/或(huo)連接的(de)已知技術制備如上所(suo)述的(de)衍(yan)生(sheng)物和變(bian)體(ti)。

本發(fa)(fa)明(ming)(ming)還涉及(ji)編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)本發(fa)(fa)明(ming)(ming)抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸。因(yin)此(ci)，本發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸可編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)如本文描(miao)述(shu)的(de)(de)(de)(de)任何(he)抗(kang)體。術語“核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸分(fen)子(zi)”和(he)“多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸”在本文中可互換(huan)使(shi)用，并(bing)且指代任意長度的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸的(de)(de)(de)(de)聚合(he)形式(shi)，該(gai)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸是脫氧核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸或核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)糖(tang)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸，或它們的(de)(de)(de)(de)類似(si)物。多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸的(de)(de)(de)(de)非限制性實(shi)例包括基因(yin)、基因(yin)片段、信使(shi)RNA(mRNA)、cDNA、重組多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸、質粒、載體、任意序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)分(fen)離的(de)(de)(de)(de)DNA、任意序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)分(fen)離的(de)(de)(de)(de)RNA、核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸探針和(he)引物。本發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)(duo)(duo)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)(gan)酸可以(yi)以(yi)分(fen)離的(de)(de)(de)(de)或純化的(de)(de)(de)(de)形式(shi)提供。“編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)”所選擇的(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)(duo)(duo)肽的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)是這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸分(fen)子(zi)，當置于適當調節序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)控制下(xia)時，其在體內被轉錄(在DNA的(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia))和(he)翻(fan)譯(在mRNA的(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia))成多(duo)(duo)(duo)(duo)肽。編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)邊界(jie)由(you)在5′(氨(an)基)末端的(de)(de)(de)(de)起(qi)始密(mi)碼(ma)(ma)(ma)子(zi)和(he)在3′(羧基)末端的(de)(de)(de)(de)翻(fan)譯終止密(mi)碼(ma)(ma)(ma)子(zi)決定。對于本發(fa)(fa)明(ming)(ming)而言，這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)酸序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)可以(yi)包括但(dan)不(bu)限于來自(zi)病毒(du)、原(yuan)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)或真核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)mRNA的(de)(de)(de)(de)cDNA，來自(zi)病毒(du)或原(yuan)核(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)(he)DNA或RNA的(de)(de)(de)(de)基因(yin)組序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)，以(yi)及(ji)甚至合(he)成的(de)(de)(de)(de)DNA序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。轉錄終止序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)可以(yi)位(wei)于編(bian)(bian)碼(ma)(ma)(ma)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)3′側。

在(zai)一(yi)(yi)個實施方案中，本(ben)發明(ming)的(de)(de)多(duo)(duo)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)包含編(bian)碼如(ru)上所述(shu)的(de)(de)VH或(huo)(huo)VL氨基酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)。例(li)(li)如(ru)，本(ben)發明(ming)的(de)(de)多(duo)(duo)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)(ke)以(yi)(yi)編(bian)碼如(ru)上所述(shu)包含SEQ ID NO：4-11、14-15或(huo)(huo)17-26中任一(yi)(yi)個的(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)多(duo)(duo)肽(tai)。或(huo)(huo)者，合適的(de)(de)多(duo)(duo)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)可(ke)(ke)以(yi)(yi)是這(zhe)些(xie)具體(ti)多(duo)(duo)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)之一(yi)(yi)的(de)(de)變體(ti)。例(li)(li)如(ru)，變體(ti)可(ke)(ke)以(yi)(yi)是任何上述(shu)核酸(suan)(suan)(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)置換、缺失或(huo)(huo)添加變體(ti)。相對于在(zai)序(xu)列(lie)(lie)表中給出的(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)，變異多(duo)(duo)核苷酸(suan)(suan)(suan)(suan)可(ke)(ke)以(yi)(yi)包含1、2、3、4、5、可(ke)(ke)達(da)10、可(ke)(ke)達(da)20、可(ke)(ke)達(da)30、可(ke)(ke)達(da)40、可(ke)(ke)達(da)50、可(ke)(ke)達(da)75個或(huo)(huo)更多(duo)(duo)個核酸(suan)(suan)(suan)(suan)置換和/或(huo)(huo)缺失。

合(he)適的(de)(de)(de)(de)變(bian)體可(ke)與(yu)編(bian)碼本(ben)發明多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)多(duo)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)至(zhi)少(shao)70％同(tong)(tong)(tong)源(yuan)，優選至(zhi)少(shao)80％或90％同(tong)(tong)(tong)源(yuan)，更(geng)優選至(zhi)少(shao)95％、97％或99％同(tong)(tong)(tong)源(yuan)。測量同(tong)(tong)(tong)源(yuan)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)方(fang)法是本(ben)領(ling)域公知的(de)(de)(de)(de)，并且本(ben)領(ling)域技(ji)術(shu)人員(yuan)應當理解，在(zai)本(ben)文中，以核(he)(he)酸(suan)(suan)同(tong)(tong)(tong)一性(xing)(xing)(xing)為基(ji)礎來計算同(tong)(tong)(tong)源(yuan)性(xing)(xing)(xing)。這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)同(tong)(tong)(tong)源(yuan)性(xing)(xing)(xing)可(ke)存在(zai)于(yu)至(zhi)少(shao)15個，優選至(zhi)少(shao)30個，例如至(zhi)少(shao)40、60、100、200個或更(geng)多(duo)個連續核(he)(he)苷酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)區域上(shang)。這樣(yang)的(de)(de)(de)(de)同(tong)(tong)(tong)源(yuan)性(xing)(xing)(xing)可(ke)存在(zai)于(yu)未修飾的(de)(de)(de)(de)多(duo)核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序列的(de)(de)(de)(de)整個長度上(shang)。

測量多核苷酸同(tong)源性(xing)或同(tong)一性(xing)的方法是本領域已知的。例如，UWGCG程序包提(ti)供了可用來計(ji)算同(tong)源性(xing)的BESTFIT程序(例如以其默認設(she)置(zhi)使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12：387-395)。

也可使用PILEUP和BLAST算法(fa)來計算同源性或排列序列(通常(chang)使用其默認(ren)設置)，例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S.F.等人(ren)(1990)J Mol Biol 215：403-10中(zhong)所述。

用(yong)(yong)于進行BLAST分(fen)(fen)析的(de)(de)(de)(de)軟件(jian)可(ke)通(tong)過國(guo)家生物技術信息中(zhong)心公開(kai)獲(huo)得(de)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法涉及(ji)首先通(tong)過識別當與數據庫序列(lie)中(zhong)相同長(chang)(chang)度(du)的(de)(de)(de)(de)字(zi)(zi)(zi)詞(ci)比(bi)(bi)對(dui)(dui)時匹(pi)配或(huo)滿(man)足(zu)一(yi)些正(zheng)值閾值得(de)分(fen)(fen)T的(de)(de)(de)(de)查詢序列(lie)中(zhong)長(chang)(chang)度(du)為(wei)(wei)W的(de)(de)(de)(de)短字(zi)(zi)(zi)詞(ci)來鑒別高評分(fen)(fen)序列(lie)對(dui)(dui)(HSP)。T被稱為(wei)(wei)鄰(lin)近字(zi)(zi)(zi)詞(ci)得(de)分(fen)(fen)閾值(Altschul等人(ren)，同上)。這些初始鄰(lin)近字(zi)(zi)(zi)詞(ci)命(ming)中(zhong)(hit)充(chong)當用(yong)(yong)于啟動搜索以(yi)查找包含它們的(de)(de)(de)(de)HSP的(de)(de)(de)(de)種子(seed)。字(zi)(zi)(zi)詞(ci)命(ming)中(zhong)沿(yan)著每個序列(lie)在兩(liang)個方(fang)(fang)向(xiang)上延(yan)伸，使得(de)累積比(bi)(bi)對(dui)(dui)得(de)分(fen)(fen)可(ke)以(yi)增加。當出現以(yi)下情(qing)況時，每個方(fang)(fang)向(xiang)上字(zi)(zi)(zi)詞(ci)命(ming)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)延(yan)伸停止：由(you)于一(yi)個或(huo)多個負分(fen)(fen)殘基比(bi)(bi)對(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)累積使累積比(bi)(bi)對(dui)(dui)得(de)分(fen)(fen)變為(wei)(wei)零或(huo)以(yi)下；或(huo)到(dao)達任(ren)一(yi)序列(lie)的(de)(de)(de)(de)末端。BLAST算法參(can)數W、T和(he)(he)X決(jue)定了比(bi)(bi)對(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)靈敏(min)度(du)和(he)(he)速度(du)。BLAST程(cheng)序使用(yong)(yong)字(zi)(zi)(zi)詞(ci)長(chang)(chang)度(du)(W)為(wei)(wei)11、BLOSUM62評分(fen)(fen)矩陣(參(can)見Henikoff和(he)(he)Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比(bi)(bi)對(dui)(dui)(B)為(wei)(wei)50、期(qi)望值(E)為(wei)(wei)10、M＝5、N＝4以(yi)及(ji)兩(liang)條(tiao)鏈的(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)較作(zuo)為(wei)(wei)默(mo)認設置。

BLAST算法(fa)進行(xing)兩個序(xu)列(lie)之間相似性的統計分析；參見例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787。

本文(wen)中(zhong)的(de)(de)術語(yu)“抗(kang)原”(Ag)是(shi)指用(yong)于(yu)對免(mian)疫活(huo)性脊椎動物進行免(mian)疫以產(chan)生(sheng)識別該Ag的(de)(de)抗(kang)體(Ab)的(de)(de)實體。在(zai)本發明(ming)的(de)(de)上(shang)下文(wen)中(zhong)，合(he)適(shi)的(de)(de)抗(kang)原包(bao)(bao)括(kuo)人TFPI(1-161)和全長人TFPIα。本文(wen)中(zhong)，Ag的(de)(de)含義更(geng)加廣泛，并且通常意在(zai)包(bao)(bao)括(kuo)被Ab特異性識別的(de)(de)靶分子，因此包(bao)(bao)括(kuo)在(zai)用(yong)于(yu)產(chan)生(sheng)Ab的(de)(de)免(mian)疫過程或其它過程例如(ru)噬菌(jun)體展示(shi)中(zhong)使用(yong)的(de)(de)分子片段或模擬物。

如本文所用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)術語“表(biao)位”在(zai)“抗(kang)原(yuan)結(jie)合(he)多肽(tai)”如抗(kang)體(Ab)與其相應抗(kang)原(yuan)(Ag)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子(zi)相互作用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)背景下定(ding)義。通常，“表(biao)位”是指(zhi)在(zai)Ag上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、與Ab特異性結(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)或(huo)(huo)區(qu)域，即與Ab物理接(jie)觸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)或(huo)(huo)區(qu)域。物理接(jie)觸可采用針對Ab和Ag分子(zi)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)各種標準(zhun)(例如，距離截止值為如如如或(huo)(huo)溶(rong)(rong)劑可及(ji)性)來定(ding)義。蛋白(bai)質表(biao)位可包含Ag中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、直(zhi)接(jie)參與Ab結(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)(也稱為表(biao)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫顯性組分)以及(ji)其它(ta)不直(zhi)接(jie)參與結(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)，如被Ab有效(xiao)阻斷的(de)(de)(de)(de)(de)(de)Ag的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)，即在(zai)Ab的(de)(de)(de)(de)(de)(de)“溶(rong)(rong)劑排斥表(biao)面(solvent-excluded surface)”和/或(huo)(huo)“足跡”內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸殘(can)(can)基(ji)(ji)(ji)。

除非另(ling)(ling)有(you)說明，否(fou)則本文中的(de)(de)術(shu)語(yu)“表(biao)(biao)位(wei)”包括TFPI任何特(te)(te)定區域中的(de)(de)、特(te)(te)異性(xing)結合(he)本發明單(dan)特(te)(te)異性(xing)或(huo)雙(shuang)特(te)(te)異性(xing)TFPI抗體或(huo)另(ling)(ling)一種TFPI特(te)(te)異性(xing)藥劑(ji)的(de)(de)兩(liang)種類(lei)型(xing)的(de)(de)結合(he)區。TFPI可包含許多不(bu)同的(de)(de)表(biao)(biao)位(wei)，其(qi)可包括但不(bu)限(xian)于(yu)(1)線性(xing)肽表(biao)(biao)位(wei)；(2)由(you)在(zai)成(cheng)熟TFPI構(gou)象中彼(bi)此靠(kao)近的(de)(de)一個或(huo)多個非連續(xu)氨(an)基酸(suan)組成(cheng)的(de)(de)構(gou)象表(biao)(biao)位(wei)；以及(3)全部(bu)或(huo)部(bu)分由(you)共價連接(jie)至TFPI的(de)(de)分子結構(gou)如碳水化(hua)合(he)物基團組成(cheng)的(de)(de)翻譯后表(biao)(biao)位(wei)。

可采用(yong)多種實驗(yan)和計算(suan)表(biao)(biao)位作圖方(fang)法(fa)(fa)在不同(tong)的(de)(de)(de)詳細度水平上描(miao)述(shu)和表(biao)(biao)征給(gei)定(ding)(ding)(ding)抗體(Ab)/抗原(Ag)對(dui)(dui)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)位。該實驗(yan)方(fang)法(fa)(fa)包括突變、X射線晶體學、核磁共振(NMR)譜(pu)法(fa)(fa)、氫氘交換質譜(pu)法(fa)(fa)(HX-MS)以及各種競(jing)爭結合方(fang)法(fa)(fa)；本領域已知的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)。由于每一種方(fang)法(fa)(fa)均依賴于獨特的(de)(de)(de)原理，因(yin)此對(dui)(dui)表(biao)(biao)位的(de)(de)(de)描(miao)述(shu)與(yu)確定(ding)(ding)(ding)表(biao)(biao)位的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)緊密(mi)相關(guan)。因(yin)此，根據所采用(yong)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)位作圖方(fang)法(fa)(fa)，給(gei)定(ding)(ding)(ding)Ab/Ag對(dui)(dui)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)位可有不同(tong)地描(miao)述(shu)。

在(zai)(zai)其(qi)最詳(xiang)細的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)，針對Ag與(yu)(yu)Ab之(zhi)間(jian)相(xiang)互(hu)作用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表位(wei)可(ke)通(tong)過(guo)限(xian)定(ding)存在(zai)(zai)于Ag-Ab相(xiang)互(hu)作用中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)子接(jie)觸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)間(jian)坐標(biao)(biao)，以及(ji)關于其(qi)對結合熱力學的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)對貢獻的(de)(de)(de)(de)(de)(de)信息來(lai)(lai)描述。在(zai)(zai)詳(xiang)細度較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)，表位(wei)可(ke)通(tong)過(guo)限(xian)定(ding)Ag與(yu)(yu)Ab之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)子接(jie)觸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)間(jian)坐標(biao)(biao)來(lai)(lai)表征。在(zai)(zai)詳(xiang)細度更(geng)低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)，表位(wei)可(ke)通(tong)過(guo)其(qi)包含的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基酸殘基來(lai)(lai)表征，該氨(an)(an)基酸殘基根據特(te)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)準，如在(zai)(zai)Ab：Ag復(fu)合物中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)子之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)距離(li)或原(yuan)子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶劑可(ke)及(ji)性(xing)來(lai)(lai)定(ding)義(yi)。在(zai)(zai)詳(xiang)細度進(jin)一步更(geng)低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)平(ping)(ping)上(shang)，表位(wei)可(ke)通(tong)過(guo)功能，例如通(tong)過(guo)與(yu)(yu)其(qi)它Ab的(de)(de)(de)(de)(de)(de)競爭結合來(lai)(lai)表征。表位(wei)也可(ke)以更(geng)泛泛地(di)定(ding)義(yi)為包含這(zhe)樣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基酸殘基，另一種氨(an)(an)基酸對該氨(an)(an)基酸殘基的(de)(de)(de)(de)(de)(de)置(zhi)換將會改變(bian)Ab與(yu)(yu)Ag之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)作用特(te)征。

在通過Ab例(li)如Fab片(pian)段(duan)與其Ag之間(jian)復合(he)物(wu)的(de)空(kong)間(jian)坐標限定的(de)X-射線衍生晶體(ti)(ti)結(jie)構的(de)語境(jing)中，除非另有說明或與上下文(wen)矛(mao)盾，否則術語表(biao)位(wei)在此被具體(ti)(ti)定義為(wei)在距Ab中的(de)重原(yuan)(yuan)子的(de)距離內具有重原(yuan)(yuan)子(即，非氫(qing)原(yuan)(yuan)子)的(de)TFPI殘(can)基(ji)。

根據所使(shi)用(yong)的表(biao)位作圖方法，在(zai)不同的詳細(xi)(xi)度水平上(shang)獲(huo)得對表(biao)位的描述(shu)和定義，基于這(zhe)一事實(shi)，可以在(zai)不同的詳細(xi)(xi)度水平上(shang)類似(si)地進行在(zai)相同Ag上(shang)針對不同Ab的表(biao)位比較。

如果(guo)在氨基(ji)酸(suan)水平上(shang)描述的(de)，例如由(you)X射線結(jie)構(gou)確定的(de)表位含有(you)相(xiang)同(tong)的(de)一(yi)組氨基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)，則(ze)這些(xie)表位被(bei)稱(cheng)(cheng)為(wei)(wei)(wei)是相(xiang)同(tong)的(de)。如果(guo)表位共有(you)至少(shao)一(yi)個氨基(ji)酸(suan)，則(ze)這些(xie)表位被(bei)稱(cheng)(cheng)為(wei)(wei)(wei)是重疊的(de)。如果(guo)表位沒有(you)共有(you)氨基(ji)酸(suan)殘(can)基(ji)，則(ze)這些(xie)表位被(bei)稱(cheng)(cheng)為(wei)(wei)(wei)是不同(tong)的(de)(獨特的(de))。

術語“互補位”的定(ding)義(yi)通過反(fan)轉視角，來源于以上(shang)對“表位”的定(ding)義(yi)。因(yin)此，術語“互補位”是指(zhi)在Ab上(shang)的、與(yu)Ag特異性結合的區(qu)(qu)或區(qu)(qu)域，即(ji)與(yu)Ag物理接觸(chu)的區(qu)(qu)或區(qu)(qu)域。

在(zai)通(tong)過Ab如Fab片段與其(qi)Ag之間復合(he)物的空間坐標(biao)限(xian)定的X-射線(xian)衍生晶體(ti)結(jie)構(gou)的語(yu)境中，除非另有說明(ming)或與上下文矛盾，否則術語(yu)互補位在(zai)此被具體(ti)定義為其(qi)特征在(zai)于在(zai)距(ju)TFPI中的重(zhong)原子(zi)的距(ju)離內(nei)具有重(zhong)原子(zi)(即，非氫(qing)原子(zi))的Ag殘(can)基(ji)。

給定(ding)(ding)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(Ab)/抗(kang)原(Ag)對(dui)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位和互(hu)(hu)補位可(ke)(ke)通過(guo)(guo)常(chang)規方法來(lai)鑒定(ding)(ding)。例(li)如，表(biao)位的(de)(de)(de)(de)通常(chang)位置(zhi)可(ke)(ke)通過(guo)(guo)評估抗(kang)體(ti)(ti)(ti)與(yu)不同片段或(huo)變異(yi)TFPI多肽結合的(de)(de)(de)(de)能力來(lai)確定(ding)(ding)。在TFPI內的(de)(de)(de)(de)、與(yu)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(表(biao)位)接觸的(de)(de)(de)(de)具體(ti)(ti)(ti)氨基酸(suan)(suan)和在抗(kang)體(ti)(ti)(ti)中的(de)(de)(de)(de)、與(yu)TFPI(互(hu)(hu)補位)接觸的(de)(de)(de)(de)具體(ti)(ti)(ti)氨基酸(suan)(suan)也可(ke)(ke)使用常(chang)規方法來(lai)確定(ding)(ding)。例(li)如，抗(kang)體(ti)(ti)(ti)和靶分子(zi)可(ke)(ke)以組合，并且(qie)可(ke)(ke)以使Ab：Ag復合物結晶。可(ke)(ke)以確定(ding)(ding)該復合物的(de)(de)(de)(de)晶體(ti)(ti)(ti)結構，并用其鑒定(ding)(ding)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)與(yu)其靶標之間相互(hu)(hu)作用的(de)(de)(de)(de)特異(yi)性位點。

