本發明涉及生產腐胺的能力提高的重組微生物，以及利用所述微生物生產腐胺的方法。

背景技術：
腐胺(或1,4-丁二胺)是如亞精胺和精胺等的一類聚胺，存在于革蘭氏陰性細菌和真菌中。由于在各種物種中腐胺存在的濃度范圍很大，因此估計其在微生物代謝中起著重要作用。腐胺通常采用化學合成的方法，通過源于丙烯的琥珀腈和丙烯腈生產。所述化學合成采用衍生自石油化學品的物質作為起始原料，還利用有毒的化學物質，因此，該方法不是環境友好的而且具有石油消耗的問題。為了解決這些問題，很多研究試圖開發利用微生物來生物合成腐胺的方法，這種方法對環境更友好并減少能源消耗。根據現有的知識，可通過兩種微生物途徑生物合成腐胺。一種途徑是，谷氨酸鹽產生鳥氨酸，而鳥氨酸脫羧基合成腐胺。另一種途徑是，鳥氨酸合成精氨酸，通過精氨酸產生胍丁胺，然后再從胍丁胺合成腐胺。此外，其他合成腐胺的方法利用轉化有參與已知腐胺合成途徑的酶的目標微生物。例如，WO09/125924公開了高收率生產腐胺的方法，該方法使大腸桿菌(E.coli)中參與腐胺分解和利用的途徑失活、使作為腐胺前體的鳥氨酸轉化為精氨酸的途徑失活、和增強鳥氨酸的生物合成途徑。一篇在2010年出版的文獻公開了一種生產高濃度腐胺的方法，所述方法將使鳥氨酸轉化為腐胺的蛋白導入不產腐胺的棒狀桿菌(Corynebacterium)菌株，并提高其活性。此外，還公開了從精氨酸產生腐胺的方法，該方法將源自大腸桿菌的精氨酸脫羧酶和胍丁胺酶(agmatinase)引入菌株。就此而言，鳥氨酸途徑的腐胺產量是精氨酸途徑的約50倍(Schneider等.,Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859-868,2010)。

技術實現要素：
技術問題在此背景中，本發明人發現，通過弱化或除去NCgl0101蛋白的活性，可以在棒狀桿菌屬的微生物中高收率地生產腐胺，從而完成本發明。技術方案本發明的目的之一是提供能高收率地生產腐胺的棒狀桿菌屬的重組微生物，所述微生物經修飾而具有相比于內源活性得到弱化的NCgl0101活性。本發明的另一目的是提供利用該微生物產生腐胺的方法。有益效果當利用產腐胺能力提高的本發明棒狀桿菌屬微生物來產生腐胺時，其經修飾，從而與內源活性相比，弱化了NCg10101活性，因此，其能高收率地產生腐胺。因此，所述微生物可廣泛用于更有效地產生腐胺。附圖說明圖1是顯示編碼NCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103和NCgl0104的基因在野生型谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032菌株的染色體(chromosome)上相對位置的示意圖；和圖2顯示了在本發明制備的重組菌株之間作生長比較的測試結果，其中，1、2、3、4、5和6是將pHC139T、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103和pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104分別引入KCCM11138P而制備的菌株。最佳方式為實現上述目的，在一方面，本發明提供產生腐胺能力提高的棒狀桿菌屬重組微生物，與內源活性相比，所述微生物經弱化或除去NCg10101蛋白的活性而得以修飾，所述蛋白具有SEQIDNO.17或SEQIDNO.19所示氨基酸序列。本文所用的術語“NCg10101”表示顯示出金屬依賴酶活性的蛋白，其在谷氨酸棒狀桿菌中表達，其功能尚未完全了解。其包括肽酶M20家族或氨基苯甲酰基-谷氨酸利用蛋白(AbgB)的金屬結合域或氨基丙氧基。大腸桿菌的AbgB構成含AbgB的氨基苯甲酰基-谷氨酸水解酶，將氨基苯甲酰基-谷氨酸水解成氨基苯甲酸鹽和谷氨酸鹽。氨基苯甲酸鹽已知用作葉酸合成的前體，但其與腐胺產生的關系尚未知。本發明的NCgl0101蛋白可包含SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示氨基酸序列。然而，不限于此，因為根據微生物種類或菌株，該蛋白的氨基酸序列可能有所不同。換言之，其可以是突變型蛋白或人工變體，所述突變型蛋白或人工變體的氨基酸序列在SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示氨基酸序列的一個或多個位置包含一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通過弱化該蛋白的活性而提高產腐胺能力。本文的“幾個”可根據蛋白中氨基酸殘基的三維結構的位置或類型而有所不同，但尤其表示2-20，特別是2-10，更特別是2-5。此外，根據微生物的個體或種類，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工變體或天然突變所致的那些。編碼本發明氨基酸序列的多核苷酸可包括編碼以下蛋白的多核苷酸序列：具有SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示氨基酸序列的蛋白，或者其氨基酸序列與SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示氨基酸序列有80％或更高、特別是90％或更高、更特別是95％或更高、尤其是97％或更高同源性的蛋白，只要該蛋白具有與NCg10101蛋白相似的活性。