鰩血管生成抑制因子1的適配子k10及其篩選方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明設及一種經血管生成抑制因子1適配 子及其篩選方法和應用。
【背景技術】
[0002] 近些年來，寡核巧酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注 目。寡核巧酸適配子是由沈LEX技術（Systematic evolution of ligands by e邱onential enrichment)生物文庫技術篩選獲得的，該技術的原理就是利用分子生物學技術，構建人工 合成的單鏈隨機寡核巧酸文庫，其隨機序列長度在20-100個堿基左右。利用單鏈寡核巧酸 分子構像靈活多變的特性，將隨機寡核巧酸文庫與祀分子相互作用，保留W空間構像與祀 分子結合的寡核巧酸，經反復擴增、篩選數個循環，即可使與該祀子特異結合的寡核巧酸序 列得到富集，最終獲得多種祀分子的特異寡核巧酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術篩選 獲得的aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更 多的優越性，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復性可逆，可修飾 并有利于長期保存和室溫運輸等。更重要的是，aptamer比抗體具有更高的特異性，甚至能 識別單抗不能區分的蛋白質分子。而且aptamer的祀分子非常廣泛，小至染料分子，大至完 整的病毒顆粒和細菌病原體，甚至完整的細胞也可W通過消減SELEX技術篩選出高親和力 的寡核巧酸適配子。
[0003] 經血管生成抑制因子1功能區W下簡稱經功能區，經血管生成抑制因子1是我們首 次從南海海域一種經組織中分離出來的蛋白質（分子量42KD)。研究結果顯示:經血管生成 抑制因子1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細胞誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生 成;無論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠 Lewis肺癌的生長和轉移，減少腫瘤組織微 血管密度，下調促血管生成因子VEGF的表達;對裸小鼠黑色素瘤B16細胞的轉移也有強抑制 作用；下調促轉移因子CD44v6和化化2的表達；與5-氣尿喀晚（5-FU)聯合應用時效果更顯 著。經血管生成抑制因子1的作用祀點與美國基因技術研究所開發出的抗癌新藥Avastin不 同。Avastin是基因工程產品，是VEGF的抗體，其作用祀點是VEGF;經血管生成抑制因子1是 天然產物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和PDGF。因此，針對經血管生成抑制因子1功能 區進行特異性的鑒別和篩選是本領域一貫的追求。
[0004] 基于W上考慮，本發明W經血管生成抑制因子1功能區蛋白為目的祀蛋白，采用 S化EX技術獲得了 10條經血管生成抑制因子1功能區蛋白特異的aptamer,組合應用能夠迅 速、敏感、特異的檢測到經血管生成抑制因子1功能區蛋白。由于單鏈DNA寡核巧酸適配子性 能穩定、合成方便且廉價、經修飾后可直接用于巧光或化學發光、發色方法檢測祀綁帶，因 此操作簡單、直接。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供不僅具有檢測快速、操作簡單、穩定性高于抗體等特點，而 且制備方法容易、制備周期較短的一組能識別經血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核巧 酸序列及其制備方法。
[0006] 所述能識別經血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核巧酸序列，包括SEQ ID No.2-11，且采用其中的一條寡核巧酸序列就能完成對經血管生成抑制因子1功能區蛋白的 識別檢測；
[0007] 所述一組能識別經血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核巧酸序列的制備方法包 括W下步驟：
[000引 1、合成用于篩選的ssDNA寡核巧酸文庫（5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[0009] N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35為35個隨機寡核巧酸；
[0010] 2、將寡核巧酸文庫分別與經血管生成抑制因子1功能區蛋白混合后進行SELEX篩 選，獲得適配子富集文庫；