與相(xiang)同(tong)抗(kang)原結合的(de)抗(kang)體(ti)可就其同(tong)時與其共(gong)(gong)同(tong)抗(kang)原結合的(de)能力進行表征，并且可以經歷“競(jing)爭(zheng)結合”/“分箱(binning)”。在該語境(jing)下，術語“分箱”是指對與相(xiang)同(tong)抗(kang)原結合的(de)抗(kang)體(ti)進行分組的(de)方(fang)法。抗(kang)體(ti)的(de)“分箱”可以基于(yu)在以標(biao)準技(ji)術為(wei)基礎的(de)試驗中兩種(zhong)抗(kang)體(ti)與其共(gong)(gong)同(tong)抗(kang)原的(de)競(jing)爭(zheng)結合，該標(biao)準技(ji)術例如是表面(mian)等離子體(ti)共(gong)(gong)振(SPR)、ELISA或流式細胞術。

使用(yong)參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)確定抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)“箱(xiang)元(yuan)”。如果第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)不(bu)(bu)能與(yu)參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)同時與(yu)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合，則(ze)稱(cheng)第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)與(yu)參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)屬于(yu)同一“箱(xiang)元(yuan)”。在這(zhe)(zhe)種(zhong)情況(kuang)下(xia)，參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)和第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)競爭(zheng)性(xing)地結(jie)合抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)相同部分，因此(ci)被劃(hua)歸為“競爭(zheng)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)”。如果第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)能夠與(yu)參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)同時與(yu)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)結(jie)合，則(ze)稱(cheng)第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)屬于(yu)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)“箱(xiang)元(yuan)”。在這(zhe)(zhe)種(zhong)情況(kuang)下(xia)，參(can)考(kao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)和第(di)二抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)不(bu)(bu)會競爭(zheng)性(xing)地結(jie)合抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)相同部分，因此(ci)被劃(hua)歸為“非競爭(zheng)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)”。

抗體(ti)“分箱”不提供關于(yu)表(biao)位的(de)(de)(de)(de)直(zhi)接(jie)信息(xi)。競爭抗體(ti)，即(ji)屬于(yu)同(tong)一“箱元”的(de)(de)(de)(de)抗體(ti)，可具有相同(tong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位、重疊的(de)(de)(de)(de)表(biao)位或甚至不同(tong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位。如果與其在抗原(yuan)上的(de)(de)(de)(de)表(biao)位結合的(de)(de)(de)(de)參考(kao)抗體(ti)占據(ju)了(le)第(di)二(er)抗體(ti)與其在抗原(yuan)上的(de)(de)(de)(de)表(biao)位接(jie)觸所需的(de)(de)(de)(de)空(kong)間(“位阻”)，則(ze)是后一種(zhong)情況。非競爭抗體(ti)通(tong)常具有不同(tong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)位。

術語“結合親和力”在(zai)(zai)本(ben)文中(zhong)用(yong)(yong)作兩種(zhong)分子(例如抗體或其片段和抗原)之(zhi)間(jian)的(de)非共價相互(hu)作用(yong)(yong)的(de)強度的(de)度量。術語“結合親和力”在(zai)(zai)本(ben)文中(zhong)用(yong)(yong)于描述單(dan)價和雙價相互(hu)作用(yong)(yong)(內在(zai)(zai)活性)兩者。

通過測定平衡解離常數(K_D)，可以定量兩種分子(例如抗體或其片段和抗原)之間通過單價相互作用的結合親和力。反過來，通過測量復合物形成和解離的動力學，例如通過SPR方法，可以測定K_D。與單價復合物的結合和解離相對應的速率常數分別被稱為結合速率常數k_a(或k_結合)和解離速率常數k_d(或k_解離)。通過方程式K_D＝k_d/k_a，將K_D與k_a和k_d相關聯。

按照上面的定義，通過比較單個抗體/抗原復合物的K_D值，可以比較與不同分子相互作用(yong)有關的(de)結合親和力，例如比較不同抗體對給定抗原的(de)結合親和力。

根據本發明的抗體可以能夠與另一種分子如天然存在的配體或受體或另一種抗體競爭結合TFPI，從而影響與這些相互作用相關的功能。抗體與天然配體/受體競爭的能力可以通過測量對TFPI抑制的表觀K_I的影響的各種活性測定來評估。然后可以由表觀K_I值推斷K_D值。一般來說，抗體對于靶標(TFPI)的感興趣的K_D值將為其它TFPI配體的K_D的1/2，優選1/5，更優選1/10。更優選地，K_D將為(wei)1/50，如(ru)1/100或1/200；甚至更(geng)優選1/500，如(ru)1/1000或1/10,000。

可以(yi)通(tong)(tong)過(guo)眾所周知的(de)(de)方法直(zhi)接測定該(gai)解離(li)常數的(de)(de)值。用來(lai)評價(jia)諸如(ru)(ru)抗體(ti)等配體(ti)與靶標的(de)(de)結(jie)合(he)(he)能(neng)力的(de)(de)標準試(shi)驗(yan)是本領域(yu)已(yi)知的(de)(de)，并(bing)且包(bao)括，例如(ru)(ru)，ELISA、Western印(yin)跡法、RIA、等溫滴(di)定量熱法和(he)(he)流式細(xi)胞(bao)術分析。也可以(yi)通(tong)(tong)過(guo)本領域(yu)已(yi)知的(de)(de)標準試(shi)驗(yan)，如(ru)(ru)SPR，來(lai)評估抗體(ti)的(de)(de)結(jie)合(he)(he)動力學和(he)(he)結(jie)合(he)(he)親(qin)和(he)(he)力。

可以進行(xing)競爭(zheng)結(jie)合(he)試驗，其中將抗體(ti)(ti)與靶標的(de)結(jie)合(he)和該靶標的(de)另(ling)一種配體(ti)(ti)如另(ling)一種抗體(ti)(ti)對該靶標的(de)結(jie)合(he)進行(xing)比較。

如本文公開的(de)雙(shuang)特異性抗體可以以比其(qi)各自“臂”的(de)組合(he)(he)親(qin)和力更(geng)高的(de)親(qin)和力和/或親(qin)合(he)(he)力結合(he)(he)全長(chang)TFPI或TFPI(1-161)。

如(ru)本(ben)文公開的(de)(de)雙特異性抗體可以以比其結(jie)合(he)如(ru)本(ben)文公開的(de)(de)TFPI(1-96)、TFPI(1-76)、TFPI(26-76)、TFPI(77-161)、TFPI(97-147)和/或(huo)其它任何(he)TFPI片段更(geng)高(gao)的(de)(de)親和力和/或(huo)親合(he)力結(jie)合(he)全長TFPI。

如本文公開的雙特異性抗體對全長TFPI或TFPI(1-161)可具有1×10^-11M或更低，或1×10^-12M或更低，或1×10^-13M或更低，或1×10^-14M或更低，或1×10^-15M或更低的K_D。

本發明雙特異性抗體的任何“臂”對其靶標可具有1×10^-5M或更低，1×10^-6M或更低，1×10^-7M或更低，1×10^-8M或更低，或1×10^-9M或更低，或1×10^-10M或更低，1×10^-11M或更低，或1×10^-12M或更低，或1×10^-13M或更低，或1×10^-14M或更低，或1×10^-15M或更低的K_D。本發明抗體的K_D可(ke)以低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.8nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.7nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.6nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.5nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.4nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.3nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.2nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.1nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.05nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.025nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)低(di)于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.015nM，如(ru)(ru)(ru)(ru)(ru)介于(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)0.015nM與0nM之間。

在一個方面，如本文公開的兩個(全長)抗體或Fab片段的雙特異性綴合物包含TFPI(1-79)結合子(binder)和TFPI KPI-2結合子，其中TFPI(1-79)結合子的K_D為2×10^-9M或更低，3×10^-9M或更低，4×10^-9M或更低，5×10^-9M或更低，6×10^-9M或更低，7×10^-9M或更低，8×10^-9M或更低，9×10^-9M或更低，1×10^-8M或更低，2×10^-8M或更低，3×10^-8M或更低，4×10^-8M或更低，5×10^-8M或更低，6×10^-8M或更低，7×10^-8M或更低，8×10^-8M或更低，9×10^-8M或更低，1×10^-7M或更低，2×10^-7M或更低，3×10^-7M或更低，4×10^-7M或更低，5×10^-7M或更低，6×10^-7M或更低，7×10^-7M或更低，8×10^-7M或更低，9×10^-7M或更低，1×10^-6M或更低，2×10^-6M或更低，3×10^-6M或更低，4×10^-6M或更低，5×10^-6M或更低，6×10^-6M或更低，7×10^-6M或更低，8×10^-6M或更低，9×10^-6M或更低，1×10^-5M或更低，2×10^-5M或更低，3×10^-5M或更低，4×10^-5M或更低，5×10^-5M或更低，6×10^-5M或更低，7×10^-5M或更低，8×10^-5M或更低，9×10^-5M或更低。

在一個方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在5×10^-7M至1×10^-5M的范圍內。在一個這樣的方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在1×10^-7M至1×10^-5M的范圍內。在一個這樣的方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在1×10^-7M至1×10^-6M的范圍內。

在一個方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在5×10^-7M至1×10^-7M的范圍內。

在一個方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在1×10^-7M至5×10^-5M的范圍內。

在一個方面，TFPI(1-79)結合子是包(bao)含一個或多個置換的(de)mAb2F22、Fab 0295或Fab 0296的(de)變體。

在(zai)一個(ge)方面，KPI-2結(jie)合(he)子是(shi)包含一個(ge)或多個(ge)置換的(de)mAb 2021、mAb 0310、Fab 0088或Fab 0313的(de)變體。

在一個方面，如本文公開的兩個(全長)抗體或Fab片段的雙特異性綴合物包含TFPI(1-79)結合子和TFPI KPI-2結合子，其中KPI-2結合子的K_D為2×10^-9M或更低，3×10^-9M或更低，4×10^-9M或更低，5×10^-9M或更低，6×10^-9M或更低，7×10^-9M或更低，8×10^-9M或更低，9×10^-9M或更低，1×10^-8M或更低，2×10^-8M或更低，3×10^-8M或更低，4×10^-8M或更低，5×10^-8M或更低，6×10^-8M或更低，7×10^-8M或更低，8×10^-8M或更低，9×10^-8M或更低，1×10^-7M或更低，2×10^-7M或更低，3×10^-7M或更低，4×10^-7M或更低，5×10^-7M或更低，6×10^-7M或更低，7×10^-7M或更低，8×10^-7M或更低，9×10^-7M或更低，1×10^-6M或更低，2×10^-6M或更低，3×10^-6M或更低，4×10^-6M或更低，5×10^-6M或更低，6×10^-6M或更低，7×10^-6M或更低，8×10^-6M或更低，9×10^-6M或更低，1×10^-5M或更低，2×10^-5M或更低，3×10^-5M或更低，4×10^-5M或更低，5×10^-5M或更低，6×10^-5M或更低，7×10^-5M或更低，6×10^-5M或更低，5×10^-5M或更低，4×10^-5M或更低，3×10^-5M或更低，2×10^-5M或更低，1×10^-5M或更低。

在一個方面，KPI-2結合子的K_D在5×10^-7M至1×10^-5M的范圍內。在一個這樣的方面，KPI-2結合子的K_D在1×10^-7M至1×10^-5M的范圍內。在一個這樣的方面，KPI-2結合子的K_D在1×10^-7M至1×10^-6M的范圍內。

在一個方面，KPI-2結合子的K_D在5×10^-7M至1×10^-7M的范圍內。

在一個方面，KPI-2結合子的K_D在1×10^-7M至5×10^-5M的范圍內。

在一個方面，如本文公開的雙特異性抗體包含K_D在1×10^-9M至1×10^-6M范圍內的TFPI(1-79)結合子和K_D在1×10^-14M至1×10^-10M范圍內的KPI-2結合子。在一個這樣的方面，TFPI(1-79)結合子K_D在1×10^-8M至1×10^-6M的范圍內且KPI-2結合子K_D在1×10^-14M至1×10^-11M的范圍內。

在一個方面，如本文公開的雙特異性抗體包含K_D在1×10^-14M至1×10^-10M范圍內的TFPI(1-79)結合子和K_D在1×10^-12M至1×10^-11M范(fan)圍(wei)內的KPI-2結合子。

在一個方面，如本文公開的雙特異性抗體包含K_D在1×10^-12M至1×10^-10M范圍內的TFPI(1-79)結合子和K_D在1×10^-12M至1×10^-8M范圍內的KPI-2結合子。在一個這樣的方面，TFPI(1-79)結合子的K_D在1×10^-11M至5×10^-10M的范圍內且KPI-2結合子的K_D在1×10^-10M至1×10^-8M的范圍內。

在一個(ge)方面(mian)，TFPI(1-79)結合子(zi)是mAb 0336且KPI-2結合子(zi)是mAb 0310。

在(zai)一個方面(mian)，KPI-2結(jie)合(he)子(zi)是(shi)(shi)Fab 0088。在(zai)一個替代方面(mian)，KPI-2結(jie)合(he)子(zi)是(shi)(shi)Fab 0094。在(zai)另(ling)一替代方面(mian)，KPI-2結(jie)合(he)子(zi)是(shi)(shi)Fab 0313。

在一(yi)個方面，Fab 0094、Fab 0313、Fab 0094或Fab 0088與KPI-1結合子組合，該KPI-1結合子是(shi)包含一(yi)個或多個置換的Fab 0295的變(bian)體。

在一個方面，通(tong)過將(jiang)兩個分別與TFPI(1-79)和TFPI KPI-2結合的抗(kang)體片(pian)段組(zu)合成雙特異(yi)性抗(kang)體而獲得對凝(ning)血酶生成的協(xie)同效(xiao)應(ying)。

在一個(ge)(ge)方面，通(tong)過(guo)將兩個(ge)(ge)分(fen)別與TFPI(1-79)和TFPI KPI-2結合(he)的抗(kang)體片段組合(he)成雙特(te)異性Fab(BiFab)而(er)獲得(de)對凝血酶生成的協同效(xiao)應(ying)。

在(zai)(zai)一個方(fang)面，甚至(zhi)在(zai)(zai)雙(shuang)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體或Fab的(de)一個臂(bei)對其(qi)靶標的(de)親(qin)和力降低的(de)情況(kuang)下，也可以存在(zai)(zai)以上(shang)提到的(de)協同(tong)效應。

在一個方面，本(ben)發明的雙特異性抗(kang)體可與FXa、TF/FVIIa和/或TF/FVIIa/FXa競(jing)爭結合TFPI。

在(zai)另一個方(fang)面，本發(fa)明提供了包(bao)含本發(fa)明分子，如(ru)(ru)本文(wen)所述雙特異性(xing)抗體(ti)的(de)組合物(wu)和制劑(ji)。例如(ru)(ru)，本發(fa)明提供了包(bao)含與藥學上可接受的(de)載體(ti)一起(qi)配制的(de)一種(zhong)或多種(zhong)本發(fa)明雙特異性(xing)TFPI抗體(ti)的(de)藥物(wu)組合物(wu)。

相(xiang)應(ying)地(di)，本發明的(de)(de)一(yi)個(ge)目的(de)(de)在于提供一(yi)種(zhong)藥物(wu)(wu)(wu)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)，其(qi)包含以0.25mg/ml至250mg/ml的(de)(de)濃度存在的(de)(de)這樣(yang)的(de)(de)雙(shuang)特異(yi)性TFPI抗體，并(bing)且其(qi)中所(suo)述制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)具有2.0至10.0的(de)(de)pH。該制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)可以進一(yi)步包含緩沖體系(xi)、防腐劑(ji)(ji)(ji)、張度劑(ji)(ji)(ji)、螯合(he)(he)劑(ji)(ji)(ji)、穩(wen)(wen)定(ding)劑(ji)(ji)(ji)或表面活(huo)性劑(ji)(ji)(ji)及其(qi)各種(zhong)組(zu)合(he)(he)中的(de)(de)一(yi)種(zhong)或多種(zhong)。防腐劑(ji)(ji)(ji)、等滲劑(ji)(ji)(ji)、螯合(he)(he)劑(ji)(ji)(ji)、穩(wen)(wen)定(ding)劑(ji)(ji)(ji)和表面活(huo)性劑(ji)(ji)(ji)在藥物(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)中的(de)(de)使用(yong)是技術人員公知的(de)(de)。可參考(kao)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在一個(ge)實施方案中，所述藥(yao)物(wu)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)是水(shui)(shui)性(xing)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)。這樣的制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)一般是溶液(ye)(ye)(ye)或懸浮液(ye)(ye)(ye)，但也可以(yi)包括(kuo)膠(jiao)體、分(fen)散體、乳液(ye)(ye)(ye)和多相物(wu)質。術語“水(shui)(shui)性(xing)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)”被定義(yi)為包含(han)至(zhi)少(shao)(shao)50％w/w水(shui)(shui)的制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)。同(tong)樣，術語“水(shui)(shui)性(xing)溶液(ye)(ye)(ye)”被定義(yi)為包含(han)至(zhi)少(shao)(shao)50％w/w水(shui)(shui)的溶液(ye)(ye)(ye)，而術語“水(shui)(shui)性(xing)懸浮液(ye)(ye)(ye)”被定義(yi)為包含(han)至(zhi)少(shao)(shao)50％w/w水(shui)(shui)的懸浮液(ye)(ye)(ye)。

在(zai)另一個實施方案中，所述藥物制劑(ji)是(shi)冷凍干燥(zao)的制劑(ji)，在(zai)使用前醫師或(huo)患者向其中添加溶劑(ji)和/或(huo)稀釋劑(ji)。

在進一(yi)步的(de)方面，所(suo)述藥物(wu)制劑包(bao)含(han)這樣的(de)抗體的(de)水性溶(rong)液和緩(huan)沖液，其中該抗體以1mg/ml或以上的(de)濃度存在，并且其中所(suo)述制劑具(ju)有約2.0至(zhi)約10.0的(de)pH。

雙特(te)異性抗體或包(bao)含該抗體的藥物制劑可(ke)以用來治療具(ju)有凝(ning)血(xue)障礙(ai)的受試者。

如本(ben)文所用(yong)的，術語“受試者(zhe)”包括任何人類患者(zhe)，或非人類脊椎動物。

如本文所用(yong)的(de)(de)，術語“凝血(xue)障礙”是(shi)指增加(jia)的(de)(de)出血(xue)傾(qing)向，這(zhe)可由正常凝血(xue)級聯的(de)(de)任(ren)意促(cu)凝血(xue)組分的(de)(de)任(ren)何(he)定(ding)(ding)性或定(ding)(ding)量缺乏或纖(xian)維蛋白溶(rong)解的(de)(de)任(ren)何(he)上調引起。這(zhe)類凝血(xue)障礙可能(neng)是(shi)先天性的(de)(de)和/或獲得性的(de)(de)和/或醫源性的(de)(de)，并且由本領(ling)域技術人員確定(ding)(ding)。

先天(tian)性低(di)凝血(xue)障礙(hypocoagulopathies)的(de)(de)(de)非限制性實例為A型(xing)血(xue)友(you)(you)病(bing)、B型(xing)血(xue)友(you)(you)病(bing)、因(yin)(yin)子(zi)VII缺(que)乏(fa)、因(yin)(yin)子(zi)X缺(que)乏(fa)、因(yin)(yin)子(zi)XI缺(que)乏(fa)、馮(feng)威(wei)勒(le)布蘭德氏病(bing)和血(xue)小(xiao)板減少癥如(ru)Glanzmann氏血(xue)小(xiao)板機能不全(thombasthenia)和貝-索(suo)(Bernard-Soulier)綜合征(zheng)。所述A型(xing)或B型(xing)血(xue)友(you)(you)病(bing)可能是(shi)重度(du)(du)的(de)(de)(de)、中(zhong)(zhong)度(du)(du)的(de)(de)(de)或輕度(du)(du)的(de)(de)(de)。血(xue)友(you)(you)病(bing)的(de)(de)(de)臨床嚴(yan)重程(cheng)度(du)(du)根據血(xue)液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)FIX/FVIII功(gong)能單元的(de)(de)(de)濃度(du)(du)來確定，并被(bei)分類為輕度(du)(du)的(de)(de)(de)、中(zhong)(zhong)度(du)(du)的(de)(de)(de)或重度(du)(du)的(de)(de)(de)。重度(du)(du)血(xue)友(you)(you)病(bing)被(bei)定義為凝血(xue)因(yin)(yin)子(zi)水平＜0.01U/ml，對(dui)應于(yu)小(xiao)于(yu)正(zheng)常水平的(de)(de)(de)1％，而中(zhong)(zhong)度(du)(du)和輕度(du)(du)的(de)(de)(de)患(huan)者分別具(ju)有(you)1-5％和＞5％的(de)(de)(de)水平。具(ju)有(you)“抑制物”(即抗因(yin)(yin)子(zi)VIII的(de)(de)(de)同種(zhong)抗體)的(de)(de)(de)A型(xing)血(xue)友(you)(you)病(bing)和具(ju)有(you)“抑制物”(即抗因(yin)(yin)子(zi)IX的(de)(de)(de)同種(zhong)抗體)的(de)(de)(de)B型(xing)血(xue)友(you)(you)病(bing)是(shi)部分先天(tian)性和部分獲得性的(de)(de)(de)凝血(xue)障礙的(de)(de)(de)非限制性實例。