最特別的是SEQIDNO:16或SEQIDNO:18所示多核苷酸序列。術語“同源性”表示兩條氨基酸序列之間的同一性，其可采用本領域技術人員熟知的方法檢測，采用BLAST2.0來計算諸如評分、同一性和相似性等參數。此外，本發明的編碼NCg10101的多核苷酸序列可與SEQIDNO:16所示多核苷酸或由其制備的探針在“嚴格條件”下雜交，也可以是編碼能正常起作用的NCg10101蛋白的經修飾的多核苷酸。本文所用的“嚴格條件”是指允許多核苷酸間進行特異性雜交的條件，具體描述于，例如，《分子克隆》(實驗室手冊，J.Sambrook等編，第二版，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，1989)或《最新分子生物學方法》(F.M.Ausubel等編，JohnWiley&Sons公司，紐約)。例如，在65℃的雜交緩沖液中進行雜交(3.5×ssc，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mMNaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mMEDTA)。SSC是pH為7的0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉。雜交之后，在室溫下用2×SSC清洗轉移了DNA的膜，然后在68℃下采用0.1-0.5×ssc/0.1×SDS進行清洗。可通過以下方式弱化本發明NCg10101蛋白的活性：1)編碼該蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修飾表達調控序列以降低該多核苷酸的表達，3)修飾染色體上的序列或4)它們的組合。在上文中，可利用染色體基因插入的載體，通過將編碼內源性靶蛋白的多核苷酸替換為標記基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸來實施編碼蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的長度可根據多核苷酸的種類而有所不同，但尤其是2bp-300bp，更特別是2bp-100bp，更特別是1bp-5bp。還可通過以下方式修飾表達調控序列來降低多核苷酸表達：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在表達調控序列中誘導突變以進一步弱化表達調控序列的活性，或將表達調控序列替換成活性更低的序列。表達調控序列包括編碼啟動子的序列、操縱子序列、核糖體結合位點和控制轉錄和翻譯終止的序列。此外，可通過以下方式修飾染色體上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在序列中誘導突變以進一步弱化該序列的活性，或將多核苷酸序列替換成經修飾的序列以便獲得更弱的蛋白活性。同時，還可進一步修飾產腐胺能力增強的本發明棒狀桿菌屬微生物，從而相比于內源活性，弱化參與鳥氨酸合成精氨酸的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(ArgF)的活性和參與谷氨酸輸出的蛋白(NCg10101)的活性。此外，可通過額外導入鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性來修飾棒狀桿菌屬微生物。相較于內源性活性，還可進一步修飾棒狀桿菌屬微生物以增強乙酰谷氨酸合酶將谷氨酸轉化成乙酰谷氨酸的活性，增強鳥氨酸乙酰轉移酶(ArgJ)將乙酰鳥氨酸轉化為鳥氨酸的活性，增強乙酰谷氨酸激酶(ArgB)將乙酰谷氨酸轉化為乙酰谷氨酰磷酸的活性，增強乙酰γ谷氨酰磷酸還原酶(ArgC)將乙酰谷氨酰磷酸轉化為乙酰谷氨酸半醛的活性，和增強乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(ArgD)將乙酰谷氨酸半醛轉化為乙酰鳥氨酸的活性，藉此增強作為腐胺前體的鳥氨酸的生物合成途徑(SakanyanV等.,Microbiology.142:1,99-108,1996)。在此例中，ArgF、NCg11221、ODC、ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD可分別具有(但不特定限于)SEQIDNO.:20、21、22、23、24、25、26所示的氨基酸序列，或與這些序列有80％或更高、特別是90％或更高、更特別是95％或更高，尤其是97％或更高的同源性的氨基酸序列。本文所用的術語“鳥氨酸脫羧酶(ODC)”是指利用鳥氨酸產生腐胺的酶，ODC需要磷酸吡哆醛(吡哆醛5'-磷酸，PLP)作為輔酶。ODC見于大部分革蘭氏陰性菌，也可見于一些腸道細菌，例如革蘭氏陽性細菌-乳酸菌。大腸桿菌有兩種編碼ODC的基因，其一為speC，在特定濃度下持續表達，而另一種speF則在特定條件(在有高于一定濃度的鳥氨酸存在下以及低pH下)下表達。