[0011] 3、SELEX篩選完成后，對獲得的適配子富集文庫進行克隆測序；
[0012] 4、選擇測序結果中出現的高拷貝ssDNA，進行親和特異性的驗證，篩選獲得能識別 經血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核巧酸序列。
【具體實施方式】 [oou]實施例1
[0014] 1、經血管生成抑制因子1功能區蛋白的制備
[0015] 采用本領域技術人員熟知的酵母重組表達的方式獲得具有與經血管生成抑制因 子1功能區蛋白相同生物活性的經血管生成抑制因子1功能區蛋白，該蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示;蛋白溶液的濃度為15mg/m 1。
[0016] 2、文庫和引物的合成
[0017] 2.1、合成用于篩選的ssDNA寡核巧酸文庫（5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[001 引 N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35為35個隨機寡核巧酸；
[0019] 引物P1 :TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC;
[0020] 引物 P2: CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
[0021] 2.2、適配子的SELEX篩選，具體方法如下：
[0022] 2.2. IssDNA與經血管生成抑制因子1功能區蛋白的結合、分離，具體方法如下：
[0023] 取lOOiiM的ssDNA寡核巧酸文庫4yL，用2X結合緩沖液稀釋至100μ1，95Γ變性 5min，冰浴lOmin后加入100μΙ經血管生成抑制因子1功能區蛋白，搖床結合30min，再 600化pm離屯、5min，棄上清，然后用1 X結合緩沖液洗沉淀，棄上清;在沉淀中再加入1 X結合 緩沖液10化L，96 °C加熱5min，然后1500化pm離屯、lOmin，取上清液，對沉淀再次加熱并離屯、， 合并上清液，則可分離得到與經血管生成抑制因子1功能區蛋白有親和力的ssDNA次級文 庫;所述2 X結合緩沖液為20 X結合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述1 X結合緩沖 液為20 X結合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液;所述20 X結合緩沖液配方為1M NaCl、 50mM KCl、500mM Tris-肥l、10mM MgC12、pH 7.4。
[0024] 2.2.2ssDNA與經血管生成抑制因子1功能區蛋白的結合、分離，具體方法如下：
[0025] 將步驟2.2.1分離得到的能與經血管生成抑制因子1功能區蛋白結合的ssDNA，再 與10化1經血管生成抑制因子1功能區蛋白搖床結合30min，后續步驟同步驟2.2.1，則可分 離到與經血管生成抑制因子1功能區蛋白都有親和力的ssDNA次級文庫。
[0026] 2.2.3不對稱PCR擴增ssDNA，具體方法如下：
[0027] 對步驟2.2.2分離獲得的ssDNA次級文庫進行不對稱PCR擴增，總體積為25μ1的不 對稱PCR擴增體系為：10XPCR緩沖液:2μ1;Ρ1 (ΙΟμΜ):化1;Ρ2(0.2μΜ):化1;dNTP(各2.5mM): 0.4μ1 ;MgCl2(25mM): 1.2μ1; ssDNA模板（0.2ygAU): 2μ1; Taq DNA聚合酶（5ιι/μ1): 0.2μ1; d地20:17.241少〔1?反應參數:94°(：預變性4111111，然后進行40個循環94°(：變性3〇3,58°(：退火 30s，72°C 延伸 20s，最后 72°C 延伸 7min;
[002引 2.2.4親和力的測定，具體方法如下：
[0029] 2.2.4.1擴增：用帶有地高辛標記的引物P1不對稱PCR擴增篩選出來的ssDNA次級 文庫，擴增條件和參數與步驟2.2.3的不對稱PCR擴增體系和參數相同；
[0030] 2.2.4.2與蛋白結合:取步驟2.2.4.1擴增所得的PCR產物10化L，95 °C變性5min，冰 浴lOmin后加入10化L蛋白中，充分混合，在室溫下結合30min，然后6000巧m離屯、，分離蛋白 與上清液，蛋白中包含有與蛋白中結合的帶地高辛標記的ssDNA，上清液中是未結合的 ssDNA，同時做一不加 ssDNA的空白，即用2 X結合緩沖液代替PCR產物，同樣進行上述操作；
[0031] 2.2.4.3洗涂:將蛋白用1 X結合緩沖液50化L洗涂1次，600化pm離屯、，棄上清，取蛋 白；