獲(huo)得性凝(ning)(ning)血(xue)(xue)障礙的(de)(de)非限(xian)制性實(shi)例(li)是由(you)維生素(su)K缺乏引(yin)起(qi)的(de)(de)絲(si)氨酸(suan)蛋(dan)白酶缺乏；這(zhe)樣的(de)(de)維生素(su)K缺乏可能由(you)維生素(su)K拮抗劑如(ru)華(hua)法(fa)林的(de)(de)施用而引(yin)起(qi)。獲(huo)得性凝(ning)(ning)血(xue)(xue)障礙也可能在大面(mian)積創傷后發生。在這(zhe)種(zhong)(zhong)也稱(cheng)為“血(xue)(xue)性惡性循(xun)環”的(de)(de)情(qing)況(kuang)下，其特征為血(xue)(xue)液(ye)稀釋(shi)(稀釋(shi)性血(xue)(xue)小板減(jian)少癥(zheng)和(he)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)因(yin)子(zi)的(de)(de)稀釋(shi))、低體溫、凝(ning)(ning)血(xue)(xue)因(yin)子(zi)的(de)(de)消耗(hao)和(he)代(dai)謝(xie)紊(wen)亂(酸(suan)中毒)。補液(ye)療法(fa)和(he)增加(jia)的(de)(de)纖(xian)維蛋(dan)白溶解可加(jia)劇這(zhe)種(zhong)(zhong)情(qing)況(kuang)。所述出血(xue)(xue)可能來自身體的(de)(de)任何部(bu)分(fen)。

醫(yi)源性(xing)(xing)凝(ning)血(xue)(xue)障礙(ai)的(de)一個(ge)非限(xian)制(zhi)性(xing)(xing)實(shi)(shi)例(li)是可能為了治療血(xue)(xue)栓栓塞(sai)性(xing)(xing)疾病而(er)開出(chu)的(de)抗凝(ning)血(xue)(xue)藥(yao)物如(ru)肝(gan)素、阿司匹林、華法林及其它血(xue)(xue)小(xiao)板聚集抑制(zhi)劑的(de)過高劑量。醫(yi)源性(xing)(xing)凝(ning)血(xue)(xue)障礙(ai)的(de)第二個(ge)非限(xian)制(zhi)性(xing)(xing)實(shi)(shi)例(li)是由過度的(de)和/或不當的(de)補液療法誘發(fa)的(de)凝(ning)血(xue)(xue)障礙(ai)，諸(zhu)如(ru)可能由輸血(xue)(xue)誘發(fa)的(de)凝(ning)血(xue)(xue)障礙(ai)。

在(zai)(zai)(zai)(zai)本發(fa)明的一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)A型或B型血(xue)(xue)(xue)友病有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)具有(you)(you)(you)獲(huo)得性(xing)抑(yi)制物的A型或B型血(xue)(xue)(xue)友病有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)血(xue)(xue)(xue)小板減少癥有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)馮威勒布(bu)蘭德(de)氏病有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)嚴重組織損傷有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)嚴重創傷有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)手術有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)出(chu)血(xue)(xue)(xue)性(xing)胃炎和(he)/或腸(chang)炎有(you)(you)(you)關(guan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)是(shi)血(xue)(xue)(xue)崩，諸如在(zai)(zai)(zai)(zai)胎盤早剝(bo)中(zhong)(zhong)(zhong)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)發(fa)生在(zai)(zai)(zai)(zai)機械性(xing)止血(xue)(xue)(xue)可(ke)能性(xing)受(shou)限的器官中(zhong)(zhong)(zhong)，諸如顱內(nei)、耳內(nei)或眼(yan)內(nei)。在(zai)(zai)(zai)(zai)另(ling)(ling)(ling)一(yi)(yi)個(ge)(ge)實(shi)施(shi)方(fang)(fang)(fang)(fang)案(an)中(zhong)(zhong)(zhong)，出(chu)血(xue)(xue)(xue)與(yu)(yu)抗凝治療有(you)(you)(you)關(guan)。

如(ru)本(ben)文所(suo)用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，術(shu)語“治療(liao)”是指對(dui)任何有需(xu)要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)類或(huo)其它脊椎動物受試者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥物療(liao)法。所(suo)述受試者(zhe)預期(qi)已經經歷了由執(zhi)業醫(yi)師或(huo)執(zhi)業獸醫(yi)進行的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體格檢(jian)查，該(gai)(gai)醫(yi)師或(huo)獸醫(yi)已經給出了初步或(huo)明確的(de)(de)(de)(de)(de)(de)診(zhen)斷，該(gai)(gai)診(zhen)斷指明所(suo)述特定治療(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)使用對(dui)所(suo)述人(ren)類或(huo)其它脊椎動物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)健康(kang)是有益的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。根據受試者(zhe)健康(kang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)現(xian)狀，所(suo)述治療(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)間安排(pai)和(he)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)隨個體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不同(tong)而(er)不同(tong)。因此(ci)，所(suo)述治療(liao)可(ke)以是預防性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、姑息性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、對(dui)癥(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)和(he)/或(huo)治愈(yu)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。就本(ben)發明而(er)言，預防性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、姑息性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)、對(dui)癥(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)和(he)/或(huo)治愈(yu)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)可(ke)代(dai)表本(ben)發明的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)獨的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方面。

本(ben)發明(ming)的(de)抗體(ti)(ti)可以腸胃外(wai)施(shi)用(yong)，如(ru)靜(jing)脈內，如(ru)肌肉內，如(ru)皮下施(shi)用(yong)。皮下施(shi)用(yong)是優選的(de)。或者，本(ben)發明(ming)的(de)抗體(ti)(ti)可通過非(fei)腸胃外(wai)途徑(jing)如(ru)經口或局部施(shi)用(yong)。本(ben)發明(ming)的(de)抗體(ti)(ti)可以預防性施(shi)用(yong)。本(ben)發明(ming)的(de)抗體(ti)(ti)可治療性地施(shi)用(yong)(根據需(xu)求)。

在一個實施方(fang)案中，本發明的雙特異性抗體用來在體外(wai)測定TFPIα水平。

以(yi)下是本發(fa)明的非限制性實(shi)施(shi)方案(an)：

實(shi)施方案1：一種能夠(gou)特(te)異(yi)性(xing)結合(he)人TFPI(SEQ ID NO：1)的位置1至161內的第(di)一表位和(he)第(di)二表位的雙特(te)異(yi)性(xing)抗體(ti)或BiFab。

實施方(fang)案2：根據實施方(fang)案1的雙特異(yi)性抗體，其(qi)中所(suo)述(shu)第一表位(wei)(wei)在人TFPI的位(wei)(wei)置(zhi)1-76內且所(suo)述(shu)第二(er)表位(wei)(wei)在位(wei)(wei)置(zhi)77-161內。

實(shi)施(shi)方案3：根據實(shi)施(shi)方案1的雙特異性抗體，其(qi)中所述(shu)第(di)一(yi)表位(wei)(wei)在人TFPI的位(wei)(wei)置1-96內且所述(shu)第(di)二(er)表位(wei)(wei)在位(wei)(wei)置97-161內。

實(shi)施(shi)方(fang)案4：根據(ju)實(shi)施(shi)方(fang)案2-3中任一項(xiang)的雙特異性抗體，其中所(suo)述第一表位在人TFPI的Kunitz型(xing)抑制劑1結構域(殘基(ji)26-76)內。

實(shi)施方案5：根(gen)據實(shi)施方案2-3中(zhong)任一項(xiang)的雙特異(yi)性抗體，其中(zhong)所述第二(er)表(biao)位在人TFPI的Kunitz型抑制劑2結(jie)構域(殘基97-147)內。

實(shi)施方(fang)案6：根(gen)據實(shi)施方(fang)案5的(de)雙特(te)異(yi)性抗體(ti)，其中所述KPI-1表位(wei)包含SEQ ID NO：1的(de)氨基酸殘基Arg 41、Arg 65和/或(huo)Glu 67。

實施方案7：根據實施方案4或6中任一(yi)項的(de)雙(shuang)特異性(xing)抗體(ti)，其(qi)中所(suo)述KPI-1表位包含SEQ ID NO：1的(de)氨(an)基酸(suan)殘基Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75。

實施方(fang)案(an)8：根據實施方(fang)案(an)5的(de)雙特異性抗(kang)體，其(qi)中所述第二表(biao)位包含SEQ ID NO：1的(de)氨基酸殘(can)基Arg 107。

實(shi)施方案9：根據實(shi)施方案5的雙特異性(xing)抗體，其中所述第二表位(wei)包含SEQ ID NO：1的氨基酸殘基Glu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Arg 107、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126和(he)Leu 140。

實施方案(an)10：根據實施方案(an)1的雙特異性抗體，其中第一(yi)抗原識別位點的重(zhong)鏈(lian)包(bao)含：

●對應于SEQ ID NO：4的氨(an)(an)基酸(suan)(suan)31至35(SYGVH)、SEQ ID NO：6的氨(an)(an)基酸(suan)(suan)31至35(NYGVH)或SEQ ID NO：8的氨(an)(an)基酸(suan)(suan)31至35(GYGVH)的CDR1序列，其中這些氨(an)(an)基酸(suan)(suan)殘基中的一個可被不同的氨(an)(an)基酸(suan)(suan)殘基置(zhi)換；和/或

●對應(ying)于SEQ ID NO：4的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)50至65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、SEQ ID NO：6的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)50至65(VIWRGGSIDYNAAFMS)或(huo)SEQ ID NO：8的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)50至65(VIWRGGSIDYNAAFMS)的(de)(de)(de)CDR2序列，其中這(zhe)些氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)中的(de)(de)(de)一個(ge)、兩個(ge)或(huo)三個(ge)可被不(bu)同的(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)置換；和(he)/或(huo)

●對應于SEQ ID NO：4的(de)(de)氨基酸98至110(NSHGNYVGYAMDY)、SEQ ID NO：6的(de)(de)氨基酸98至110或(huo)(huo)SEQ ID NO：8的(de)(de)氨基酸98至110(NSHGNYVGYAMDY)的(de)(de)CDR3序(xu)列，其中這些氨基酸殘基中的(de)(de)一個(ge)或(huo)(huo)兩個(ge)可(ke)被不同的(de)(de)氨基酸置換；

并且其中所述第一抗原識別位點的(de)輕鏈包含：

●對應于SEQ ID NO：5的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸24至(zhi)34(KASENVGAAVA)、SEQ ID NO：7的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸24至(zhi)34(KASQSVGPAVA)或SEQ ID NO：9的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸24至(zhi)34(KASQNVGTAVA)的(de)(de)(de)CDR1序(xu)列(lie)，其中(zhong)這些(xie)氨(an)基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)一個、兩個或三個可被不(bu)同的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)置換；和/或

●對應(ying)于SEQ ID NO：5的(de)(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)50至56(SASNRYT)、SEQ ID NO：7的(de)(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)50至56或(huo)SEQ ID NO：9的(de)(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)50至56(SASNRYT)的(de)(de)CDR2序(xu)列，其中這些氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)中的(de)(de)一個可被(bei)不(bu)同的(de)(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)殘基(ji)置(zhi)換；和/或(huo)

●對(dui)應于SEQ ID NO：5的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)89至96(QQYTNYPT)、SEQ ID NO：7的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)89至96(QQYTSYPT)或SEQ ID NO：9的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)89至96(QQYTSYPT)的(de)(de)CDR3序列，其中(zhong)這些氨(an)(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)中(zhong)的(de)(de)一個(ge)可被(bei)不同的(de)(de)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)置換。

實施方(fang)案11：根據實施方(fang)案1的雙特(te)異性抗體，其中第一(yi)抗原識別位(wei)點的重鏈包含：

●對(dui)應于SEQ ID NO：4的氨(an)基酸31至35(SYGVH)、SEQ ID NO：6的氨(an)基酸31至35(NYGVH)或SEQ ID NO：8的氨(an)基酸31至35(GYGVH)的CDR1序列；和(he)

●對應于SEQ ID NO：4的氨基酸50至65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、SEQ ID NO：6的氨基酸50至65(VIWRGGSIDYNAAFMS)或SEQ ID NO：8的氨基酸50至65(VIWRGGSIDYNAAFMS)的CDR2序列；和(he)

●對應于(yu)SEQ ID NO：4的氨基(ji)酸(suan)98至(zhi)110、SEQ ID NO：6的氨基(ji)酸(suan)98至(zhi)110或SEQ ID NO：8的氨基(ji)酸(suan)98至(zhi)110(NSHGNYVGYAMDY)的CDR3序列(lie)；

并且其中所述第(di)一抗(kang)原(yuan)識別(bie)位點的輕鏈(lian)包(bao)含：

●對(dui)應于SEQ ID NO：5的氨基(ji)酸24至(zhi)(zhi)34(KASENVGAAVA)、SEQ ID NO：7的氨基(ji)酸24至(zhi)(zhi)34(KASQSVGPAVA)或SEQ ID NO：9的氨基(ji)酸24至(zhi)(zhi)34(KASQNVGTAVA)的CDR1序列(lie)；和(he)

●對應于SEQ ID NO：5的(de)氨基酸50至56、SEQ ID NO：7的(de)氨基酸50至56或SEQ ID NO：9的(de)氨基酸50至56(SASNRYT)的(de)CDR2序(xu)列；和

●對應于SEQ ID NO：5的(de)(de)氨基酸(suan)89至(zhi)96(QQYTNYPT)、SEQ ID NO：7的(de)(de)氨基酸(suan)89至(zhi)96(QQYTSYPT)或SEQ ID NO：9的(de)(de)氨基酸(suan)89至(zhi)96(QQYTSYPT)的(de)(de)CDR3序列。

實施方案(an)12：根(gen)據實施方案(an)1的雙(shuang)特異(yi)性抗(kang)體，其中第一抗(kang)原識別位點的重鏈包含：

●對應(ying)于SEQ ID NO：6的氨基酸(suan)31至35(NYGVH)的CDR1序列；和(he)

●對應于SEQ ID NO：6的(de)氨基(ji)酸50至(zhi)65(VIWRGGSIDYNAAFMS)的(de)CDR2序列；和

●對應于SEQ ID NO：6的(de)氨基酸(suan)98至110(NSHGNYVGYAMDY)的(de)CDR3序列；

并且其中所述(shu)第一抗原識別位點的輕鏈包含：

●對應于SEQ ID NO：7的氨(an)基酸(suan)24至34(KASQSVGPAVA)的CDR1序列；和

●對應于SEQ ID NO：7的氨基酸50至56(SASNRYT)的CDR2序列；和

●對(dui)應于SEQ ID NO：7的氨基酸89至96(QQYTSYPT)的CDR3序列(lie)。

實(shi)施方案13：根據實(shi)施方案1的雙(shuang)特異性抗體，其(qi)中第一(yi)抗原(yuan)識別位點的重鏈(lian)包含：

●對應于SEQ ID NO：10的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)31至(zhi)36(SDYAWN)的(de)CDR1序列，其中這些(xie)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(ji)中的(de)一個可(ke)被不(bu)同的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)殘基(ji)(ji)置換；和/或

●對(dui)應(ying)于SEQ ID NO：10的氨基酸51至66(YISYSGSTSYNPSLKS)的CDR2序列，其中(zhong)這些氨基酸中(zhong)的一個、兩個或三個可被不同的氨基酸殘基置換；和/或

●對應于SEQ ID NO：10的(de)(de)氨(an)(an)基酸99至(zhi)104(WAYDGP)的(de)(de)CDR3序列，其中這些氨(an)(an)基酸殘基中的(de)(de)一個可被不同的(de)(de)氨(an)(an)基酸置換(huan)，

并(bing)且其中所述(shu)第一抗(kang)原識(shi)別位點的(de)輕(qing)鏈(lian)包含(han)：

●對應于SEQ ID NO：11的氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)24至(zhi)33(RASSSVSHMH)的CDR1序列，其(qi)中這些氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)中的一個(ge)或(huo)兩(liang)個(ge)可被不同的氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)置換；和/或(huo)

●對應(ying)于SEQ ID NO：11的氨(an)(an)(an)基酸(suan)49至(zhi)55(ATSNLAS)的CDR2序列(lie)，其(qi)中這(zhe)些(xie)氨(an)(an)(an)基酸(suan)殘基中的一個可被(bei)不同的氨(an)(an)(an)基酸(suan)殘基置換；和/或

●對應于SEQ ID NO：11的氨基(ji)(ji)酸88至96(QQWSSNPFT)的CDR3序列，其中這(zhe)些(xie)氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)中的一個可被不(bu)同的氨基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)置換。

實施(shi)(shi)方案14：根據(ju)實施(shi)(shi)方案10-13中(zhong)任一項的雙特(te)異性抗體，其中(zhong)第二(er)抗原(yuan)識別(bie)位點(dian)的重鏈包含：

●對應于SEQ ID NO：19的氨基(ji)酸31至(zhi)35(NYAMS)的CDR1序(xu)列，其中這些氨基(ji)酸中的一個(ge)可被不同的氨基(ji)酸置換；和/或

●對應(ying)于(yu)SEQ ID NO：19的(de)(de)氨(an)基酸(suan)50至(zhi)66(TISRSGSYSYFPDSVQG)、SEQ ID NO：21的(de)(de)氨(an)基酸(suan)50至(zhi)66(TISRSGSYSYYPDSVKG)或(huo)SEQ ID NO：25的(de)(de)氨(an)基酸(suan)50至(zhi)66(TISRSGSYSYYADSVKG)的(de)(de)CDR2序列，其中這些氨(an)基酸(suan)中的(de)(de)一個、兩(liang)個或(huo)三個可被不(bu)同(tong)的(de)(de)氨(an)基酸(suan)置(zhi)換；和/或(huo)

●對應(ying)于SEQ ID NO：19的(de)氨基酸99至110(LGGYDEGDAMDS)的(de)CDR3序(xu)列，其(qi)中這些氨基酸中的(de)一個、兩個或三個可被不同的(de)氨基酸置換。

并且其中所述第二抗原(yuan)識別(bie)位點(dian)的(de)輕(qing)鏈包含：

●對應(ying)于(yu)SEQ ID NO：20的(de)氨基(ji)酸24至(zhi)39(KSSQSLLESDGKTYLN)的(de)CDR1序列，其中這些氨基(ji)酸中的(de)一個(ge)、兩(liang)個(ge)或三個(ge)可被不(bu)同的(de)氨基(ji)酸置換；和/或

●對應于(yu)SEQ ID NO：20的氨基酸55至61(LVSILDS)的CDR2序(xu)列(lie)，其中(zhong)這些氨基酸中(zhong)的一個或兩(liang)個可(ke)被不同的氨基酸置(zhi)換；和/或

●對應于SEQ ID NO：20的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)94至102(LQATHFPQT)的(de)CDR3序列，其中這些氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)中的(de)一(yi)個(ge)或兩個(ge)可(ke)被(bei)不同(tong)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)置換(huan)。

實(shi)施(shi)方案(an)15：根據(ju)實(shi)施(shi)方案(an)10-14中(zhong)任一項的(de)雙特異性抗體(ti)，其中(zhong)所述置換是保守置換。

實施方(fang)案16：根據前(qian)述實施方(fang)案中任一項的(de)雙特異(yi)性(xing)抗(kang)體，其選自全長(chang)雙特異(yi)性(xing)抗(kang)體和兩個(ge)抗(kang)原(yuan)結合片段的(de)化(hua)學綴合物。

實施(shi)方(fang)案(an)17：根據實施(shi)方(fang)案(an)16的雙(shuang)特異(yi)性抗體，其為兩個Fab片(pian)段的綴合物。

實施(shi)方案18：根(gen)據實施(shi)方案1-17中任一項(xiang)的雙特異性抗體(ti)(ti)，其為(wei)人源化抗體(ti)(ti)或人抗體(ti)(ti)。