根據物種不同，某些物種，如大腸桿菌有兩種ODC，而其他僅有一種。諸如埃希氏菌屬(Escherichiasp.)、志賀氏菌屬(Shigellasp.)、枸櫞酸桿菌屬(Citrobactersp.)、沙門氏菌屬(Salmonellasp.)和腸桿菌屬(Enterobactersp.)等物種有兩種ODC(speC,speF)，而耶爾森式菌屬(Yersiniasp.)、克雷白氏菌屬(Klebsiellasp.)、歐文氏菌屬(Erwiniasp.)等菌株則有一種ODC(speC)。在乳酸菌中，ODC由一種基因(speF)表達，其可以在低pH值或充足的鳥氨酸和組氨酸的條件下誘導表達。可利用源自多個不同物種的ODC編碼基因將ODC的活性引入本發明的棒狀桿菌屬重組微生物。編碼ODC的多核苷酸可包括(但不限于)編碼由以下氨基酸序列組成的蛋白的多核苷酸：SEQIDNO.:22所示氨基酸序列，或者與該氨基酸序列有70％或更高、特別是80％或更高，更特別是90％或更高同源性的氨基酸序列。此外，可通過本領域熟知的各種方法將鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性引入微生物；例如，將包含ODC編碼核苷酸序列的多核苷酸插入染色體的方法，通過引入載體系統而將多核苷酸導入微生物的方法，將經修飾或活性增強的啟動子插入ODC編碼核苷酸序列上游的方法，和對ODC編碼核苷酸序列插入突變的方法。更特別是，如果引入了ODC的編碼核苷酸序列，可利用已知的CJ7啟動子作為啟動子來控制其表達。此外，可通過以下方式實現ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD活性的增強：1)增加編碼酶的多核苷酸拷貝數；2)修飾表達調控序列以提高多核苷酸的表達；3)修飾染色體上酶的編碼多核苷酸序列以增強所述酶的活性；或4)以上的組合。在方法1)中，可通過將多核苷酸操作性連接于載體，或將其插入宿主細胞的染色體來實現編碼酶的多核苷酸拷貝數增加。更具體地，可通過引入能夠獨立復制并行使功能的載體來增加宿主細胞的多核苷酸拷貝數，其中，編碼本發明酶的多核苷酸操作性相連；或可通過引入能夠將多核苷酸插入宿主細胞染色體的載體來增加宿主細胞的多核苷酸拷貝數，其中所述多核苷酸操作性相連。本文所用的術語“載體”是指含有靶蛋白編碼多核苷酸的核苷酸序列的DNA構建物，其操作性連接于合適的調控序列以在合適的宿主中表達靶蛋白。調控序列包括引發轉錄的啟動子、控制轉錄的任何操縱序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列和控制轉錄和翻譯終止的序列。所述載體可轉染入適合的宿主，然后獨立于宿主基因組進行復制和行使功能，其自身可整合入染色體。在本發明中，可利用本領域已知的任何載體，而無任何特殊限制，只要其能在宿主中復制。常用載體的例子是自然狀態或重組狀態下的質粒、黏粒、病毒和噬菌體。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌體載體或黏粒載體，而pBR系統、pUC系統、pBluescriptII系統、pGEM系統、pTZ系統、pCL系統和pET系統可用作質粒載體。可用于本發明的載體沒有特殊限制，可利用已知的表達載體。具體地說，可利用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體。更具體是，可利用pACYC177、pCL、pCC1BAC載體。此外，可將編碼靶蛋白的多核苷酸插入宿主細胞染色體的載體可以具體是，例如，穿梭載體pECCG112(韓國專利公開號No.)，其能在大腸桿菌和棒狀菌(Coryneformbacteria)中自我復制，但不限于此。此外，可利用染色體基因插入的載體將染色體中靶蛋白的編碼多核苷酸替換成新的多核苷酸。可通過本領域任何已知的方法實現多核苷酸插入染色體，例如，通過同源重組。由于可通過誘導同源重組將本發明載體插入染色體，可額外包含選擇標記來確認基因成功插入染色體。選擇標記用于篩選轉化有載體的細胞，換言之，為了確定目標多核苷酸是否插入。可利用可提供可選擇表型的標記，所述表型是例如藥物抗性、營養缺陷型、對有毒物質的耐受性或表面蛋白的表達。在用選擇性物質處理的環境中，只有表達選擇性標記的細胞可以存活，或者細胞顯示不同表型，因此可通過這種方法來選擇成功轉化的細胞。如本文所用，術語“轉化”是指將含有靶蛋白的編碼多核苷酸的載體引入宿主細胞，從而該蛋白可以在該細胞中表達。轉化的多核苷酸包括編碼靶蛋白的所有多核苷酸，其能在宿主細胞中表達而無論其定位，是插入宿主細胞的染色體還是定位在染色體外。此外，所述多核苷酸包括編碼靶蛋白的DNA和RNA。可引入任何形式的多核苷酸，只要其能引入宿主細胞并表達。例如，可采用表達盒的形式(基因構建物)將多核苷酸引入宿主細胞，其含有自我表達所需的所有必須元件。所述表達盒通常包括操作性連接于多核苷酸的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點和翻譯終止信號。表達盒可以是能夠自我復制的表達載體的形式。此外，多核苷酸可以其自身的形式引入宿主細胞，并操作性連接于宿主細胞表達所需的序列。