[0032] 2.2.4.4與酶標兔抗地高辛抗體結合:在蛋白中加入10化L 1:900TBS稀釋的過量 的酶標兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應lOmin，使之與蛋白中的地高辛標記的ssDNA結 合；
[0033] 所述TBS為0.5M Tris-化C1溶液，配制方法為：先水溶8.5~9g NaCl，再加化13- 肥1 (0.5M、抑7.6)溶液100ml，最后加水定容至1L;0.5M Tris-HCl(pH7.6，100ml)溶液配制 方法:稱取Tris 6.06g，加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃肥1調抑至7.6，定容至100ml。
[0034] 2.2.4.5洗涂:600化pm離屯、，去上清，再用1 X結合緩沖液50化L洗涂3次，得蛋白； [00巧]2.2.4.6TMB(四甲基聯苯胺）顯色：加入40化L雙蒸水重懸蛋白，再加入20化L TMB 顯色液，避光顯色lOmin后，W2mol/L H2S04200化終止反應，測定450nm處的吸光值0D450， 該值即反映與菌結合的ssDNA的親和力，即OD結合，空白同樣進行上述步驟2.2.4.3， 2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6,得到空白相應的吸光度OD空白；
[0036] 所述TMB顯色液使用常規的配制方法配制。
[0037] 2.2.4.7測定PCR產物中DNA的摩爾濃度:取步驟2.2.4.1擴增所得的PCR產物，W已 知濃度梯度的初始ssDNA文庫為標準品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用漠化乙錠 瓊脂糖凝膠電泳法定量測定PCR產物中的DNA含量，獲得相應DNA的摩爾濃度，進而可W計算 出10化1 PCR產物中的DNA摩爾數。
[003引 2.2.4.8計算相應文庫的親和力：
[0039]
[0040] 2.3重復篩選，具體方法為：W每一輪不對稱PCR的產物作為下一輪的篩選文庫，重 復上述SELEX篩選步驟2.2,直到親和力不再上升為止，最后經過16輪的篩選得到ssDNA的適 配子富集文庫。經不對稱PCR擴增后，條件同前面的步驟，克隆并測序，得到拷貝數最高的20 個有效的ssDNA，將20個適配子分別進行親和特異性驗證，得到10個對經血管生成抑制因子 1功能區蛋白有較好親和特異性的寡核巧酸序列(適配子），具體序列如下：
[0041]
[0043] 親和力具體數據如下：
[0044]
[0045] ~~2.4、分析20條適配子的特異性和親和性 ' '
[0046] 巧光標記的適配子序列與經血管生成抑制因子1功能區蛋白解育，進行流式細胞 分析檢測，其中10條序列顯示了高巧光強度，使用GraphPad Prism5.0軟件針對飽和曲線做 非線性回歸曲線，分別對10條高親和性適配子序列采用相同的實驗操作，得到了每條是配 置的Kd值：
[0047] _
[004引其中K20的Kd值最小，說明與祀蛋白可W快速結合并且結構穩定不易分離。采用 DNAMAN軟件構建了 10條適配子的二級結構并計算了他們的最小自由能，其結構最小自由能 也都較小，結構也相對穩定。
[0049] 2.5適配子特異性分析
[0050] 分別采用BSA、人血紅蛋白、經血管生成抑制因子1功能區蛋白與10條適配子進行 特異性檢測，經過結合試驗發現，運10條序列都不與BSA或人血紅蛋白相結合，而只與經血 管生成抑制因子1功能區蛋白結合保持較高的特異性。
【主權項】
1. 一種用于適配子篩選的鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白，其序列為SEQ ID NO: 1所 不。2. -種識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核苷酸序列，其特征在于其序列為 SEQIDNo.5**。3. 權利要求2所示的寡核苷酸序列用于篩選鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的應用。
【專利摘要】一組能識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的適配子及其制備方法。寡核苷酸序列包括SEQ？ID？No.2～11，其分別具有較高的親和特異性，可以用于鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的檢測。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/115, C07K14/46
【公開號】CN105669852
【申請號】CN201610101402
【發明人】張壘, 張勇
【申請人】張勇
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年6月6日