實施方案19：根據實施方案1-18中任一項的雙特異性抗體，其對全長TFPI或TFPI(1-161)具有1×10^-11M或更低，或1×10^-12M或更低，或1×10^-13M或更低，或1×10^-14M或更低，或1×10^-15M或更低的結合親和力。

實施方案(an)20：一種藥物組合物，其包含根(gen)據實施方案(an)1至(zhi)18中(zhong)任一項的雙特異性抗體和(he)藥學上可接受(shou)的載體。

實(shi)施方案(an)(an)21：根據實(shi)施方案(an)(an)1至(zhi)19中任一項的雙特異性抗(kang)體或根據實(shi)施方案(an)(an)20的藥物(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)，其用作藥物(wu)(wu)(wu)。

實施(shi)方(fang)案(an)(an)22：根據實施(shi)方(fang)案(an)(an)1至19中任一(yi)項的雙特(te)異性(xing)抗體或根據實施(shi)方(fang)案(an)(an)20的藥物(wu)組合物(wu)，其(qi)用于治療凝血障礙。

實(shi)施方案23：用于根據實(shi)施方案22使用的雙特異性(xing)抗體，其(qi)中所述(shu)受試(shi)者具(ju)有先天性(xing)、獲得性(xing)和/或(huo)(huo)醫源性(xing)凝(ning)血(xue)障礙，如具(ju)有或(huo)(huo)不(bu)具(ju)有抑(yi)(yi)制物的A型(xing)血(xue)友(you)病(bing)，或(huo)(huo)具(ju)有或(huo)(huo)不(bu)具(ju)有抑(yi)(yi)制物的B型(xing)血(xue)友(you)病(bing)。

實施方案24：一(yi)種(zhong)治療具(ju)有凝血障礙的受試者(zhe)的方法，其包括向所述受試者(zhe)施用根(gen)據實施方案1至19中任一(yi)項的雙特(te)異性抗體。

實施方(fang)案25：根據實施方(fang)案1至19中(zhong)任一項的雙特異性抗體在制備用(yong)于治療凝血障礙的藥物中(zhong)的用(yong)途。

實(shi)施方案26：根據實(shi)施方案25的用途，其(qi)中所述凝血(xue)障礙是先天性、獲得性和/或(huo)醫(yi)源性凝血(xue)障礙。

實施(shi)方案27：根據實施(shi)方案26的(de)用(yong)途，其中所述凝血(xue)(xue)障礙是具有或不具有抑(yi)制物的(de)A型(xing)血(xue)(xue)友病，或具有或不具有抑(yi)制物的(de)B型(xing)血(xue)(xue)友病。

本(ben)發明(ming)通過(guo)(guo)以下實施(shi)(shi)例(li)進一步說明(ming)，這些實施(shi)(shi)例(li)不應理解(jie)為進一步限制。所有(you)附圖和整個本(ben)申請(qing)中(zhong)引用的所有(you)參考(kao)文獻、專(zhuan)利和公開的專(zhuan)利申請(qing)的內容均(jun)明(ming)確地通過(guo)(guo)引用并入(ru)本(ben)文。

實施例

實施例(li)1：免疫、融(rong)合(he)和篩(shai)選

用(yong)人(ren)(ren)TFPIα(SEQ ID NO：1)或(huo)TFPI(1-161)(SEQ ID NO：2)免(mian)(mian)疫RBF小鼠(shu)(shu)(shu)。向小鼠(shu)(shu)(shu)皮下注射：將(jiang)(jiang)20μg人(ren)(ren)TFPI與(yu)(yu)完(wan)全(quan)(quan)弗氏佐劑混合(he)以(yi)供第一次注射。對(dui)于隨后的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫，使用(yong)不完(wan)全(quan)(quan)弗氏佐劑與(yu)(yu)相同濃(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)抗(kang)原(yuan)。在(zai)最后免(mian)(mian)疫后10天，使用(yong)ELISA針(zhen)對(dui)人(ren)(ren)TFPI特異性抗(kang)體篩選來(lai)自(zi)小鼠(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)眼部(bu)血液。通過靜(jing)脈內注射用(yong)10μg人(ren)(ren)TFPIα或(huo)TFPI(1-161)加強免(mian)(mian)疫具有陽(yang)性血清滴度(du)(du)的(de)(de)(de)小鼠(shu)(shu)(shu)，并(bing)在(zai)三天后處死。在(zai)無菌條(tiao)件下取出(chu)脾臟，并(bing)將(jiang)(jiang)其(qi)分散成(cheng)單細(xi)胞(bao)懸浮液。借(jie)助于PEG方法或(huo)通過電融合(he)進行脾細(xi)胞(bao)與(yu)(yu)骨髓瘤(liu)(liu)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)融合(he)。通過有限(xian)稀釋(shi)將(jiang)(jiang)所(suo)得雜(za)交(jiao)瘤(liu)(liu)細(xi)胞(bao)克(ke)隆(long)至微量(liang)滴定板中。首先(xian)通過ELISA針(zhen)對(dui)能夠與(yu)(yu)全(quan)(quan)長(chang)(chang)TFPIα或(huo)TFPI(1-161)結(jie)(jie)(jie)合(he)的(de)(de)(de)抗(kang)體的(de)(de)(de)表(biao)達篩選來(lai)自(zi)單個(ge)雜(za)交(jiao)瘤(liu)(liu)的(de)(de)(de)上清液。為了鑒別產生對(dui)TFPI(1-79)為特異性的(de)(de)(de)抗(kang)體的(de)(de)(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)(liu)，針(zhen)對(dui)與(yu)(yu)TFPI KPI-2片段(duan)(由SEQ ID NO：1的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)酸殘(can)基(ji)97-147表(biao)示)的(de)(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)，反向篩選與(yu)(yu)全(quan)(quan)長(chang)(chang)TFPIα或(huo)TFPI(1-161)的(de)(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)呈陽(yang)性的(de)(de)(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)(liu)。分離(li)并(bing)擴增與(yu)(yu)TFPI(1-161)的(de)(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)呈陽(yang)性且(qie)與(yu)(yu)TFPI KPI-2片段(duan)的(de)(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)呈陰(yin)性的(de)(de)(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)(liu)，以(yi)產生抗(kang)體。

通(tong)過(guo)標準蛋白A親和色譜法從上清液中(zhong)(zhong)純化(hua)抗(kang)(kang)體，并用(yong)其確定與人TFPIα和TFPI(1-79)的(de)(de)結合和親和力，以及血漿中(zhong)(zhong)的(de)(de)TFPI中(zhong)(zhong)和活性(TGT試驗)。通(tong)過(guo)有(you)限(xian)稀釋對(dui)產生(sheng)感(gan)興趣抗(kang)(kang)體的(de)(de)雜(za)交瘤(即(ji)，對(dui)TFPI(1-79)為特異性的(de)(de)那些(xie))進行亞克隆(long)，并且針對(dui)來(lai)自亞克隆(long)雜(za)交瘤的(de)(de)物質驗證原始抗(kang)(kang)體譜。來(lai)自亞克隆(long)雜(za)交瘤的(de)(de)細胞用(yong)于(yu)分離RNA以及隨后的(de)(de)抗(kang)(kang)體克隆(long)和序(xu)列鑒定。

實施例2：小(xiao)鼠抗人TFPI(1-79)特異性(xing)抗體的克隆和測(ce)序

本實施例描述了TFPI抗體mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F56和mAb 1F91的鼠重鏈和輕鏈序列的克隆和測序。使用來自Qiagen的RNeasy-Mini試劑盒從雜交瘤細胞中提取總RNA，并將其用作cDNA合成的模板。使用來自Clontech的SMART^TM RACE cDNA擴增試劑盒在5′-RACE反應中合成cDNA。使用Phusion Hot Start聚合酶(Finnzymes)和作為正向引物包含在SMART^TM RACE試(shi)劑(ji)盒(he)(he)中的(de)(de)通用(yong)(yong)(yong)引物(wu)(wu)(wu)(wu)混合物(wu)(wu)(wu)(wu)(UPM)，通過PCR進(jin)行(xing)(xing)(xing)隨后的(de)(de)HC和(he)(he)(he)(he)LC序列的(de)(de)靶擴(kuo)(kuo)增。具(ju)有SEQ ID NO：12所(suo)示(shi)序列的(de)(de)反(fan)向引物(wu)(wu)(wu)(wu)用(yong)(yong)(yong)于(yu)HC(VH域)擴(kuo)(kuo)增，而(er)具(ju)有SEQ ID NO：13所(suo)示(shi)序列的(de)(de)反(fan)向引物(wu)(wu)(wu)(wu)用(yong)(yong)(yong)于(yu)LC擴(kuo)(kuo)增。將PCR產物(wu)(wu)(wu)(wu)通過凝膠(jiao)電泳進(jin)行(xing)(xing)(xing)分離，使用(yong)(yong)(yong)來自(zi)GE Healthcare Bio-Sciences的(de)(de)GFX PCR DNA&Gel Band Purification試(shi)劑(ji)盒(he)(he)進(jin)行(xing)(xing)(xing)提取，并使用(yong)(yong)(yong)Zero Blunt TOPO PCR Cloning試(shi)劑(ji)盒(he)(he)和(he)(he)(he)(he)化學感受(shou)態TOP10大腸桿菌(Life Technologies)克隆(long)以供(gong)測序。使用(yong)(yong)(yong)來自(zi)Applied Biosystems的(de)(de)AmpliTaq Gold Master Mix和(he)(he)(he)(he)M13uni/M13rev引物(wu)(wu)(wu)(wu)對(dui)(dui)選擇的(de)(de)菌落(luo)進(jin)行(xing)(xing)(xing)菌落(luo)PCR。使用(yong)(yong)(yong)ExoSAP-IT酶混合物(wu)(wu)(wu)(wu)(USB)進(jin)行(xing)(xing)(xing)菌落(luo)PCR清掃(clean-up)。在MWG Biotech，Martinsried Germany處使用(yong)(yong)(yong)M13uni(-21)/M13rev(-29)測序引物(wu)(wu)(wu)(wu)進(jin)行(xing)(xing)(xing)測序。使用(yong)(yong)(yong)Vector NTI Advance 11程序(Life Technologies)對(dui)(dui)序列進(jin)行(xing)(xing)(xing)分析(xi)和(he)(he)(he)(he)注(zhu)釋。所(suo)有試(shi)劑(ji)盒(he)(he)和(he)(he)(he)(he)試(shi)劑(ji)均按照制造商的(de)(de)說明書使用(yong)(yong)(yong)。

針對(dui)每個雜交瘤(liu)鑒(jian)定單個獨(du)特(te)的鼠κ型(xing)LC和(he)單個獨(du)特(te)的鼠HC，亞(ya)類IgG1：mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45和(he)mAb 1F91。mAb 1F56的LC和(he)HC序(xu)列顯示，該抗體在(zai)序(xu)列上與mAb 1F91相同。可(ke)變(bian)(bian)重鏈和(he)可(ke)變(bian)(bian)輕鏈序(xu)列(不包括前導肽序(xu)列)的氨基酸序(xu)列示于SEQ ID NO 4-11中。

抗體LC和(he)HC表達載體的(de)生成(cheng)

生成(cheng)了(le)基(ji)(ji)于(yu)CMV啟(qi)動(dong)子的表(biao)(biao)達載體(ti)(pTT載體(ti))，以(yi)供mAb 2F22的小(xiao)鼠-人嵌合形式的瞬(shun)時(shi)表(biao)(biao)達。pTT載體(ti)由(you)Yves Durocher(Durocher等人.Nucleic Acid Research，2002)開發用于(yu)瞬(shun)時(shi)蛋白(bai)質表(biao)(biao)達。除了(le)CMV啟(qi)動(dong)子外，基(ji)(ji)于(yu)pTT的載體(ti)還包含(han)pMB1起(qi)點、EBV起(qi)點和Amp抗性基(ji)(ji)因。

生成(cheng)了(le)嵌合(he)mAb 2F22輕鏈的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)載體，該嵌合(he)mAb 2F22輕鏈攜帶鼠(shu)2F22輕鏈可變(bian)區(qu)(qu)和(he)用于mAb 0294、Fab 0296和(he)Fab 0295表(biao)(biao)(biao)達(da)的(de)人κ恒定(ding)區(qu)(qu)(SEQ ID NO：15)。生成(cheng)了(le)嵌合(he)mAb 2F22重(zhong)鏈的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)載體，該嵌合(he)mAb 2F22重(zhong)鏈攜帶鼠(shu)2F22重(zhong)鏈可變(bian)區(qu)(qu)和(he)用于mAb 0294表(biao)(biao)(biao)達(da)的(de)全長人IgG4(S241P)恒定(ding)區(qu)(qu)(SEQ ID NO：17)或用于Fab 0296表(biao)(biao)(biao)達(da)(SEQ ID NO：14)或Fab 0295表(biao)(biao)(biao)達(da)(SEQ ID NO：18)的(de)截短的(de)人IgG4恒定(ding)區(qu)(qu)。

生成了(le)基于(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)LC表(biao)達載體(ti)，以用于(yu)嵌(qian)合mAb 2F22抗體(ti)和抗體(ti)片段的(de)(de)(de)(de)瞬時表(biao)達。首先，使用對N-末端和C-末端序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)具有(you)特(te)異性的(de)(de)(de)(de)引物(wu)(wu)，在2步反應(ying)(ying)中從(cong)原(yuan)始(shi)TOPO測序(xu)(xu)(xu)克(ke)(ke)隆PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)與mAb 2F22的(de)(de)(de)(de)VL域(yu)對應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)區域(yu)。通過2步重疊PCR將(jiang)原(yuan)始(shi)鼠信(xin)號(hao)肽交換為人CD33信(xin)號(hao)肽。第(di)一有(you)義(yi)(yi)引物(wu)(wu)攜帶CD33信(xin)號(hao)肽序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)C-末端部分(fen)，并且第(di)二有(you)義(yi)(yi)引物(wu)(wu)含有(you)用于(yu)克(ke)(ke)隆目的(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)HindIII限制位點(dian)、緊鄰(lin)ATG起始(shi)密碼(ma)子上游的(de)(de)(de)(de)Kozak序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(5′-GCCGCCACC-3′)和CD33信(xin)號(hao)肽序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)N-末端部分(fen)。反義(yi)(yi)引物(wu)(wu)在VL/CL過渡序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)中含有(you)框內BsiWI限制位點(dian)。將(jiang)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)(de)(de)片段克(ke)(ke)隆至含有(you)人κCL域(yu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)線性化的(de)(de)(de)(de)基于(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)載體(ti)中，隨后轉化至大腸桿菌(jun)中以供選擇。通過DNA測序(xu)(xu)(xu)來(lai)驗證最終構建(jian)體(ti)的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)。

生(sheng)成了基于(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HC表達載體(ti)(ti)，以用(yong)于(yu)嵌合(he)mAb 2F22和(he)Fab 2F22片(pian)(pian)段(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)瞬時(shi)表達。嵌合(he)mAb和(he)Fab片(pian)(pian)段(duan)被分(fen)(fen)別稱為(wei)(wei)mAb 0294、Fab 0296和(he)Fab 0295。首先，使用(yong)對(dui)N-末(mo)端和(he)C-末(mo)端序(xu)(xu)列(lie)(lie)具有(you)(you)特異性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物，在(zai)(zai)2步反應(ying)中(zhong)從原始(shi)TOPO測序(xu)(xu)克隆(long)PCR擴增與mAb 2F22的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)VH域(yu)對(dui)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)域(yu)。通過(guo)2步重疊PCR將(jiang)原始(shi)鼠信(xin)號肽交換為(wei)(wei)人(ren)CD33信(xin)號肽。第(di)一(yi)有(you)(you)義(yi)引(yin)物攜帶(dai)CD33信(xin)號肽序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)C-末(mo)端部(bu)分(fen)(fen)，并且第(di)二有(you)(you)義(yi)引(yin)物含有(you)(you)用(yong)于(yu)克隆(long)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HindIII限(xian)制(zhi)位點、緊鄰ATG起始(shi)密(mi)碼子(zi)上(shang)游(you)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Kozak序(xu)(xu)列(lie)(lie)(5′-GCCGCCACC-3′)和(he)CD33信(xin)號肽序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)N-末(mo)端部(bu)分(fen)(fen)。反義(yi)引(yin)物在(zai)(zai)VH/CH過(guo)渡(du)序(xu)(xu)列(lie)(lie)中(zhong)含有(you)(you)框內NheI限(xian)制(zhi)位點。為(wei)(wei)了生(sheng)成全長HC表達載體(ti)(ti)(mAb 0294的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HC)，對(dui)產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)VH域(yu)PCR片(pian)(pian)段(duan)進行限(xian)制(zhi)性消化(hua)，并將(jiang)其克隆(long)至含有(you)(you)人(ren)IgG4(S241P)恒定區(qu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)線(xian)性化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基于(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)載體(ti)(ti)中(zhong)。包含絲氨酸241向(xiang)脯(fu)氨酸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)IgG4鉸(jiao)鏈突(tu)變，以通過(guo)消除半抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)成來穩(wen)定IgG4抗(kang)體(ti)(ti)。突(tu)變的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鉸(jiao)鏈位置在(zai)(zai)根(gen)據Kabat編號時(shi)被稱為(wei)(wei)S241P，或者在(zai)(zai)根(gen)據EU索引(yin)編號時(shi)被稱為(wei)(wei)S228P。

為了生成(cheng)用(yong)于(yu)Fab 0296表達(da)的截短(duan)的HC表達(da)載體(ti)，對產生的VH域(yu)PCR片段(duan)進(jin)行限制(zhi)性消化，并將其克隆至含有截短(duan)人IgG4恒定區(qu)序列的線性化的基(ji)于(yu)pTT的載體(ti)中。基(ji)于(yu)IgG4的HC如Fab 0296HC的序列中所見在(zai)鉸鏈(lian)區(qu)中在(zai)人IgG4鉸鏈(lian)賴氨酸殘基(ji)之后截短(duan)(SEQ ID NO：14)。隨后將克隆反應轉化到大腸桿菌(jun)中以供選(xuan)擇。通過DNA測序來驗證最終構建體(ti)的序列。

為了(le)生(sheng)成用(yong)于Fab 0295表達(da)的(de)(de)(de)截(jie)短(duan)的(de)(de)(de)HC表達(da)載體(ti)，對(dui)產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)VH域PCR片段(duan)進行限(xian)制(zhi)性消化(hua)，并將其克隆至含有(you)第二截(jie)短(duan)人IgG4恒定區序列的(de)(de)(de)線性化(hua)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)于pTT的(de)(de)(de)載體(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)。用(yong)于Fab 0295的(de)(de)(de)基(ji)(ji)于IgG4的(de)(de)(de)HC如(ru)Fab 0295 HC的(de)(de)(de)序列中(zhong)(zhong)(zhong)所見(jian)在鉸鏈(lian)(lian)區中(zhong)(zhong)(zhong)在人IgG4鉸鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)第一(yi)半胱(guang)氨酸殘(can)基(ji)(ji)之后截(jie)短(duan)(SEQ ID NO：18)。隨后將克隆反(fan)應轉(zhuan)化(hua)到大腸(chang)桿菌(jun)中(zhong)(zhong)(zhong)以(yi)供選擇。通過DNA測序來驗證最終構建體(ti)的(de)(de)(de)序列。

mAb和Fab片段的表達和純化

通過基(ji)于(yu)(yu)pTT的(de)LC和(he)HC表(biao)達載體的(de)共轉染(ran)，在EXPI293F細胞(bao)(Life Technologies)的(de)懸(xuan)浮培(pei)養物中瞬時表(biao)達抗TFPI抗體和(he)Fab片段。以下程序描(miao)述(shu)了(le)用于(yu)(yu)適應(ying)懸(xuan)浮的(de)EXPI293F細胞(bao)的(de)通用轉染(ran)方案。

EXPI293F轉染

1)首先(xian)制備DNA和轉(zhuan)染試(shi)劑的單(dan)獨稀釋液。

a)每ml細胞培(pei)養物使用(yong)總(zong)計1μg的載(zai)體(ti)DNA(0.5μg LC載(zai)體(ti)和0.5μg HC載(zai)體(ti))。將DNA在(zai)Opti-MEM培(pei)養基(ji)(Gibco)中以50μl培(pei)養基(ji)/μg DNA稀(xi)釋，混合，并在(zai)室溫(wen)(23-25℃)下溫(wen)育5min。

b)以2.7μl/μg DNA的濃度使用Expifectamin^TM 293(Life Technologies)作為轉染試劑。將Expifectamin^TM溶液(ye)在Opti-MEM培(pei)養基(ji)(Gibco)中(zhong)稀釋18.5倍，混合，并在室(shi)溫(wen)(23-25℃)下溫(wen)育5min。