本文所用的術語“操作性連接”是指在啟動或介導編碼靶蛋白的多核苷酸轉錄的啟動子序列與所述多核苷酸之間的功能性連接。此外，可如下實施方法2)，修飾表達調控序列以增強本發明多核苷酸的表達：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代、或其組合在序列中引入突變，或替換成活性增強的核苷酸序列。所述表達調控序列包括啟動子、操縱序列(operatorsequence)、核糖體結合位點編碼序列和控制轉錄和翻譯終止的序列。可將強異源啟動子連接于多核苷酸表達單元(unit)的上游以取代原始啟動子。強啟動子的例子有pcj7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等，更具體是，操作性連接源自棒狀桿菌的lysCP1啟動子或pcj7啟動子以增強酶的編碼多核苷酸表達。在本文中，lysCP1啟動子是通過天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶的編碼多核苷酸的啟動子區域核苷酸序列取代獲得的增強啟動子，通過增強天冬氨酸激酶基因的表達，其足夠強從而將相應酶的活性相比于野生型提高了5倍(國際申請公開號)。此外，鑒定到pcj7啟動子在產氨棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)和埃希氏菌(Escherichia)中表達并具有強啟動子活性，其在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中也能高強度表達(韓國專利號0620092)。此外，可如下所述(但不特別限于此)實施方法3)，修飾染色體上的多核苷酸序列：通過核酸序列的缺失、插入、保守或非保守性替換或它們的組合來誘導序列突變以增強所述序列的活性，或通過活性增強的核苷酸序列作取代。本發明的微生物是具有產腐胺能力的微生物，包括原核微生物，其中表達包含SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示氨基酸序列的蛋白，其可以是，例如埃希氏菌屬(Escherichiasp.)、志賀氏菌屬(Shigellasp.)、枸櫞酸桿菌屬(Citrobactersp.)、沙門氏菌屬(Salmonellasp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、耶爾森式菌屬(Yersiniasp.)、克雷白氏菌屬(Klebsiellasp.)、歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)、乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、單胞菌屬(Sllenomanassp.)和弧菌屬(Vibriosp.)。本發明微生物具體是棒狀桿菌(Corynebacterium)屬微生物，更具體是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。在本發明的一實施方式中，保藏號為KCCM11138P的棒狀桿菌屬微生物(韓國專利公開號No.)得到修飾，其通過增強腐胺生物合成途徑而具有了產生高濃度腐胺的能力。具體地，產腐胺的菌株KCCM11138P是過度產生腐胺的菌株，其中，菌株ATCC13032缺失編碼鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(ArgF)的基因以便促進鳥氨酸累積和編碼谷氨酸轉運蛋白(glutamateexporter，NCgl1221)的基因以便增加細胞內谷氨酸，引入鳥氨酸脫羧酶(speC)的編碼基因，并增加鳥氨酸生物合成基因(argCJBD)的表達水平。在本發明的另一實施方式中，修飾了基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的腐胺產生菌株DAB12-a。該菌株ATCC13869基于與KCCM11138P相同的基因型，KCCM11138P是基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的腐胺產生菌株。具體地說，腐胺產生菌株DAB12-a來自從美國模式培養物保藏中心(ATCC)獲得的ATCC13869菌株，其中缺失鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(ArgF)的編碼基因、編碼蛋白NCgl1221以外運谷氨酸的基因，引入了源自大腸桿菌的鳥氨酸脫羧酶(ODC)編碼基因(speC)，而鳥氨酸生物合成基因操縱子(argCJBD)的啟動子替換為增強的啟動子。根據本發明的一實施方式，棒狀桿菌屬微生物(KCCM11138P)具有產腐胺的能力，該微生物通過以下方式制備：缺失鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(ArgF)的編碼基因和參與谷氨酸外運的谷氨酸轉運蛋白(NCgl1221)的編碼基因，替換編碼參與谷氨酸合成鳥氨酸的酶的ArgCJBD基因簇自身的啟動子，和將鳥氨酸脫羧酶(ODC)的編碼基因(speC)引入野生型谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體。