2)混合DNA和Expifectamin^TM 293稀釋液，并使其在室溫(23-25℃)下溫育(yu)10min。

3)將DNA-Expifectamin^TM 293混合物(wu)直(zhi)接添加至EXPI293F細胞培養物(wu)中。

a)在轉染時，EXPI293F培養物的細胞密度應為2.8-3.2×10⁶個細胞/ml。

4)將轉染的細胞培養物轉移至在36.5℃、8％CO₂和85-125rpm下的定軌搖床培養箱中。

5)轉染后18小時，添加5ul Expifectamin^TM 293Transfection Enhancer1/ml培養物和50μl Expifectamin^TM 293Transfection Enhancer2/ml培養物，并將培養物返回到在36.5℃、8％CO₂和85-125rpm下的(de)定軌搖床培(pei)養箱中(zhong)。

6)轉染(ran)后5天，通過離心收獲細胞培養上(shang)清液，然后通過0.22μm PES過濾器單元(Coming)過濾。

通用純化方案

根(gen)據制造商的(de)說(shuo)明(ming)書，使用來自GE Healthcare的(de)MabSelect SuRe樹脂，通過(guo)標準親和色(se)譜法純(chun)(chun)化mAb變體。將純(chun)(chun)化的(de)抗體用pH 7.2的(de)PBS緩沖液(ye)進行緩沖液(ye)交換。

使用由GE Healthcare開發的KappaSelect樹(shu)脂(zhi)，通(tong)過(guo)標準親(qin)和色(se)譜法純(chun)化Fab片(pian)段。將純(chun)化的Fab片(pian)段用pH 7.2的PBS緩沖液進行緩沖液交換(huan)。通(tong)過(guo)SEC-HPLC進行質量評價和濃度確定。

實施(shi)例3：抗體(ti)分箱(binning)

使(shi)用(yong)(yong)生(sheng)物(wu)(wu)層(ceng)干涉法(fa)(Fortebio Octet RED384儀器，PALL Life Sciences)測量TFPI抗(kang)體(ti)1F91、2F3、2F22、2F45、MBS532510(MyBioSource.com)、10R-T141A(Fitzgerald Industries International)與Bay 2A8-K95L之間對于與全長TFPIα結(jie)(jie)(jie)合(he)的(de)(de)(de)競爭(zheng)(zheng)。(Bay 2A8是(shi)于WO2010/017196中(zhong)公開(kai)的(de)(de)(de)2A8Fab的(de)(de)(de)人IgG4(S241P)抗(kang)體(ti)變體(ti)。Bay 2A8-K95L是(shi)在HC CDR3中(zhong)攜(xie)帶K95L置換(Kabat編號)的(de)(de)(de)Bay 2A8的(de)(de)(de)人IgG4(S241P)抗(kang)體(ti)變體(ti)(與WO2012/135671中(zhong)公開(kai)的(de)(de)(de)在“Fab B”中(zhong)發現的(de)(de)(de)相對于2A8的(de)(de)(de)置換相同(tong))。)使(shi)用(yong)(yong)1∶1.2mol mAb∶mol生(sheng)物(wu)(wu)素-試劑(Thermo Scientific，目錄號21335)的(de)(de)(de)比例或遵循制造商的(de)(de)(de)說明書，用(yong)(yong)生(sheng)物(wu)(wu)素在賴氨(an)酸(suan)殘基上(shang)(shang)隨機標(biao)記(ji)mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45和(he)Bay 2A8-K95L。在鏈(lian)霉(mei)親和(he)素Fortebio sensortips(PALL Life Sciences)上(shang)(shang)捕獲生(sheng)物(wu)(wu)素標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)抗(kang)體(ti)，然(ran)后(hou)結(jie)(jie)(jie)合(he)人TFPIα，隨后(hou)結(jie)(jie)(jie)合(he)mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510或10R-T141A。結(jie)(jie)(jie)果在表(biao)1中(zhong)示出(黑色表(biao)示mAb競爭(zheng)(zheng)結(jie)(jie)(jie)合(he)TFPI。灰色表(biao)示mAb不競爭(zheng)(zheng)結(jie)(jie)(jie)合(he)TFPI)。

這些數據顯示抗體落入(ru)3個不(bu)(bu)同的箱(xiang)元(yuan)(yuan)中，表(biao)明它們具有不(bu)(bu)同的結合表(biao)位(wei)。箱(xiang)元(yuan)(yuan)1：mAb 1F91、MBS532510和(he)10R-T141A。箱(xiang)元(yuan)(yuan)2：mAb 2F3、2F22和(he)2F45。箱(xiang)元(yuan)(yuan)3：Bay2A8K95L。

表1：指定(ding)的(de)TFPI抗體(ti)之(zhi)間對于與TFPI結(jie)合的(de)競爭

實施例4：與mAb 2F22的(de)(de)Fab片(pian)段復合的(de)(de)TFPI(1-79)的(de)(de)晶體(ti)結(jie)構

使用X射線晶體學，高(gao)分(fen)辨率地確定由(you)酸性N-末端區(qu)和Kunitz型蛋白酶(mei)抑制劑結(jie)構域1(KPI-1)組成的(de)(de)(de)人TFPI(1-79)的(de)(de)(de)N-末端部分(fen)(SEQ ID NO：16)與Fab片段(duan)——mAb 2F22的(de)(de)(de)Fab 0296(SEQ ID NO：14和15)復(fu)合(he)的(de)(de)(de)3D結(jie)構。結(jie)果表明(ming)，該抗體能夠結(jie)合(he)TFPI的(de)(de)(de)KPI-1，和前(qian)面N-末端的(de)(de)(de)一部分(fen)。所得的(de)(de)(de)人TFPI表位(wei)殘基包(bao)含Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75(SEQ ID NO：2)。

材料與方法

為了結晶學目的(de)，如實(shi)施例2所述生(sheng)成(cheng)了基于CMV啟動子的(de)表達(da)載(zai)體(pTT載(zai)體)，用(yong)(yong)于瞬時表達(da)與mAb 2F22抗體片段(duan)對應的(de)Fab片段(duan)，以用(yong)(yong)于結晶學。

如實施例(li)2所述，使mAb 2F22的Fab片(pian)段(duan)在EXPI293F細(xi)胞中以鼠-人嵌合形(xing)式Fab 0296(SEQ ID NO：14和15)表達，并通過使用(yong)KappaSelect樹脂的標準親和色(se)譜法純(chun)化。

將包括人TFPI的N-末端部分和另外的N-末端連接的GSSGSSG標簽的人TFPI KPI-1(SEQ ID NO：16)，以及由對應于SEQ ID NO：15的輕鏈和對應于SEQ ID NO：14的重鏈片段組成的Fab 0296(兩者均在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液(2升水中4片，GIBCO，目錄號18912-014，Invitrogen Corporation)中)，在TFPI物質稍微摩爾過量(1.1∶1)的情況下混合。然后利用分子量截止值為10,000Da的Amicon Ultra-4離心過濾器將復合物濃縮至約10.0mg/ml。采用來自TTP Lab Tech號：4150-05800的96孔TTP IQ板和每孔100μl沉淀劑溶液，通過坐滴技術(sitting drop-technique)使晶體生長。該沉淀劑溶液含有20％w/v PEG 3350、200mM甲酸鉀，并以3∶1的比例與蛋白質溶液混合。初始總液滴大小為200nl，數天后出現晶體。通過將1μl含有75％沉淀劑溶液和25％甘油的冷凍溶液混合物轉移至含有晶體的液滴中而制備用于低溫冷凍的晶體。使浸泡進行約2分鐘。然后將晶體捕獲，在液氮中快速冷凍，并在數據采集期間通過低溫N₂氣流保持在(zai)100K的(de)(de)溫度(du)下(xia)(xia)。在(zai)MAX-lab，Lund，Sweden處(chu)，在(zai)束(shu)線BL911-3下(xia)(xia)以分辨(bian)率(lv)采集晶體(ti)學數據。通過(guo)XDS軟件包[Kabsch，W.，J.Appl.Crystallogr.，(1993)，Vol.26，第(di)795-800頁]進行數據的(de)(de)空間(jian)群(qun)確(que)定(ding)、整合和(he)縮放。空間(jian)群(qun)被確(que)定(ding)為(wei)C2，并且同步加(jia)速器數據的(de)(de)晶胞(bao)參數被分別確(que)定(ding)為(wei)89.01Q、66.660、106.β角為(wei)111.18°。分辨(bian)率(lv)下(xia)(xia)的(de)(de)R-sym為(wei)8.4％，并且完整性為(wei)99.5％。在(zai)約的(de)(de)分辨(bian)率(lv)下(xia)(xia)，獨(du)特反射的(de)(de)強度(du)/西格(ge)瑪(強度(du))的(de)(de)平均值等(deng)于2.0。

采用(yong)蛋白質(zhi)數據庫(PDB)[Berman，H.M.等人(ren)(ren)，Nucleic Acids Res.，(2000)，Vol.28，第(di)(di)(di)235-242頁(ye)(ye)(ye)]中(zhong)(zhong)登錄(lu)編號為(wei)1NGZ[Yin，J.等人(ren)(ren)，Proc Natl Acad Sci U S A.2003年2月4日(ri)，(100)，Vol.100第(di)(di)(di)856-861頁(ye)(ye)(ye)]的(de)Fab分(fen)(fen)子(zi)的(de)坐標，使用(yong)分(fen)(fen)子(zi)置(zhi)(zhi)換(MR)方法(fa)(fa)進(jin)(jin)行(xing)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)確定(ding)。Fab分(fen)(fen)子(zi)被(bei)分(fen)(fen)成兩個結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)：可變域(yu)(yu)(yu)(yu)和恒定(ding)域(yu)(yu)(yu)(yu)，二(er)者均(jun)在(zai)(zai)MR計算中(zhong)(zhong)用(yong)作搜(sou)索模(mo)型(xing)(xing)。使用(yong)CCP4軟(ruan)件(jian)(jian)包(bao)(bao)(bao)CCP4[Collaborative Computational Project，N.，Acta crystallographica.Section D，Biological crystallography，(1994)，Vol.50，第(di)(di)(di)760-763頁(ye)(ye)(ye)]的(de)Molrep軟(ruan)件(jian)(jian)[Vagin，A.等人(ren)(ren)，J.Appl.Crystallogr.，(1997)，Vol.30，第(di)(di)(di)1022-1025頁(ye)(ye)(ye)]來尋(xun)找恒定(ding)和可變Fab域(yu)(yu)(yu)(yu)的(de)位置(zhi)(zhi)。在(zai)(zai)MR步驟(zou)中(zhong)(zhong)未找到(dao)(dao)KPI-1結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)，但差異電子(zi)密(mi)度(du)(du)圖(tu)(tu)顯(xian)示了(le)在(zai)(zai)該(gai)階段(duan)下KPI-1結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)分(fen)(fen)子(zi)的(de)近似(si)位置(zhi)(zhi)。通過(guo)CCP軟(ruan)件(jian)(jian)包(bao)(bao)(bao)的(de)DM軟(ruan)件(jian)(jian)進(jin)(jin)行(xing)的(de)電子(zi)密(mi)度(du)(du)改進(jin)(jin)，以(yi)及(ji)隨(sui)(sui)后使用(yong)ARP-wARP軟(ruan)件(jian)(jian)[Langer，G.等人(ren)(ren)，Nat Protoc，(2008)，Vol.3，第(di)(di)(di)1171-1179頁(ye)(ye)(ye)][Murshudov，G.N.等人(ren)(ren)，Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography，(2011)，Vol.67，第(di)(di)(di)355-367頁(ye)(ye)(ye)]進(jin)(jin)行(xing)的(de)自(zi)動模(mo)型(xing)(xing)構(gou)(gou)(gou)建(jian)和相改進(jin)(jin)，給出(chu)了(le)Fab 0296分(fen)(fen)子(zi)和KPI-1結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)以(yi)及(ji)在(zai)(zai)KPI-1結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)之前(qian)的(de)N-末端部(bu)分(fen)(fen)的(de)幾(ji)乎完(wan)整的(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)。對(dui)于(yu)TFPI(SEQ ID NO：2)，從15至77的(de)殘(can)基(ji)被(bei)包(bao)(bao)(bao)含在(zai)(zai)X射線模(mo)型(xing)(xing)中(zhong)(zhong)，該(gai)X射線模(mo)型(xing)(xing)除(chu)KPI-1結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)(yu)(yu)之外還(huan)包(bao)(bao)(bao)含KPI-1N-末端的(de)一些(xie)殘(can)基(ji)(殘(can)基(ji)26-76)。對(dui)于(yu)Fab 0296片段(duan)，觀察(cha)到(dao)(dao)輕鏈殘(can)基(ji)1至212和重(zhong)鏈殘(can)基(ji)1至221。進(jin)(jin)入使用(yong)Coot軟(ruan)件(jian)(jian)程序[Emsley，P.等人(ren)(ren)，Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.，(2004)，Vol.60，第(di)(di)(di)2126-2132頁(ye)(ye)(ye)]對(dui)電子(zi)密(mi)度(du)(du)圖(tu)(tu)的(de)計算機圖(tu)(tu)形檢查、模(mo)型(xing)(xing)校正和建(jian)立的(de)過(guo)程，及(ji)隨(sui)(sui)后使用(yong)CCP4軟(ruan)件(jian)(jian)包(bao)(bao)(bao)的(de)軟(ruan)件(jian)(jian)程序Refmac5[Murshudov，G.N.等人(ren)(ren)，Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography，(2011)，Vol.67，第(di)(di)(di)355-367頁(ye)(ye)(ye)]的(de)晶體學細(xi)化(hua)。循環該(gai)過(guo)程，直到(dao)(dao)無法(fa)(fa)對(dui)該(gai)模(mo)型(xing)(xing)進(jin)(jin)行(xing)進(jin)(jin)一步的(de)顯(xian)著(zhu)改進(jin)(jin)。在(zai)(zai)分(fen)(fen)辨(bian)率下的(de)所(suo)有數據的(de)最終(zhong)R-和R-free分(fen)(fen)別為(wei)0.192和0.220。

結果

通(tong)過CCP4程序(xu)套裝[Collaborative Computational Project，N.，Acta crystallographica.Section D，Biological crystallography，(1994)，Vol.50，第760-763頁(ye)(ye)]的(de)(de)軟件(jian)程序(xu)Areaimol[Lee，B.等(deng)人，J Mol Biol，(1971)，Vol.55，第379-400頁(ye)(ye)][Saff，E.B.等(deng)人，Math Intell，(1997)，Vo1.19，第5-11頁(ye)(ye)]計算在成對相互(hu)作用中排除的(de)(de)平(ping)均面積給出了(le)晶體結(jie)構(gou)的(de)(de)人TFPI片段(duan)/抗TFPI mAb 2F22Fab片段(duan)分(fen)子復合(he)物。

使(shi)用Fab 0296與TFPI片段(duan)分子之間的(de)截止距(ju)離，通過運行CCP4程序套裝[Bailey，S.，Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.，(1994)，Vol.50，第(di)760-763頁]的(de)Contacts軟件來(lai)鑒定TFPI KPI-1(包括(kuo)于晶(jing)(jing)體結(jie)構(gou)中(zhong)觀察到的(de)TFPI的(de)N-末(mo)端部分)(SEQ ID NO：2)與Fab 0296(SEQ ID NO：14和15)的(de)直(zhi)接(jie)接(jie)觸。來(lai)自可溶性TFPI片段(duan)/Fab 0296復合物(wu)晶(jing)(jing)體結(jie)構(gou)的(de)結(jie)果顯(xian)示在表2中(zhong)。

發現所得的(de)TFPI KPI-1(包括TFPI N-末(mo)端區、Fab 0296的(de)表(biao)(biao)位(wei))包含TFPI的(de)以下殘(can)(can)(can)基(ji)(采用(yong)SEQ ID NO：2的(de)序(xu)列(lie)編號)：Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75。從距離、電(dian)(dian)荷-電(dian)(dian)荷相互(hu)作用(yong)、氫(qing)鍵、極性和疏水相互(hu)作用(yong)以及低溶劑可(ke)及性評價，以下殘(can)(can)(can)基(ji)似乎是表(biao)(biao)位(wei)的(de)特別重要的(de)殘(can)(can)(can)基(ji)：Arg 41、Arg 65和Glu 67(SEQ ID NO.2)。

因此，mAb 2F22(由(you)Fab 0296表示)的(de)(de)(de)TFPI表位包(bao)含KPI-1結(jie)構域(yu)之(zhi)前的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)(包(bao)括短(duan)N-末端(duan)α-螺旋)，KPI-1結(jie)構域(yu)的(de)(de)(de)β-鏈(lian)1之(zhi)前的(de)(de)(de)環中的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)，和(he)β-鏈(lian)1起(qi)始(shi)端(duan)中的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)。其還包(bao)含β-鏈(lian)2末端(duan)中的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)，和(he)β-鏈(lian)2與KPI-1的(de)(de)(de)C-末端(duan)α-螺旋之(zhi)間的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)，以及KPI-1的(de)(de)(de)C-末端(duan)α-螺旋內(nei)的(de)(de)(de)殘(can)(can)基(ji)。

因(yin)此，結(jie)果顯示，Fab 0296與TFPI KPI-1及前面N-末端區(qu)的部分特異性結(jie)合，所以mAb 2F22也與它們特異性結(jie)合。

針對TFPI KPI-1的(de)(de)Fab 0296互補位(wei)包括重(H)鏈(SEQ ID NO：14，表2)的(de)(de)殘(can)基Val 2、Phe 27、Tyr 32、Trp 52、Arg 53、Gly 54、Gly 55、Ser 56、Ile 57、Asp 58、Tyr 59、Ala 61、Met 64、Lys 97、Ser 99、His 100、Asn 102、Tyr 103、Val 104、Gly 105和(he)Tyr 106，以及輕(L)鏈(SEQ ID NO：15，表2)的(de)(de)殘(can)基Pro 31、Ala 32、Tyr 49、Ser 50、Asn 53、Tyr 55、Thr 56、Tyr 91、Thr 92、Ser 93和(he)Tyr 94。

表2：來自TFPI(1-79)/Fab 0296復合物晶體結(jie)構的數據

結(jie)晶復合物的(de)(de)(de)TFPI KPI-1，K鏈(lian)(SEQ ID NO：2)與(yu)Fab 0296的(de)(de)(de)重鏈(lian)(H鏈(lian))(SEQ ID NO：14)和Fab 0296的(de)(de)(de)輕(qing)鏈(lian)(SEQ ID NO：15)的(de)(de)(de)相互作用。采用的(de)(de)(de)距離(li)截止(zhi)值。通(tong)過CCP4套件(jian)[Collaborative Computational Project，N.，Acta crystallographica.Section D，Biological crystallography，(1994)，Vol.50，第760-763頁(ye)]的(de)(de)(de)CONTACT計算機軟(ruan)件(jian)程(cheng)序鑒定接觸。在最(zui)后(hou)一列中，如(ru)通(tong)過CONTACT計算的(de)(de)(de)，“***”表示在此(ci)接觸(距離(li)＜)處(chu)存在較大的(de)(de)(de)氫鍵可(ke)能性，“*”表示較小的(de)(de)(de)可(ke)能性(距離(li)＞)。空(kong)白(bai)表示該程(cheng)序認為不存在氫鍵的(de)(de)(de)可(ke)能性。氫鍵在供體與(yu)接受體之間是特(te)異性的(de)(de)(de)，通(tong)常(chang)較強，并且(qie)容易鑒定。

這些結果顯示，抗-TFPI 0296與TFPI KPI-1和前面N-末端的部分特(te)異性(xing)結合。

實施例5：mAb 2021和mAb 2021變體的克隆和工程(cheng)化

本(ben)實施例描述了抗(kang)-TFPI抗(kang)體mAb 2021及其變體的克隆和工(gong)程化。

使用來自Qiagen的RNeasy-Mini試劑盒從M-hTFPI 4F36A1B2雜交瘤細胞中提取總RNA，并將其用作cDNA合成的模板。使用來自Clontech的SMART^TM RACE cDNA擴增試劑盒在5′-RACE反應中合成cDNA。使用Phusion Hot Start聚合酶(Finnzymes)和作為正向引物包含在SMART^TM RACE試劑盒中的(de)通用引物混合物(UPM)，通過PCR進行隨后的(de)HC和LC序列的(de)靶擴(kuo)增。對于HC(VH域)擴(kuo)增，使用具有以下(xia)序列的(de)反向引物：