基于KCCM11138P，選出在含有高濃度腐胺的培養基上生長良好的一克隆(A15)，證實選出的A15包含編碼NCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103和NCgl0104的基因(實施例1)。此外，由于5類基因中編碼NCg10101的基因，微生物在含有高濃度腐胺的培養基中生長(實施例2)。就NCg10101編碼基因的特征而言，證實在編碼NCg10101的基因過表達的菌株中腐胺產生降低(實施例3)，在編碼NCg10101的基因缺失的菌株中腐胺產生升高(實施例4)。因此，本發明人通過除去產生腐胺的菌株KCCM11138P中的NCg10101基因而制備得到產腐胺能力提高的谷氨酸棒狀桿菌菌株，將該菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌CC01-0244，保藏于韓國微生物保藏中心(下文簡寫為“KCCM”)，保藏日期2011年12月26日，登錄號KCCM11241P。為實現以上目的，在本發明的另一方面，本發明涉及生產腐胺的方法，包括以下步驟：培養產腐胺能力提高的棒狀桿菌屬微生物，該微生物經修飾以具有弱化的NCg10101蛋白活性，所述NCg10101蛋白具有SEQIDNO.17或SEQIDNO.19所示的氨基酸序列；和從以上步驟所得的培養液中分離腐胺。本發明的培養方法可在本領域已知的合適培養基和培養條件下實施。本領域技術人員可以根據所選的菌株方便地調整和采用培養方法。培養方法的例子包括(但不限于)分批、連續和補料分批培養。培養基必須適當地滿足具體菌株的要求。培養基必須適當地滿足具體菌株的要求。用于各種微生物的培養基描述于，例如，《通用細菌學方法手冊》(ManualofMethodsforGeneralBacteriology)，美國細菌協會(AmericanSocietyforBacteriology)，(華盛頓,哥倫比亞特區，美國，1981)。可利用以下作為培養基的碳源：糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素)，乳脂和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰油)，脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)，醇類(例如，丙三醇和乙醇)以及有機酸(例如，乙酸)等。這些物質可單獨或混合使用。可利用以下作為氮源：含氮有機化合物(例如，蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物，麥芽提取物，玉米漿，豆粕粉和尿素)或非有機化合物(例如，硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨)，而這些物質也可以單獨或混合使用。可利用以下物質作為磷源：磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或其相應的含鈉鹽。此外，培養基還可包括生長必要的金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)，最后，除了上述物質外，還可利用必要的生長促進物質，例如氨基酸和維生素。除培養基外，也可以加入合適的前體。進料物質可以在培養基中一次性提供或在培養過程中足量提供。可通過合適的堿性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)調節培養液的pH。可采用消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)來調節起泡情況。可引入氧氣或含氧氣體混合物，例如空氣來維持培養的需氧環境。培養溫度通常為20-45℃，特別是25-40℃。可以持續培養直至腐胺產生達到所需上限，通常在10-160小時內達到該目標。腐胺可釋放入培養基，或包含在細胞中。就收集和回收在本發明培養方法中產生的腐胺的方法而言，可根據培養方法(例如，分批、連續或補料分批培養)，采用本領域已知的合適方法從培養基中回收目標物質。本發明的實施方式下文將參照以下實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅作為舉例目的，本發明不應局限于這些實施例。實施例1：用于選擇腐胺生物合成的有效基因的文庫制備和克隆篩選為從野生型棒狀桿菌菌株的染色體中篩選腐胺生物合成的有效基因，制備野生型棒狀桿菌菌株的染色體文庫。詳細而言，用限制性酶Sau3AI隨機切割從野生型谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032菌株提取的染色體，從中選擇5-8kb的片段，然后克隆入大腸桿菌穿梭載體pECCG122(韓國專利公布號)以制備染色體文庫。為從如此制備的棒狀桿菌染色體文庫中選擇有效的腐胺生物合成基因，獲得在含有高濃度腐胺的培養基中生長的菌落。同時，將這些文庫引入具有產腐胺能力的棒狀桿菌屬微生物(KCCM11138P)，從而制備各轉化體。選擇能在含有0.35M腐胺(10g/l葡萄糖、0.4g/lMgSO4·7H2O、4g/lNH4Cl、1g/lKH2PO4、1g/lK2HPO4、2g/l脲、10mg/lFeSO4·7H2O、1mg/lMnSO4·5H2O、5mg/l煙酰胺、5mg/l鹽酸硫胺素、0.1mg/l生物素、1mM精氨酸、25mg/l卡那霉素、0.35M腐胺，pH7.0)的基本培養基中生長的轉化體。菌株KCCM11138P在本發明人申請的專利(韓國專利公布號)中披露，該菌株通過以下方式制備：缺失野生型谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC13032的染色體中編碼鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(ArgF)和谷氨酸轉運蛋白(NCgl1221)的基因，將源自大腸桿菌W3110菌株的鳥氨酸脫羧酶(ODC)的編碼基因(speC)引入染色體，和替換編碼參與谷氨酸合成鳥氨酸的酶的argCJBD基因簇的啟動子，從而制備各轉化體。結果為，選擇了275個菌落，隨后鑒定在含有高濃度腐胺的培養基中生長良好的菌落。獲得各文庫克隆并重新引入(產)腐胺菌株。隨后，鑒定在含有高濃度腐胺的培養基中生長良好的菌落，因而最終選擇了克隆(A15)。通過測序鑒定該選擇的克隆。結果為，證實該克隆包含NCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103和NCgl0104的總共5個ORF，其中除去了N-末端的436個氨基酸(圖1)。圖1是顯示NCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103和NCgl0104的編碼基因的相對位置的示意圖，這些基因在野生型谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032菌株的染色體上。實施例2：鑒定A15克隆中腐胺合成的有效基因實施例2-1：克隆A15克隆的5個基因和制備轉化體實施例1所得A15克隆的核苷酸序列已經知曉。基于以前報道的ATCC13032菌株的核苷酸序列，構建SEQIDNO.1和2所示的NCgl0100-F和NCgl0100-R作為擴增NCgl0100基因的引物，SEQIDNO.2和3所示的NCgl0100-R和tNCgl0100-F作為擴增tNCgl0100基因的引物(其中除去了N-末端的436個氨基酸)，SEQIDNO.4和5所示的NCgl0101-F和NCgl0101-R作為擴增NCgl0101基因的引物，SEQIDNO.6和7所示的NCgl0102-F和NCgl0103-R作為擴增NCgl0102和NCgl0103基因的引物，和SEQIDNO.8和9所示的NCgl0104-F和NCgl0104-R作為擴增NCgl0104基因的引物。此外，構建SEQIDNO.10和11所示的P(CJ7)-F和P(CJ7)-R作為擴增表達啟動子P(CJ7)(或pcj7)(韓國專利號10-0620092)的引物(表1)。隨后，利用ATCC13032菌株的染色體作為模板和SEQIDNO.1-9所示的各引物進行PCR(95℃下變性30秒，50℃下退火30秒，72℃下延伸1分鐘～1分30秒，25輪)，從而擴增5類基因片段。此外，利用產氨棒狀桿菌的染色體作為模板和SEQIDNO.10和11所示的引物進行PCR以擴增啟動子片段。將KpnI和XbaI切割的5種基因和EcoRV和KpnI切割的CJ7啟動子連接入EcoRV和XbaI切割的表達載體pHC139T(韓國專利號10-0860932)，從而制備總共5類表達載體，pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103和pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104。表1制備表達A15克隆所含5種基因的菌株的引物NCgl0100-F(SEQIDNO.1)GCGCATATGAGCTCAACAACCTCAAAAACCNCgl0100-R(SEQIDNO.2)GCGTCTAGATTATCCTTCGAGGAAGATCGCAGtNCgt0100-F(SEQIDNO.3)GCGCATATGTGGACGCTGATGGCTGCNCgl0101-F(SEQIDNO.4)GCGCATATGAGTACTGACAATTTTTCTCCACNCgl0101-R(SEQIDNO.5)GCGTCTAGACTAAGCCAAATAGTCCCCTACNCgl0102-F(SEQIDNO.6)GCGCATATGGATGAACGAAGCCGGTTTGNCgl0103-R(SEQIDNO.7)GCGTCTAGATTAATCAATGAAGACGAATACAATTCCNCgl0104-F(SEQIDNO.8)GCGCATATGGCGGGTGACAAATTGTGGNCgl0104-R(SEQIDNO.9)GCGTCTAGATTAGGACAGTTCCGCTGGAGCP(CJ7)-F(SEQIDNO.10)CAGATATCGCCGGCATAGCCTACCGATGP(CJ7)-R(SEQIDNO.11)GCGTCTAGAGATATCAGTGTTTCCTTTCG通過電穿孔將如此制得到的5類表達載體和對照組pHC139T引入實施例1的KCCM11138P菌株，然后接種于含有25μg/ml卡那霉素的BHIS平板以選擇轉化體。