5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3’(SEQ ID NO：12)

對于LC擴增，使用(yong)具(ju)有以下序(xu)列的反向引(yin)物：

5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’(SEQ ID NO：13)

將PCR產物(wu)(wu)通過(guo)凝膠電泳(yong)進(jin)行(xing)(xing)分(fen)離，使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)來自GE Healthcare Bio-Sciences的GFX PCR DNA&Gel Band Purification試劑盒進(jin)行(xing)(xing)提(ti)取，并使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)Zero Blunt TOPO PCR Cloning試劑盒和(he)化學(xue)感受態TOP10大腸桿菌(jun)(Invitrogen)克(ke)隆以供(gong)測(ce)(ce)序(xu)。使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)來自Applied Biosystems的AmpliTaq Gold Master Mix和(he)M13uni/M13rev引(yin)物(wu)(wu)在(zai)選擇的菌(jun)落上進(jin)行(xing)(xing)菌(jun)落PCR。使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)ExoSAP-IT酶(mei)混合物(wu)(wu)(USB)進(jin)行(xing)(xing)菌(jun)落PCR清(qing)除(clean-up)。在(zai)Eurofins MWG Operon，Germany處使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7測(ce)(ce)序(xu)引(yin)物(wu)(wu)進(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)序(xu)。使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)VectorNTI程序(xu)對序(xu)列(lie)進(jin)行(xing)(xing)分(fen)析并注(zhu)釋。所有試劑盒和(he)試劑均按照制造商的說明(ming)書使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)。

鑒定單個(ge)(ge)獨特的(de)鼠κ型LC和單個(ge)(ge)獨特的(de)鼠HC，亞類IgG1。

用于移(yi)植(zhi)的(de)抗(kang)-HzTFPI4F36A1B2的(de)表(biao)達載體的(de)生成

生成了(le)一系列基(ji)(ji)于CMV啟動子的表達(da)載(zai)體(ti)(ti)(ti)(pTT載(zai)體(ti)(ti)(ti))，用于在由Yves Durocher開發的基(ji)(ji)于HEK293-6E EBNA的表達(da)系統(tong)(Durocher等(deng)人，Nucleic Acid Research，2002)中瞬時表達(da)抗(kang)(kang)TFPI抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)/抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)片段。除了(le)CMV啟動子外，基(ji)(ji)于pTT的載(zai)體(ti)(ti)(ti)還(huan)包含(han)pMB1起點、EBV起點和Amp抗(kang)(kang)性(xing)基(ji)(ji)因(yin)。

基于克隆的(de)(de)鼠抗-TFPI4F36A1B2 VH和VL序(xu)列(lie)，通(tong)過在人(ren)種系(xi)序(xu)列(lie)上(shang)的(de)(de)CDR移(yi)植(zhi)來設計抗TFPI4F36的(de)(de)人(ren)源化形式。根據上(shang)述抗體的(de)(de)人(ren)源化設計，合(he)成(GENEART AG)了移(yi)植(zhi)的(de)(de)HzTFPI4F36 VH和VL區的(de)(de)DNA序(xu)列(lie)。獲得具有(you)基本最小CDR移(yi)植(zhi)并且沒(mei)有(you)其它回復(fu)突(tu)變(bian)的(de)(de)序(xu)列(lie)。構建(jian)體中包(bao)含相應的(de)(de)LC和HC種系(xi)前導肽序(xu)列(lie)，以及緊鄰ATG起始密碼(ma)子上(shang)游的(de)(de)Kozak序(xu)列(lie)(5′-GCCGCCACC-3′)。

生成基于(yu)pTT的表達載(zai)體(ti)(ti)以(yi)用于(yu)將移植的HzTFPI4F36抗(kang)體(ti)(ti)瞬時(shi)表達為人(ren)κ/IgG4(S241P)同種型(xing)。在IgG4鉸鏈區(qu)中(zhong)引入在位置241(根據Kabat編號，對應于(yu)根據EU編號系統的殘基228(Edelman G.M.等人(ren)，Proc.Natl.Acad.USA 63，78-85(1969))處的脯氨酸突變，以(yi)消除單體(ti)(ti)抗(kang)體(ti)(ti)片段的形(xing)成，即由一條(tiao)LC和一條(tiao)HC組成的“半抗(kang)體(ti)(ti)(half-antibodies)”的形(xing)成。

對(dui)于(yu)(yu)HC表(biao)達(da)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)，通(tong)(tong)(tong)過對(dui)GENEART克(ke)隆載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)限(xian)制酶消(xiao)化切(qie)下VH片(pian)段，并將(jiang)其克(ke)隆至含有人IgG4(S241P)CH域序列(lie)(lie)的(de)(de)線性(xing)(xing)化的(de)(de)基于(yu)(yu)pTT的(de)(de)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)中，隨后轉化至大(da)腸桿菌中以(yi)供選(xuan)擇(ze)。通(tong)(tong)(tong)過DNA測(ce)序來驗證最終構建體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)序列(lie)(lie)。對(dui)于(yu)(yu)LC表(biao)達(da)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)，通(tong)(tong)(tong)過對(dui)GENEART克(ke)隆載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)限(xian)制酶消(xiao)化切(qie)下VL片(pian)段，并將(jiang)其克(ke)隆至含有人κ CL域序列(lie)(lie)的(de)(de)線性(xing)(xing)化的(de)(de)基于(yu)(yu)pTT的(de)(de)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)中，隨后轉化至大(da)腸桿菌中以(yi)供選(xuan)擇(ze)。通(tong)(tong)(tong)過DNA測(ce)序來驗證最終構建體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)序列(lie)(lie)。

用來(lai)分離mAb 2021的定點突變

在移植的HzTFPI4F36的輕鏈(lian)(LC)和(he)重鏈(lian)(HC)中生成一系列人至小鼠反(fan)向突變(被稱為(wei)回復突變)。

進行定(ding)點突變(bian)以在移(yi)植的HzTFPI4F36 LC/HC構建體中的特定(ding)殘基處引(yin)(yin)入人至(zhi)小鼠反向(xiang)突變(bian)(以下稱(cheng)為回復突變(bian))，以優(you)化(hua)移(yi)植的構建體。通過兩種不(bu)同的方法引(yin)(yin)入突變(bian)：

1.使用來自Stratagene的定點(dian)(dian)或(huo)多位點(dian)(dian)定向突(tu)(tu)變試劑(ji)(ji)盒引入點(dian)(dian)突(tu)(tu)變和組合突(tu)(tu)變。試劑(ji)(ji)盒根(gen)據(ju)制造商(shang)的方案使用。

2.還(huan)使(shi)用標(biao)準的2步重(zhong)疊PCR方法(fa)引入點突變以及產生組合突變。

將用于移植的(de)(de)HzTFPI4F36的(de)(de)LC和HC表(biao)達質(zhi)粒(li)用作突變的(de)(de)模板。通過DNA測(ce)序來驗證所有最(zui)終構建體(ti)的(de)(de)序列。

mAb 2021 HC的(de)最終序(xu)列(lie)(lie)(lie)攜帶具有使得框架序(xu)列(lie)(lie)(lie)與原(yuan)(yuan)始(shi)小鼠FR2相(xiang)同(tong)的(de)4個回(hui)復(fu)突變(bian)的(de)FR2區，和3個CDR2突變(bian)體，即，與原(yuan)(yuan)始(shi)的(de)移植序(xu)列(lie)(lie)(lie)相(xiang)比，總共7個HC回(hui)復(fu)突變(bian)(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)(根(gen)據(ju)Kabat編號(hao))。LC序(xu)列(lie)(lie)(lie)為移植的(de)HzTFPI4F36 LC序(xu)列(lie)(lie)(lie)。根(gen)據(ju)Kabat限定(ding)CDR和框架。

最終(zhong)mAb 2021的VH和VL區(qu)的氨(an)基(ji)酸(suan)序列分別列為(wei)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。

為(wei)改善表達產量，將(jiang)HC和LC的(de)原始信號肽序(xu)列(lie)(人(ren)種系序(xu)列(lie))交換為(wei)人(ren)CD33信號肽(SP)。通過用含(han)(han)有Kozak元件(jian)(GCCGCCACC)、起始密(mi)碼(ma)子(zi)(zi)和CD33信號序(xu)列(lie)的(de)引物(wu)(有義(yi)引物(wu))以(yi)及(ji)含(han)(han)有終止密(mi)碼(ma)子(zi)(zi)和EcoRI限制(zhi)位(wei)點的(de)引物(wu)(反義(yi)引物(wu))對HC或LC片段進(jin)行標準PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)來交換信號肽序(xu)列(lie)。將(jiang)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)片段克隆(long)至線性化的(de)基于(yu)pTT的(de)載體中，并(bing)轉化至大(da)腸桿菌中以(yi)供選擇。通過DNA測序(xu)來驗證最終構建體的(de)序(xu)列(lie)。

mAb 2021的低親和力(li)變體的生成

在抗TFPI4F36A1B2的(de)(de)人源化從而獲得mAb 2021的(de)(de)過程中，鑒(jian)定(ding)了(le)許多低(di)親(qin)和(he)力(li)(li)變(bian)體(ti)(ti)。這(zhe)些(xie)變(bian)體(ti)(ti)通過定(ding)點(dian)突變(bian)如上(shang)所(suo)述生成。mAb 2007代表(biao)了(le)這(zhe)樣(yang)的(de)(de)低(di)親(qin)和(he)力(li)(li)變(bian)體(ti)(ti)。與移植的(de)(de)HzTFPI4F36的(de)(de)序(xu)列相比，mAb 2007在VH域中攜帶單個(ge)A60P回復突變(bian)(根據Kabat編(bian)號(hao))。該(gai)變(bian)體(ti)(ti)具有分別比mAb 2021低(di)至(zhi)少一(yi)個(ge)數量(liang)(liang)級(ji)的(de)(de)TFPI結合(he)親(qin)和(he)力(li)(li)。最初移植的(de)(de)HzTFPI4F36變(bian)體(ti)(ti)(mAb 2000)展現出比mAb 2021低(di)約三個(ge)數量(liang)(liang)級(ji)的(de)(de)TFPI結合(he)親(qin)和(he)力(li)(li)。

如實施(shi)例6所(suo)述生成(cheng)用于(yu)表(biao)達mAb 2021和mAb 2021變體的Fab片段的表(biao)達載體。

實施例6：雙(shuang)特異性分子的Fab組分

對于(yu)(yu)(yu)(yu)Fab-Fab化(hua)(hua)(hua)(hua)學綴(zhui)(zhui)合物，生(sheng)成了(le)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)表(biao)(biao)達(da)(da)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)HC的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)。mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)克(ke)(ke)隆(long)、人源(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)和(he)(he)表(biao)(biao)達(da)(da)于(yu)(yu)(yu)(yu)WO2010/072691中(zhong)(zhong)描述(shu)，其(qi)通(tong)(tong)過(guo)引用(yong)(yong)并入本(ben)文(wen)。如SEQ ID NO：23中(zhong)(zhong)所見，mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)IgG4的(de)(de)(de)(de)(de)HC在(zai)鉸(jiao)鏈(lian)區(qu)(qu)中(zhong)(zhong)在(zai)mAb 2021 HC的(de)(de)(de)(de)(de)人IgG4恒定(ding)區(qu)(qu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)一半(ban)胱氨酸(suan)殘(can)基(ji)(ji)之后截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)。該截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)留下(xia)可(ke)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)化(hua)(hua)(hua)(hua)學綴(zhui)(zhui)合的(de)(de)(de)(de)(de)C-末(mo)端(duan)半(ban)胱氨酸(suan)。通(tong)(tong)過(guo)使用(yong)(yong)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)標準限(xian)制酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)克(ke)(ke)隆(long)生(sheng)成截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie)，以(yi)將(jiang)(jiang)mAb 2021 HC的(de)(de)(de)(de)(de)VH片(pian)段引入至(zhi)含有(you)(you)(you)截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)人IgG4 CH域(yu)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)線性化(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)(de)工具(ju)箱(toolbox)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)中(zhong)(zhong)。通(tong)(tong)過(guo)DNA測(ce)序(xu)來驗(yan)(yan)證(zheng)所有(you)(you)(you)最(zui)終(zhong)構(gou)建體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie)。使用(yong)(yong)mAb 2021 LC載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)(he)上述(shu)截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)HC載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)(SEQ ID NO：24和(he)(he)SEQ ID NO：23)將(jiang)(jiang)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)Fab片(pian)段表(biao)(biao)達(da)(da)為(wei)Fab 0088。用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)Fab 0088的(de)(de)(de)(de)(de)LC表(biao)(biao)達(da)(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)與如上所述(shu)生(sheng)成的(de)(de)(de)(de)(de)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)LC表(biao)(biao)達(da)(da)相(xiang)同，即(ji)通(tong)(tong)過(guo)限(xian)制酶(mei)(mei)消化(hua)(hua)(hua)(hua)從GENEART克(ke)(ke)隆(long)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)上切下(xia)VL片(pian)段，并將(jiang)(jiang)其(qi)克(ke)(ke)隆(long)至(zhi)含有(you)(you)(you)人κ CL域(yu)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)線性化(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)(de)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)中(zhong)(zhong)。還生(sheng)成了(le)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)表(biao)(biao)達(da)(da)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)低(di)親(qin)和(he)(he)力變體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)重鏈(lian)表(biao)(biao)達(da)(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)。該mAb 2021變體(ti)(ti)(ti)(ti)源(yuan)自mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)人源(yuan)化(hua)(hua)(hua)(hua)，并且于(yu)(yu)(yu)(yu)WO2010/072691和(he)(he)實施(shi)例5中(zhong)(zhong)描述(shu)。為(wei)了(le)組(zu)裝(zhuang)表(biao)(biao)達(da)(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)，采用(yong)(yong)標準的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)限(xian)制酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)克(ke)(ke)隆(long)將(jiang)(jiang)與實施(shi)例5中(zhong)(zhong)描述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)mAb 2007和(he)(he)mAb 2000的(de)(de)(de)(de)(de)HC的(de)(de)(de)(de)(de)VH域(yu)相(xiang)對應的(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域(yu)克(ke)(ke)隆(long)至(zhi)含有(you)(you)(you)截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)人IgG4 CH域(yu)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)線性化(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)pTT的(de)(de)(de)(de)(de)工具(ju)箱載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)中(zhong)(zhong)。基(ji)(ji)于(yu)(yu)(yu)(yu)IgG4的(de)(de)(de)(de)(de)HC在(zai)IgG4鉸(jiao)鏈(lian)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)一個半(ban)胱氨酸(suan)之后截(jie)(jie)短(duan)(duan)(duan)，從而(er)留下(xia)可(ke)用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)(yu)化(hua)(hua)(hua)(hua)學綴(zhui)(zhui)合的(de)(de)(de)(de)(de)C-末(mo)端(duan)半(ban)胱氨酸(suan)。通(tong)(tong)過(guo)DNA測(ce)序(xu)來驗(yan)(yan)證(zheng)最(zui)終(zhong)構(gou)建體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie)。mAb 2007和(he)(he)mAb 2000的(de)(de)(de)(de)(de)低(di)親(qin)和(he)(he)力Fab片(pian)段分別(bie)表(biao)(biao)示為(wei)Fab 0094(SEQ ID NO：21和(he)(he)SEQ ID NO：22)和(he)(he)Fab 0313(SEQ ID NO：25和(he)(he)SEQ ID NO：26)。Fab 0094和(he)(he)Fab 0313攜帶與Fab 0088相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)LC。

實施例7a：1，16-雙(2，5-吡咯二(er)(er)酮-1-基)-4，13-二(er)(er)氮雜(za)-7，10-二(er)(er)氧(yang)雜(za)-3，14-二(er)(er)氧(yang)代十六烷的合成(cheng)

將3-(2，5-吡咯二(er)酮-1-基(ji))丙酸(suan)(3.0g，18mmol)溶(rong)(rong)于二(er)氯甲烷(20ml)中。將溶(rong)(rong)液添加至預洗滌的(de)固定的(de)二(er)環己基(ji)碳二(er)亞胺樹脂(Novabiochem，產品號8.55029.0025，批次：S5092229 036，2.3mmol/g，10g)中，總體積為100ml。將混合物攪拌(ban)30分(fen)鐘。

在(zai)60分鐘內將(jiang)(jiang)1，8-二氨基-3，6-二氧雜(za)辛烷(1.3g，8.9mmol)在(zai)二氯甲烷(50ml)中(zhong)(zhong)的(de)溶液逐滴添加到攪拌的(de)溶液中(zhong)(zhong)。將(jiang)(jiang)混合(he)物攪拌2h。將(jiang)(jiang)溶液過(guo)濾并真空(kong)濃(nong)縮至干。產量：3.4g淡棕(zong)色固體。

通過LCMS([M+H]⁺：451)和NMR(¹H和¹³C)表征產物。

將(jiang)一部分制備的物質在(zai)乙酸酐中加熱至90攝氏度(du)，持(chi)續3小時。將(jiang)溶液冷卻，與水混合，冷凍(dong)并凍(dong)干。

通過LCMS([M+Na]⁺：473)表征(zheng)產物(wu)。該物(wu)質用于以下兩(liang)個實施例中所述(shu)的綴合。

實施例7b：Fab 0088和Fab 0295與1，16-雙(shuang)(2，5-吡咯(ge)二酮-1-基)-4，13-二氮雜-7，10-二氧(yang)雜-3，14-二氧(yang)代十六(liu)烷綴合以得到(dao)BiFab 9041

將(jiang)(jiang)Fab分子(每種Fab 4mg)的(de)溶(rong)(rong)(rong)液在磷酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水(PBS)中(zhong)調節(jie)至2.5mg/ml(50微(wei)摩(mo)爾(er))。將(jiang)(jiang)溶(rong)(rong)(rong)解在PBS中(zhong)的(de)雙(磺酸苯基(ji))苯基(ji)膦(lin)(lin)二鉀二水合(he)物鹽(yan)(CAS：151888-20-9，Sigma-Aldrich)溶(rong)(rong)(rong)液添(tian)加(jia)至Fab在PBS中(zhong)的(de)溶(rong)(rong)(rong)液中(zhong)，直(zhi)至所得濃度為(wei)50微(wei)摩(mo)爾(er)Fab和200微(wei)摩(mo)爾(er)的(de)膦(lin)(lin)試劑(ji)。將(jiang)(jiang)溶(rong)(rong)(rong)液在環(huan)境溫度下溫育過夜(ye)。

使用(yong)Amicon Ultracel離心過濾器(MWCO 10kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)將Fab 0088用(yong)pH 5.0的15mM乙(yi)酸(suan)鈉緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)，1.0M NaCl進(jin)行緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)交(jiao)換(終(zhong)體積為1ml)。

使(shi)用Amicon Ultracel離心(xin)過濾器(MWCO 10kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)將Fab 0295用pH4.5的15mM乙酸(suan)鈉(na)緩(huan)沖液進行緩(huan)沖液交換(huan)。終體積：300微升。

將(jiang)1，16-雙(2，5-吡(bi)咯二(er)酮-1-基)-4，13-二(er)氮雜(za)-7，10-二(er)氧雜(za)-3，14-二(er)氧代十(shi)六(liu)烷(5mg)添加(jia)至還(huan)原的Fab蛋白質。將(jiang)所得混合物在(zai)室溫(wen)下溫(wen)育(yu)50分鐘。

將樣品加載(zai)到HiTrap SP HP柱(zhu)(1ml，在(zai)pH 4.5的15mM乙(yi)(yi)酸(suan)鈉(na)緩沖液中預(yu)處理，GE Healthcare Europe GmbH，DK-2605，Denmark)上。將固定的蛋白質(zhi)用(yong)pH 4.5的15mM乙(yi)(yi)酸(suan)鈉(na)緩沖液(15個柱(zhu)體(ti)積)洗滌(di)，并用(yong)pH 5.0的15mM乙(yi)(yi)酸(suan)鈉(na)緩沖液，1M NaCl洗脫。將兩種蛋白質(zhi)溶液混合(he)并使用(yong)Amicon Ultracel離心(xin)過濾器(MWCO 10kDa，MWCO 10kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)濃縮。終體(ti)積：100微(wei)升。