實施例2-2：找尋腐胺的有效基因采用于實施例1相同的方式從實施例2-1獲得的總共6類轉化體中選擇在含有高濃度腐胺的培養基中良好生長的轉化體(圖2)。圖2是在本發明所制備轉化體之間比較生長情況的測試結果，其中1、2、3、4、5和6表示分別引入6類以下表達載體的菌株：pHC139T、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101、pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103和pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104。如圖2所示，僅有引入了pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101的轉化體(4號)在含有高濃度腐胺的培養基中顯示生長良好，因此選擇NCg10101作為腐胺生物合成的有效基因。實施例3：評估NCgl0101-過表達菌株產生腐胺的能力評估過表達NCg10101基因的菌株產腐胺的能力，該基因在實施例2中鑒定為有效基因。將pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101引入產腐胺菌株KCCM11138P來制備用于評估的菌株。通過電穿孔將實施例2-1制備的pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101和作為對照組的pHC139T載體引入產腐胺菌株KCCM11138P，然后接種于含有25μg/ml卡那霉素的BHIS平板以選擇轉化體。這些轉化體分別命名為KCCM11138P/pHC139T和KCCM11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101。30℃下，將如此選擇的這兩種轉化體在含有1mM精氨酸(1％葡萄糖、1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％牛肉提取物、0.25％NaCl、0.2％脲、100μl50％NaOH、2％瓊脂、pH6.8，每1L)的CM平板上培養24小時，然后將一接種環的細胞培養物接種在25ml表2所示含有25μg/ml卡那霉素的滴定培養基，30℃下以200rpm振蕩培養96小時。發酵期間，在培養基中加入1mM精氨酸培養所有制備的菌株。表2組成濃度(每1L)葡萄糖8％大豆蛋白0.25％玉米漿固體0.5％(NH4)2SO44％脲0.15％KH2PO40.1％MgSO47H2O0.05％生物素100μg鹽酸硫胺素3000μg鈣-泛酸3000μg煙酰胺3000μgCaCO35％結果如表3所示，當NCg10101過表達時，腐胺產量降低。表3菌株類型腐胺(g/L)KCCM11138P/pHC139T9.5KCCM11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl01015.1實施例4：評估NCg10101-缺失菌株產生腐胺的能力實施例4-1：用基于ATCC13032的腐胺產生菌株制備NCg10101缺失菌株根據實施例3，NCg10101過表達增加細胞在含有高濃度腐胺的培養基中生長，但降低腐胺產量。基于此結果，檢驗NCg10101缺失對產腐胺能力的影響。詳細地說，基于ATCC13032菌株的NCg10101核苷酸序列，構建SEQIDNO.12和13所示NCgl0101-del-F1_BamHI和NCgl0101-del-R1_SalI作為引物來獲得NCg10101的N-末端區域同源重組片段。構建SEQIDNO.14和15所示NCgl0101-del-F2_SalI和NCgl0101-del-R2_XbaI作為引物來獲得NCg10101的C-末端區域同源重組片段(表4)。采用這兩對引物，通過PCR制備NCg10101基因的N-末端和C-末端區域的片段。用BamHI&SalI和SalI&XbaI分別處理PCR產物，克隆入BamHI&XbaI處理的pDZ載體。克隆的質粒命名為pDZ-NCgl0101(K/O)。表4制備NCgl0101-缺失菌株的引物NCgl0101-del-F1_BamHI(SEQIDNO.12)CGGGATCCCGGATTCCCTGCGATCATTGNCgl0101-del-R1_SalI(SEQIDNO.13)ACGCGTCGACCAGTCGACGGAACTTGTGGAGNCgl0101-del-F2_SalI(SEQIDNO.14)ACGCGTCGACGGCAACGACTCCGAAACCTTCNCgl0101-del-R2_XbaI(SEQIDNO.15)CTAGTCTAGACTGGATCCTCATGAATGCGC通過電穿孔將為獲得KCCM11138PΔNCgl0101菌株制備的pDZ-NCgl0101(K/O)載體引入KCCM11138P菌株，然后接種于含有25μg/ml卡那霉素的BHIS平板。通過觀察含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的固體培養基上的菌落是否為藍色來證實載體成功插入染色體。原代染色體插入菌株在營養培養基中振蕩培養(30℃，8小時)，然后從10-4稀釋到10-10，接種于含X-gal的固體培養基。雖然大多數菌落顯示為藍色菌落，但少部分的菌落顯示為白色菌落。最終篩選出了NCg10101基因-缺失的菌株，通過雙交換的白色菌落，利用SEQIDNO.12和15所示引物，通過PCR鑒定。如此鑒定的變體命名為KCCM11138PΔNCgl0101。實施例4-2：用基于ATCC13869的腐胺產生菌株制備NCg10101缺失菌株利用基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的腐胺產生菌株DAB12-a(argF-缺失、NCgl1221-缺失、引入大腸桿菌speC和arg操縱子-argCJBD啟動子-取代的菌株)制備NCg10101缺失菌株，前者與基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的產腐胺菌株KCCM11138P具有相同基因型。詳細地說，為鑒定源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的編碼NCg10101的基因和其所表達蛋白的氨基酸序列，利用谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板和一對引物SEQIDNO.12和15(NCgl0101-del-F1_BamHI、NCgl0101-del-R2_XbaI)進行PCR。本實施例中，PCR反應進行30輪：95℃下變性30秒，53℃下退火30秒，72℃下延伸2分鐘30秒。通過電泳分離PCR產物，并分析它們的序列。經序列分析，鑒定到源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的編碼NCg10101的基因包含SEQIDNO.18所示核苷酸序列，其編碼的蛋白包含SEQIDNO.19所示氨基酸序列。比較源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的NCg10101的氨基酸序列與源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的NCg10101的氨基酸序列時，二者顯示有98％的序列同源性。為缺失源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的NCg10101的編碼基因，采用谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板和表4所列的兩對引物，以實施例4-1相同的方式，通過PCR擴增NCg10101基因的N-末端和C-末端區域。然后，用BamHI&SalI和SalI&XbaI分別處理PCR產物，克隆入BamHI&XbaI處理的pDZ載體，藉此構建質粒pDZ-2’NCgl0101(K/O)。采用與實施例4-1相同的方式將質粒pDZ-2’NCgl0101(K/O)轉化入谷氨酸棒狀桿菌DAB12-a，選擇NCg10101編碼基因缺失的菌株。選擇的谷氨酸棒狀桿菌變體命名為DAB12-aΔNCgl0101。實施例4-3：評估NCg10101-缺失菌株產生腐胺的能力為研究NCg10101缺失對產腐胺菌株產生腐胺能力的影響，比較實施例4-1和4-2中制備的谷氨酸棒狀桿菌變體。詳細地說，采用與實施例3相同的方式評估兩類谷氨酸棒狀桿菌變體(KCCM11138PΔNCgl0101和DAB12-aΔNCgl0101)產腐胺的能力。如下表5所示，發現NCg10101缺失提高了腐胺產量。表5菌株類型腐胺(g/L)KCCM11138P9.8KCCM11138PΔNCgl010111.3DAB12-a10.1DAB12-aΔNCgl010111.0綜合來看，實施例3和4的結果顯示，在野生型谷氨酸棒狀桿菌菌株中，NCg10101編碼基因過表達降低腐胺產量，而該基因缺失增加了腐胺產量，表明NCg10101直接影響腐胺生物合成。因此，在上述實施例中本發明人通過缺失產生腐胺的菌株KCCM11138P中的NCg10101基因而制備得到產腐胺能力提高的谷氨酸棒狀桿菌菌株，將該菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌CC01-0244，并在2011年12月26日根據布達佩斯條約保藏于作為國際保藏機構的韓國微生物保藏中心(下文簡寫為“KCCM”)，登錄號KCCM11241P。基于以上描述，本領域技術人員應理解，可采用其他形式實施本發明，而不改變技術理念或必要技術特征。就此而言，上述實施例用于說明本發明的各方面，但不想要限制本發明的范圍。應理解，本發明的范圍包括從以下權利要求的含義、范圍和等同概念所衍生的任何改變和改進形式，而非以上的具體描述。