將(jiang)混合物在環(huan)境溫度(du)下溫育20小(xiao)時。將(jiang)溶液加(jia)載到已在pH7.3的10mM HEPES，150mM NaCl中預處理(li)的Superdex200 16/60柱(GE Healthcare Europe GmbH，DK-2605，Denmark)上。使用所述緩(huan)沖液洗脫(tuo)化合物BiFab 9041。將(jiang)所選級分(fen)合并(bing)，濃縮，并(bing)使用SDS-PAGE分(fen)析、SEC-MALS、LCMS和(he)Edman序(xu)列(lie)測定(ding)進(jin)行分(fen)析。

實(shi)施例7c：Fab 0313和Fab 0295與1，16-雙(shuang)(2，5-吡(bi)咯二酮-1-基)-4，13-二氮雜(za)-7，10-二氧雜(za)-3，14-二氧代(dai)十六烷綴合以得到BiFAab 9042

將(jiang)Fab分子(5mg Fab 0313和7mg Fab 0295)的(de)(de)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液在磷酸(suan)鹽(yan)緩沖鹽(yan)水(PBS)中(zhong)調(diao)節至2.5mg/ml(50微摩(mo)爾)。將(jiang)溶(rong)(rong)(rong)(rong)解(jie)在PBS中(zhong)的(de)(de)雙(磺酸(suan)苯基(ji))苯基(ji)膦二鉀(jia)二水合物鹽(yan)(CAS號：151888-20-9，Sigma-Aldrich)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液添(tian)加至Fab在PBS中(zhong)的(de)(de)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液中(zhong)，直(zhi)至所得濃度為50微摩(mo)爾Fab和200微摩(mo)爾的(de)(de)膦試劑。將(jiang)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液在環(huan)境溫度下溫育過夜。

使用(yong)Amicon Ultracel離心過(guo)濾器(qi)(MWCO 10 kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)將Fab 0313用(yong)pH 5.0的15mM乙酸(suan)鈉(na)緩(huan)沖液(ye)，1.0M NaCl進行緩(huan)沖液(ye)交換(終體積為1ml)。

使用(yong)Amicon Ultracel離心過濾器(qi)(MWCO 10kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)將Fab 0295用(yong)pH 4.5的15mM乙酸鈉(na)緩沖液進行(xing)緩沖液交換(huan)。終體積(ji)：300微(wei)升。

將(jiang)1，16-雙(2，5-吡(bi)咯二酮-1-基)-4，13-二氮雜-7，10-二氧雜-3，14-二氧代十六(liu)烷(5mg)添加(jia)至(zhi)還(huan)原的Fab蛋白質。將(jiang)所得混合物在室(shi)溫下溫育50分鐘。

將樣品加載(zai)到HiTrap SP HP柱(1ml，在pH 4.5的15mM乙(yi)酸(suan)(suan)鈉緩(huan)沖液中預處理(li)，GE Healthcare Europe GmbH，DK-2605，Denmark)上。將固定(ding)的蛋白質(zhi)用(yong)(yong)pH 4.5的15mM乙(yi)酸(suan)(suan)鈉緩(huan)沖液(15個(ge)柱體積)洗滌，并用(yong)(yong)pH 5.0的15mM乙(yi)酸(suan)(suan)鈉緩(huan)沖液，1M NaCl洗脫。

將兩種蛋(dan)白(bai)質溶液(ye)混合(he)，并使用Amicon Ultracel離心過濾器(qi)(MWCO 10kDa，MWCO 10kDa，Millipore A/S，Hellerup，Denmark)濃縮(suo)。終體積：100微升。

將(jiang)混合(he)物在環境溫(wen)(wen)度(du)下溫(wen)(wen)育20小時。將(jiang)溶(rong)液加載到已在pH 7.3的10mM HEPES，150mM NaCl中預(yu)處理的Superdex20016/60柱(zhu)(GE Healthcare Europe GmbH，DK-2605，Denmark)上。使用所(suo)述緩沖液洗脫BiFab 9042化合(he)物。將(jiang)所(suo)選級分合(he)并(bing)，濃縮(suo)，并(bing)使用SDS-PAGE分析、SEC-MALS和LCMS進行分析。

實施(shi)例(li)8：結(jie)合相互作(zuo)用分析

在通過表面等離子體共振實時測量分子相互作用的Biacore T200(GEHealthcare)上進行結合研究。實驗在25℃下進行，并且樣品在15℃下儲存在樣品室中。由Biacore報告的信號(RU，響應單位)與四個串聯流動池中各個傳感器芯片表面上的質量直接相關。根據制造商的說明書，將山羊抗Fabκ輕鏈抗體(Nordic Biosite)固定在CM4傳感器芯片的全部四個流動池上。通過將蛋白質稀釋至運行緩沖液(10mM Hepes 0.3M NaCl，5mM CaCl₂，0.05％表面活性劑P20，10mg/ml BSA，pH 7.4)中來進行純化的雙特異性分子的捕獲，并將其注射在流動池2、3或4上，從而在流動池1中產生僅固定有抗Fab抗體的參考表面。雙特異性分子為雙特異性mAb 0421(SEQ ID NO：27、28和15、29)或BiFab 9041(SEQ ID NO：15、18、23、24)。通過在所有流動池上注射分析物(抗原)來進行TFPI FL(SEQ ID NO：1)、TFPI(1-79)和TFPI KPI-2蛋白的結合，以允許進行與不同經捕獲的雙特異性分子的結合相對于與參考表面的結合的比較分析。TFPI(1-79)片段跨越TFPI的N-末端和KPI-1結構域，具有N-末端連接的GSSGSSG標簽(SEQ ID NO：16)。TFPI KPI-2片段跨越TFPI的KPI-2結構域，具有C-末端HIS₆標簽(SEQ ID NO：3)。將抗原連續稀釋至運行緩沖液中，以30μl/min注射240s，并使其解離600s或14000s。延長監測以接近1E-5s^-1的k_d緩慢解離(li)的抗原(yuan)的解離(li)相(xiang)對獲(huo)得解離(li)速率的穩健值(robust value)是(shi)至(zhi)關重要的。在每個分析物(wu)注射(she)(she)循環后(hou)，通過注射(she)(she)pH 2.1的10mM甘(gan)氨(an)酸使(shi)CM4表面(mian)再生(sheng)。該再生(sheng)步驟將抗TFPI雙(shuang)特(te)異性(xing)分子和任何結合的抗原(yuan)從固(gu)定的捕獲(huo)抗體表面(mian)上除去，并允許下(xia)一(yi)個相(xiang)互作用樣品(pin)對的隨(sui)后(hou)結合。該再生(sheng)程序(xu)沒有從芯(xin)片(pian)表面(mian)上除去直(zhi)接固(gu)定的抗Fab捕獲(huo)抗體。

通過確定平衡解離常數(K_D)來定量BiFab或雙特異性mAb與抗原之間的結合親和力，該平衡解離常數通過測量復合物形成和解離的動力學而確定。使用用于數據分析的Biacore評價軟件，通過將數據全局擬合至具有局部Rmax的1∶1Langmuir模型來檢索與單價復合物的結合和解離相對應的速率常數，如k_a(結合速率)和k_d(解離速率)。K_D通過方程式K_D＝k_d/k_a與k_a和k_d相關。

通過雙參考(在數據分析之前在捕獲(huo)的雙特異性分子(zi)基礎上減去(qu)參考表面信號(hao)以及空白緩沖液(ye)注(zhu)射)來處理結合(he)曲(qu)線。這允(yun)許在樣(yang)品注(zhu)射期間針對儀器(qi)噪聲、體積移(yi)位和(he)漂移(yi)進行校正。

表3：TFPI蛋(dan)白(bai)與雙特(te)異性(xing)分子結合的相互作用動力學(xue)

人TFPI(1-79)或KPI-2與不同雙特異性分子的結合常數k_a(結合速率)、k_d(解離速率)和K_D(平衡解離常(chang)數)的測量結果(guo)。

在(zai)TFPI(1-79)的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)(he)和(he)TFPI KPI-2結(jie)合(he)(he)(he)(he)中發現(xian)BiFab 9041與(yu)(yu)(yu)mAb 0421沒(mei)有(you)大的(de)(de)差(cha)異(表(biao)3)。與(yu)(yu)(yu)單個TFPI結(jie)構域(yu)相比，TFPI FL的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)(he)顯(xian)示出(chu)不同的(de)(de)與(yu)(yu)(yu)兩種雙特(te)異性分子的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)(he)譜(pu)，因(yin)為(wei)結(jie)合(he)(he)(he)(he)似(si)乎(hu)受到多價或親(qin)合(he)(he)(he)(he)力結(jie)合(he)(he)(he)(he)的(de)(de)影響(即使(shi)在(zai)低(di)配(pei)體密度下)，從而產生更高的(de)(de)表(biao)觀親(qin)和(he)力。TFPI FL與(yu)(yu)(yu)mAb 0421和(he)BiFab 9041的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)(he)具有(you)類似(si)的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)(he)曲線(xian)形(xing)狀(zhuang)，這表(biao)明(ming)通(tong)過經由兩個抗(kang)體片段的(de)(de)化學(xue)綴合(he)(he)(he)(he)而引入雙特(te)異性結(jie)合(he)(he)(he)(he)(如(ru)同本實施例中使(shi)用的(de)(de)BiFab中一樣)，實現(xian)了與(yu)(yu)(yu)雙特(te)異性抗(kang)體相同的(de)(de)對(dui)結(jie)合(he)(he)(he)(he)譜(pu)的(de)(de)影響(參見圖3)。

實施例9：凝血酶生成試驗

在正常(chang)人血(xue)(xue)(xue)漿(CryoCheck Normal Plasma)中研究抗(kang)(kang)體對(dui)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)生(sheng)成的(de)(de)(de)影響。通(tong)過再鈣(gai)化并添加(jia)1pM組織因子與4μM磷脂囊泡(PPP-Reagent low)而誘導(dao)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)的(de)(de)(de)啟動。通(tong)過添加(jia)100μg/ml綿羊抗(kang)(kang)人FVIII抗(kang)(kang)體(Haematologic Technologies Inc.，PAHFVIII-S)獲(huo)(huo)得(de)A型血(xue)(xue)(xue)友病樣血(xue)(xue)(xue)漿。當指(zhi)示時(shi)(shi)，向血(xue)(xue)(xue)漿中加(jia)入10-20nM外源重組人TFPIα(SEQ ID NO：1)。在來自Bachem(Bubendorf，Switzerland)的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)底(di)物(wu)Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl(I-1140)轉化后(hou)，連(lian)續評價(jia)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)活性。使用(yong)分別設定(ding)在368和(he)460nm的(de)(de)(de)激發和(he)發射波(bo)長，在微量滴(di)定(ding)板Fluorskan Ascent熒(ying)光(guang)計(ji)(Thermo Labsystems，Helsinki，Finland)中測(ce)量熒(ying)光(guang)。使用(yong)校(xiao)準(zhun)器(qi)來允許計(ji)算所形成的(de)(de)(de)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)量并針(zhen)對(dui)內濾效應(ying)和(he)熒(ying)光(guang)底(di)物(wu)消(xiao)耗來校(xiao)正所獲(huo)(huo)得(de)的(de)(de)(de)相對(dui)熒(ying)光(guang)單位。此(ci)外，減去凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)-α2-巨球蛋白復合物(wu)對(dui)底(di)物(wu)轉化的(de)(de)(de)貢(gong)獻(xian)。這些校(xiao)正通(tong)過由Thrombinoscope BV(Maastricht，the Netherlands)提供的(de)(de)(de)經(jing)校(xiao)準(zhun)的(de)(de)(de)自動血(xue)(xue)(xue)栓圖(thrombogram)(CAT)計(ji)算機軟件自動進行。獲(huo)(huo)得(de)產生(sheng)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)生(sheng)成曲線的(de)(de)(de)數據的(de)(de)(de)一階(jie)導(dao)數，從而允許計(ji)算i)滯后(hou)時(shi)(shi)間，ii)曲線下總面積，內源性凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)電位(ETP)，iii)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)峰(feng)高度(峰(feng)值(zhi))，iv)達到峰(feng)值(zhi)的(de)(de)(de)時(shi)(shi)間(ttPeak)，和(he)v)凝(ning)(ning)血(xue)(xue)(xue)酶(mei)(mei)(mei)生(sheng)成的(de)(de)(de)最大速率(lv)(速率(lv))。

實施(shi)例10：TFPI(1-161)特異性抗TFPI抗體對TFPIα水平升高的人(ren)FVIII中和的血漿中組(zu)織因子誘導的凝血酶生(sheng)成的影(ying)響

根(gen)據實施(shi)例9(圖1)，在凝血(xue)酶(mei)生成(cheng)試驗中(zhong)研(yan)究(jiu)了抗(kang)TFPI(1-79)抗(kang)體(ti)mAb 1F91、mAb 2F22、mAb 2F45和mAb 2F3以及TFPI KPI-2抗(kang)體(ti)mAb 2021對凝血(xue)酶(mei)生成(cheng)的(de)影響。來自圖1中(zhong)的(de)凝血(xue)酶(mei)生成(cheng)的(de)參(can)數可參(can)見表4。達到峰值(zhi)的(de)時間(ttPeak，min)和凝血(xue)酶(mei)峰(nM)都是n＝3的(de)平均(jun)值(zhi)。將200nM抗(kang)體(ti)添加至補充有20nM TFPIα的(de)FVIII中(zhong)和的(de)血(xue)漿中(zhong)。

表(biao)4：凝(ning)血(xue)酶峰(feng)(feng)高(峰(feng)(feng)值)和達到峰(feng)(feng)值的時間(ttPeak)

自(zi)凝血(xue)酶生(sheng)成(cheng)曲線衍(yan)生(sheng)的(de)(de)凝血(xue)酶峰(feng)(feng)高(gao)(峰(feng)(feng)值)和達到峰(feng)(feng)值的(de)(de)時間(ttPeak)，該(gai)凝血(xue)酶生(sheng)成(cheng)曲線在補充(chong)有20nM TFPIα的(de)(de)FVIII中和的(de)(de)血(xue)漿中獲得(de)。

一些但并非全部(bu)高(gao)親(qin)和力TFPI(1-79)抗體(ti)能夠部(bu)分恢復具有20nM TFPIα的(de)A型血(xue)友病樣血(xue)漿(jiang)中(zhong)的(de)凝血(xue)酶生成(cheng)。表(biao)4中(zhong)的(de)數(shu)據提示，當循環中(zhong)TFPI抗體(ti)的(de)存在導致(zhi)血(xue)漿(jiang)TFPI濃度積累(lei)和增加(jia)時，需要更有效的(de)TFPI抑制阻斷。

在根據(ju)實施(shi)例9的凝血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生(sheng)成(cheng)試(shi)驗(yan)中(zhong)研究了將每(mei)種抗TFPI(1-79)抗體與抗TFPI KPI-2mAb 2021組合對(dui)凝血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生(sheng)成(cheng)的影(ying)響，并于(yu)圖2中(zhong)示出。來自圖2中(zhong)的凝血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生(sheng)成(cheng)的參數可(ke)參見表(biao)5。達到峰值的時間(ttPeak，min)和凝血(xue)(xue)酶(mei)(mei)峰(nM)都是n＝3的平均值。將100nM抗體添加(jia)至(zhi)補充(chong)有20nM TFPIα和100nM mAb 2021的FVIII中(zhong)和的血(xue)(xue)漿中(zhong)。

表5：凝血酶(mei)峰(feng)高(峰(feng)值)和達到峰(feng)值的時間(ttPeak)

自凝血酶生成曲(qu)(qu)線衍生的(de)凝血酶峰高(峰值)和達(da)到(dao)峰值的(de)時間(jian)(ttPeak)，該凝血酶生成曲(qu)(qu)線在補充有20nM TFPIα的(de)FVIII中和的(de)血漿(jiang)中獲得。將100nM的(de)每種抗體添加至血漿(jiang)中。

表(biao)5中的數(shu)據提示，通過(guo)中和參與(yu)TF/FVIIa/FXa/TFPI復合物(wu)穩定(ding)化的超過(guo)一個表(biao)位，獲得了(le)更有效的TFPI抑(yi)制阻斷。

實(shi)施例11：抗TFPI BiFab對人(ren)A型血(xue)友病血(xue)漿中組織因子誘導(dao)的凝血(xue)酶生成的協同效(xiao)應

根(gen)據實施例2和(he)(he)5-7制備了(le)針對(dui)TFPI(1-79)、TFPI的(de)KPI-2結構域的(de)Fab片段和(he)(he)BiFab。將靶向TFPI(1-79)和(he)(he)KPI-2結構域的(de)BiFab對(dui)凝血(xue)酶(mei)生(sheng)成的(de)影響(xiang)與單獨或組合的(de)相應未綴合Fab片段的(de)影響(xiang)進行比較。根(gen)據實施例9測量對(dui)FVIII中(zhong)和(he)(he)的(de)血(xue)漿和(he)(he)補充(chong)有10nM TFPIα的(de)FVIII中(zhong)和(he)(he)的(de)血(xue)漿中(zhong)的(de)凝血(xue)酶(mei)生(sheng)成的(de)影響(xiang)，并且數據于表6中(zhong)列出。參數衍生(sheng)自凝血(xue)酶(mei)生(sheng)成曲(qu)線。達到峰值的(de)時間(ttPeak，min)和(he)(he)凝血(xue)酶(mei)峰(nM)都是n＝2的(de)平均值。

表6：凝血酶峰(feng)(feng)高(峰(feng)(feng)值)和達到峰(feng)(feng)值的時(shi)間(ttPeak)

自凝血(xue)酶生成(cheng)曲線衍生的(de)(de)(de)(de)凝血(xue)酶峰高(峰值)和達到峰值的(de)(de)(de)(de)時間(jian)(ttPeak)，該凝血(xue)酶生成(cheng)曲線在具(ju)有內源TFPI水(shui)平(ping)或補充有10nM TFPIα的(de)(de)(de)(de)FVIII中和的(de)(de)(de)(de)血(xue)漿中獲得。當(dang)使用FAb片(pian)段的(de)(de)(de)(de)組合時，每種片(pian)段被添加(jia)至100nM的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度(du)。

表6中的(de)(de)數(shu)據提示，通(tong)過中和TFPI上的(de)(de)超(chao)過一(yi)個(ge)表位，獲得(de)了更(geng)有(you)效(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)TFPI抑制阻(zu)斷。顯然，由于(yu)BiFab 9042與TFPI結合的(de)(de)親合力效(xiao)(xiao)(xiao)應(實施例8)而(er)獲得(de)的(de)(de)高親和力導致了對(dui)凝(ning)血酶生成(cheng)的(de)(de)協同效(xiao)(xiao)(xiao)應，其高于(yu)通(tong)過將相應的(de)(de)兩個(ge)未綴合的(de)(de)Fab片段組合而(er)獲得(de)的(de)(de)效(xiao)(xiao)(xiao)應。

實(shi)施例12：抗(kang)TFPI雙特異性抗(kang)體對(dui)人A型血友病血漿中組織因子誘(you)導的(de)凝血酶生成(cheng)的(de)影響

通過使用經由(you)靶向(xiang)TFPI(1-79)和TFPI的(de)KPI-2區中(zhong)的(de)表位的(de)抗(kang)體(ti)的(de)Fc異(yi)二聚化而組裝(zhuang)的(de)不對(dui)稱雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)，可獲得對(dui)人A型血友病血漿中(zhong)組織因子(zi)誘導的(de)凝血酶生(sheng)成(cheng)的(de)促凝血作用。

不(bu)對稱雙特異(yi)性抗體的生成

基于(yu)不對稱IgG形式，即通過Fc異二聚化(hua)，生成雙特異性TFPI(1-79)/KPI-2結合抗(kang)體。為了實現FC異二聚化(hua)，將一組相容的(de)突變(bian)工(gong)程改造(zao)至(zhi)mAb 2021(KPI-2結合)和(he)mAb 2F22(TFPI(1-79)結合)的(de)hIgG1變(bian)體的(de)Fc區中。

通(tong)過限制酶消化(hua)(hua)(hua)從實施例5中描述的人源化(hua)(hua)(hua)mAb 2021的HC表(biao)(biao)達載體(ti)(ti)和HC表(biao)(biao)達載體(ti)(ti)mAb 2F22表(biao)(biao)達載體(ti)(ti)上切下VH片段，并將其克(ke)隆至含有人IgG1恒(heng)定(ding)區序(xu)列(lie)的線性化(hua)(hua)(hua)的基(ji)于pTT的工具(ju)箱載體(ti)(ti)中。隨后將克(ke)隆反應轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)到大腸桿菌中以供選擇。通(tong)過DNA測序(xu)來驗證(zheng)最(zui)終(zhong)構建體(ti)(ti)的序(xu)列(lie)。

為通(tong)(tong)過(guo)受控的(de)(de)(de)(de)(de)Fab-臂交換來(lai)支(zhi)持FC異(yi)二(er)聚化(hua)，向(xiang)mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)IgG1 HC的(de)(de)(de)(de)(de)CH3域中(zhong)(zhong)引入單個賴氨(an)酸至精氨(an)酸的(de)(de)(de)(de)(de)突變(bian)，其對應于SEQ ID NO：27的(de)(de)(de)(de)(de)位置413。通(tong)(tong)過(guo)使用來(lai)自(zi)Stratagene的(de)(de)(de)(de)(de)定點(dian)突變(bian)試劑盒(he)的(de)(de)(de)(de)(de)定點(dian)突變(bian)來(lai)引入該突變(bian)。通(tong)(tong)過(guo)DNA測序來(lai)驗(yan)證所有最終(zhong)構建體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)序列。mAb 2021的(de)(de)(de)(de)(de)工程化(hua)IgG1形式如實施(shi)(shi)例2中(zhong)(zhong)所述(shu)在EXPI293F細胞中(zhong)(zhong)表達為mAb 0310(SEQ ID NO：27和28)。LC表達載(zai)體(ti)對應于如實施(shi)(shi)例5中(zhong)(zhong)所述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)用于mAb 2021表達的(de)(de)(de)(de)(de)載(zai)體(ti)。根(gen)據制造商的(de)(de)(de)(de)(de)說明(ming)書，通(tong)(tong)過(guo)使用來(lai)自(zi)GE Healthcare的(de)(de)(de)(de)(de)MabSelectSuRe樹脂的(de)(de)(de)(de)(de)標準親和色譜法進(jin)行純(chun)化(hua)。將純(chun)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)抗體(ti)用pH 7.2的(de)(de)(de)(de)(de)PBS緩沖(chong)液進(jin)行緩沖(chong)液交換。

向mAb 2F22的(de)(de)(de)(de)(de)IgG1 HC的(de)(de)(de)(de)(de)CH3域中(zhong)引入匹配的(de)(de)(de)(de)(de)苯丙(bing)氨酸至(zhi)亮氨酸突(tu)變(bian)，其對(dui)應于(yu)SEQ ID NO：29中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)位置409。通過使用(yong)來(lai)(lai)自(zi)Stratagene的(de)(de)(de)(de)(de)定點突(tu)變(bian)試劑(ji)盒(he)的(de)(de)(de)(de)(de)定點突(tu)變(bian)來(lai)(lai)引入該突(tu)變(bian)。通過DNA測序(xu)來(lai)(lai)驗證所(suo)有最(zui)終(zhong)構建體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie)。mA2 2F22的(de)(de)(de)(de)(de)工程化IgG1形式如實(shi)施(shi)(shi)例2中(zhong)所(suo)述在(zai)EXPI293F細(xi)胞(bao)中(zhong)表達(da)為mAb 0336(SEQ ID NO：15和29)。LC表達(da)載體(ti)對(dui)應于(yu)如實(shi)施(shi)(shi)例2中(zhong)所(suo)述的(de)(de)(de)(de)(de)用(yong)于(yu)mAb 2F22表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)載體(ti)。根據制造商的(de)(de)(de)(de)(de)說明(ming)書，通過使用(yong)來(lai)(lai)自(zi)GE Healthcare的(de)(de)(de)(de)(de)MabSelectSuRe樹(shu)脂的(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)親和色譜法進(jin)行純化。將純化的(de)(de)(de)(de)(de)抗體(ti)用(yong)pH 7.2的(de)(de)(de)(de)(de)PBS緩沖(chong)液(ye)進(jin)行緩沖(chong)液(ye)交換。

通(tong)過mAb2021(KPI-2結(jie)合(he)(he))的工程化(hua)IgG1變體(ti)(ti)mAb 0310與mAb 2F22(TFPI(1-79)結(jie)合(he)(he))的工程化(hua)IgG1變體(ti)(ti)mAb 0336之(zhi)間的受控Fab-臂交換，制備了雙特異性(xing)TFPI(1-79)/KPI-2結(jie)合(he)(he)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)。基(ji)本上根據公開的方法(fa)(Labrijn等人，PNAS，110，5145-5150(2013))制備該(gai)雙特異性(xing)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)。簡言之(zhi)，將mAb 0310(mAb 2021 IgG1 Lys至(zhi)Arg變體(ti)(ti)SEQ ID NO：27)與mAb 0336(mAb 2F22 IgG1 Phe至(zhi)Leu變體(ti)(ti)SEQ ID NO：29)以(yi)1∶1摩爾比(每種(zhong)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)1mg/ml)于PBS緩沖液中混(hun)合(he)(he)。通(tong)過在(zai)25mM 2-巰基(ji)乙胺(MEA)的存(cun)在(zai)下(xia)于37℃溫育該(gai)1∶1混(hun)合(he)(he)物90分鐘來選擇性(xing)地還原(yuan)該(gai)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，以(yi)形成半抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)并允(yun)許(xu)Fab-臂交換。最(zui)后(hou)，在(zai)除去還原(yuan)劑(ji)(滲濾至(zhi)不含MEA的PBS緩沖液中)并在(zai)+5℃下(xia)儲存(cun)至(zhi)少16小(xiao)時(shi)后(hou)獲得自發(fa)重組(zu)裝和再氧化(hua)。觀察到(dao)由CH3域突變促進(jin)的異二(er)聚化(hua)，效率超過90％。衍生(sheng)自mAb 0310和0336的最(zui)終雙特異性(xing)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)被命名為(wei)mAb 0421(SEQ ID NO：27、28和15、29)。

抗TFPI雙特異性抗體對人A型血(xue)友(you)病血(xue)漿(jiang)中組織(zhi)因(yin)子誘(you)導(dao)的凝血(xue)酶生成的影響(xiang)

通過使(shi)用經由靶向(xiang)TFPI(1-79)和TFPI的(de)(de)KPI-2區中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)表(biao)位的(de)(de)抗(kang)體(ti)的(de)(de)Fc異(yi)二聚(ju)化(hua)而組裝的(de)(de)不對(dui)稱雙特異(yi)性抗(kang)體(ti)，可獲得對(dui)人A型血(xue)(xue)友病血(xue)(xue)漿中(zhong)(zhong)(zhong)組織(zhi)因子誘導的(de)(de)凝(ning)血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生成的(de)(de)促凝(ning)血(xue)(xue)作用。根(gen)據實施例9于(yu)凝(ning)血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生成試驗中(zhong)(zhong)(zhong)研究了(le)對(dui)FVIII中(zhong)(zhong)(zhong)和的(de)(de)血(xue)(xue)漿和補充(chong)有10nM TFPIα的(de)(de)FVIII中(zhong)(zhong)(zhong)和的(de)(de)血(xue)(xue)漿中(zhong)(zhong)(zhong)凝(ning)血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生成的(de)(de)影響，并且(qie)數(shu)據于(yu)表(biao)7中(zhong)(zhong)(zhong)列出。參(can)數(shu)衍(yan)生自凝(ning)血(xue)(xue)酶(mei)(mei)生成曲(qu)線(xian)。

表7：凝(ning)血酶峰高(峰值(zhi))和達到峰值(zhi)的時間(jian)(ttPeak)

表(biao)(biao)7顯示，向正常血(xue)漿(jiang)中添加抗人FVIII抗體(ti)以模擬A型血(xue)友病樣條(tiao)件大大減少了(le)凝(ning)血(xue)酶生(sheng)(sheng)成。凝(ning)血(xue)酶峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi)(峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi))和(he)達(da)到峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)時(shi)間(ttPeak)都受到影響(xiang)。向FVIII中和(he)的(de)血(xue)漿(jiang)中添加一些抗TFPI抗體(ti)，包(bao)括mAb 0310(mAb 2021的(de)Fc工程化形(xing)式)、mAb 0336(抗TFPI mAb 2F22的(de)Fc工程化形(xing)式)和(he)mAb 0421(衍(yan)生(sheng)(sheng)自mAb 0310和(he)mAb 0336的(de)不對稱雙特異性抗體(ti))，有效地重新確立了(le)凝(ning)血(xue)酶峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi)(峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi))和(he)達(da)到峰(feng)值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)時(shi)間(ttPeak)。據(ju)估(gu)計，獲(huo)得半數(shu)(shu)最大響(xiang)應(ying)(EC50)所需的(de)mAb 0421濃度為1.1nM(使用GraphPad PrismR軟件將表(biao)(biao)7中給出(chu)的(de)2次實驗(yan)平均(jun)值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)數(shu)(shu)據(ju)擬合至四參數(shu)(shu)劑(ji)量-響(xiang)應(ying)曲線)。

此外，表7顯示，向(xiang)FVIII中和(he)(he)的(de)血漿(jiang)中添加(jia)(jia)10nM全(quan)長TFPIα完全(quan)阻止了(le)可測(ce)量的(de)凝血酶生成，并(bing)且(qie)在這(zhe)些條件(jian)下100nM針對(dui)TFPI(1-79)(mAb 0336)或(huo)KPI-2(mAb 0310)的(de)高(gao)親和(he)(he)力抗體的(de)添加(jia)(jia)不能(neng)完全(quan)消除TFPI抑制(zhi)。相比之下，不對(dui)稱(cheng)雙特異性(xing)抗體mAb 0421劑(ji)量依賴性(xing)地建立了(le)穩定的(de)凝血酶峰(feng)(feng)和(he)(he)縮短的(de)達到峰(feng)(feng)值的(de)時間(ttPeak)，估計的(de)EC50為(wei)9.5nM(單次(ci)實驗)。

表(biao)(biao)7中(zhong)(zhong)的(de)數據提示，通過中(zhong)(zhong)和TFPI上(shang)的(de)超過一個表(biao)(biao)位，獲得(de)更(geng)有效的(de)TFPI抑制阻斷。

實(shi)施例13：與TFPI KPI-2高(gao)親和力(li)結(jie)合(he)且與TFPI KPI-1低(di)親和力(li)結(jie)合(he)的(de)雙特異(yi)性(xing)分子

對(dui)于雙(shuang)特異性TFPI(1-79)/KPI-2結合分(fen)子(zi)的某些應(ying)用，一個臂(bei)與(yu)(yu)TFPI KPI-2高親(qin)和力結合而另(ling)一個臂(bei)與(yu)(yu)TFPI(1-79)低(di)親(qin)和力結合可能是有利的。

對(dui)應于(yu)mAb 2F22的Fab 0296(SEQ ID NO：14(重鏈(lian)(lian))和(he)15(輕(qing)鏈(lian)(lian)))以高親和(he)力與TFPI(1-79)結(jie)合，并且可充(chong)當用于(yu)設計(ji)對(dui)TFPI(1-79)的親和(he)力降低(與Fab 0296相比)的變體(ti)的模板。

如實施例4所述(shu)，Fab 0296的互補位已經確定，并且包括(kuo)重(zhong)鏈(SEQ ID NO：14)的殘基(ji)Val 2、Phe 27、Tyr 32、Trp 52、Arg 53、Gly 54、Gly 55、Ser 56、Ile 57、Asp 58、Tyr 59、Ala 61、Met 64、Lys 97、Ser 99、His 100、Asn 102、Tyr 103、Val 104、Gly 105和Tyr 106，以及輕鏈(SEQ ID NO：15)的殘基(ji)Pro 31、Ala 32、Tyr 49、Ser 50、Asn 53、Tyr 55、Thr 56、Tyr 91、Thr 92、Ser 93和Tyr 94。

Fab 0296的(de)高親和力由在其上(shang)述(shu)互(hu)(hu)補位殘(can)(can)基與TFPI(1-79)上(shang)的(de)表(biao)位殘(can)(can)基之間的(de)幾種相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)，例如靜電、極性(xing)、疏水和氫鍵相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)的(de)組合造成(cheng)。因此，通過用(yong)不同(tong)的(de)氨基酸殘(can)(can)基置換一個或多(duo)個互(hu)(hu)補位殘(can)(can)基，從而(er)弱化或加(jia)強互(hu)(hu)補位-表(biao)位相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)，來調節(jie)Fab 0296對TFPI(1-79)的(de)結合親和力。

通過例如在(zai)單個(ge)位(wei)置(zhi)(zhi)的保(bao)(bao)(bao)守取代、在(zai)數個(ge)位(wei)置(zhi)(zhi)的保(bao)(bao)(bao)守取代或在(zai)一個(ge)或多(duo)個(ge)位(wei)置(zhi)(zhi)的保(bao)(bao)(bao)守性較低的取代而(er)不(bu)同(tong)程度(du)地(di)削弱Fab 0296對TFPI(1-79)的親和力。

除了(le)在重(zhong)鏈(lian)(lian)C-末端處的(de)額外(wai)半胱氨酸外(wai)，Fab 0295(SEQ ID NO：18(重(zhong)鏈(lian)(lian))和15(輕(qing)鏈(lian)(lian)))與Fab 0296相同，并且其(qi)具有(you)與Fab 0296相同的(de)互(hu)補位。因此，通(tong)過(guo)使用其(qi)中單個或多個互(hu)補位殘(can)基已(yi)被(bei)取代的(de)Fab 0295的(de)變體，并如(ru)實施例7所述(shu)將其(qi)與KPI-2結(jie)合Fab綴合，來制備對TFPI(1-79)具有(you)低親和力的(de)雙特異性TFPI(1-79)/KPI-2結(jie)合分(fen)子。KPI-2結(jie)合Fab可為例如(ru)Fab 0088，但也可為其(qi)它KPI-2結(jie)合Fab片段(duan)。

通過使用與本實施例(li)中(zhong)描(miao)述的(de)Fab片段對應(ying)的(de)全長抗體，根據實施例(li)12中(zhong)描(miao)述的(de)方法獲得相應(ying)的(de)雙(shuang)特異性抗體是可能的(de)。

雖(sui)然本(ben)文(wen)已經示(shi)出和(he)描述了(le)本(ben)發明(ming)的(de)某些特征，但是本(ben)領域普通(tong)技術人員將會想到(dao)許多(duo)修(xiu)改、替(ti)換、改變和(he)等同物。因此，應當理解，所附權利要求旨在覆蓋(gai)落入本(ben)發明(ming)真(zhen)正(zheng)精(jing)神內的(de)所有(you)這樣的(de)修(xiu)改和(he)改變。

序列表

<110> 諾和諾德(de)股份有限公司

<120> 能夠結合組織因子途徑抑制物(1-161)上(shang)的兩個表位(wei)的抗(kang)體

<130> 140072

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5  10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

 20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35  40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75  80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

 85 90  95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100  105  110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

 115 120  125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150  155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165  170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

 180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

 195 200  205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230  235 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys

  245 250 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

 260  265 270

Val Lys Asn Met

275

<210> 2

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工(gong)序列(lie)

<220>

<223> TFPI (1-161)

<400> 2

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5   10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20  25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45 

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50   55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75  80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90  95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100  105  110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

 115 120 125 

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140 

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155  160

Thr

<210> 3

<211> 66

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> TFPI KPI-2構建體

<400> 3

Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys

1  5 10 15

Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys

20 25  30

Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu

35 40  45

Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly His His His His

50  55 60

His His

65

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40  45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Phe Asn Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Ser Phe Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65  70 75  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

 85 90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1  5  10 15

Asp Lys Val Ser Ile Pro Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ala Ala

20 25  30 

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile

35 40  45 

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55   60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Val Gln Ser

65 70  75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Tyr Pro Thr

85  90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 小(xiao)鼠

<400> 6

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1  5  10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

 35 40 45

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50  55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70   75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

 85 90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100  105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 小(xiao)鼠

<400> 7

Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1  5 10  15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Pro Ala

20 25  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40  45 

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60 

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu His Ser

65  70 75  80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr

85  90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠(shu)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr

 20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40  45 

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50  55  60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85  90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala

20 25  30 

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile

35  40 45 

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Arg Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70  75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr

 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10  15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20  25  30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40  45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55   60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65  70 75  80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90   95

Ala Arg Trp Ala Tyr Asp Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

 100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5  10  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser His Met

20 25  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35  40 45 

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu

65 70  75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(gong)序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cccttgacca ggcatcccag   20

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> 引物(wu)

<400> 13

gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg  36

<210> 14

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0296的(de)截短的(de)鼠-人嵌合重鏈(lian)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10   15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

 20  25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40  45 

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

 85  90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100  105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155  160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

 180 185  190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195  200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

<210> 15

<211> 213

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> mAb 0294、Fab 0296和Fab 0295和mAb 0336的(de)鼠(shu)-人(ren)嵌合輕鏈

<400> 15

Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5  10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Pro Ala

20  25  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50  55 60 

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu His Ser

65 70 75  80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Tyr Pro Thr

 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

 115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145  150 155  160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180  185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 標記的(de)TFPI KPI-1/N-末端(TFPI (1-79))

<400> 16

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr

1 5  10 15

Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe

20  25 30

Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg

35 40 45

Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly

50 55  60 

Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys

65   70 75 80

Lys Met Cys Thr Arg Asp

85

<210> 17

<211> 448

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> 單(dan)克(ke)隆抗體mAb 0294的鼠-人嵌合重鏈

<400> 17

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5   10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20  25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40   45

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50   55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65   70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100  105  110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115  120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135  140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180  185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195  200  205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225  230  235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250  255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

 260 265  270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275  280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295  300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305  310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330  335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370  375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385  390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

 405  410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

 420  425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435  440 445

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0295的截短的鼠-人嵌合重鏈(lian)

<400> 18

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1  5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40  45

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50  55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75  80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

 85  90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

 100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115  120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130  135  140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145  150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

 165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

 180  185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220  

Pro Pro Cys

225

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 2021的(de)重鏈可變域(VH)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35  40 45 

Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50  55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70  75  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85  90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100 105  110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(lie)

<220>

<223> mAb 2021的輕鏈可變域(VL)

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10   15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20  25  30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50  55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85  90  95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 21

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0094的(de)重鏈(lian)(HC)

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5  10  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25  30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

 35 40 45 

Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

 50  55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70  75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

 85 90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100  105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135  140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150  155  160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165  170  175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180  185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200  205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215  220

Pro Pro Cys

225

<210> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0094的輕鏈(LC)

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10   15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20  25  30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40  45 

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65  70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90  95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115  120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135  140 

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165  170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180  185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195  200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0088的重鏈(HC）

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5  10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

 20  25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50 55  60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85   90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100   105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130  135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150  155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180  185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195  200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210  215  220

Pro Pro Cys

225

<210> 24

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab 0088的輕鏈(LC)

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1  5  10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

 20 25  30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50  55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90  95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100  105  110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115  120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130  135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150  155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165  170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180  185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200  205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 25

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序(xu)列(lie)

<220>

<223> Fab 0313的重鏈(HC）

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5  10  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

 50 55 60 

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70  75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

 85  90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100  105  110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115  120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

 130 135  140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150  155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165  170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

 180  185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195  200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215  220

Pro Pro Cys

225

<210> 26

<211> 219

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> Fab 0313的(de)輕鏈(lian)(LC）

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5  10  15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25   30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35  40 45

 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70  75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90  95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105  110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120  125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135  140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145  150  155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170  175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

 180  185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195  200  205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 27

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 0310的重(zhong)鏈(HC）

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20  25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35  40  45

Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50  55  60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

 85 90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115   120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155  160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

 165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185  190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215  220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225  230  235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250   255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275  280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295  300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310  315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360  365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375  380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385  390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

405  410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440  445

Pro Gly Lys

450

<210> 28

<211> 219

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列(lie)

<220>

<223> mAb 0310的輕鏈(LC）

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20  25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45 

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50  55 60 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

 85  90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120  125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150  155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

 165 170  175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185   190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200  205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 451

<212> PRT

<213> 人(ren)工序列

<220>

<223> mAb 0336的重鏈(HC）

<400> 29

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1  5 10  15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25  30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45 

Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met

50  55  60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65  70  75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85  90 95

Lys Asn Ser His Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100   105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115  120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135  140 

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155  160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165  170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180   185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195  200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215  220 

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225   230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245  250  255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260  265  270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275  280  285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290  295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

  325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340  345  350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355  360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370  375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385  390 395  400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

 405 410  415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

 420  425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440  445

Pro Gly Lys

450