本(ben)發明屬于植(zhi)物分子生物學領域，特(te)別是轉(zhuan)基因農(nong)作物品種(zhong)培育(yu)領域。本(ben)發明涉及具有抗(kang)蟲(chong)抗(kang)草甘膦玉米轉(zhuan)化事件“雙(shuang)抗(kang)12-5”和“雙(shuang)抗(kang)12-15”及其特(te)異性(xing)檢測方(fang)法。

(二)

背景技術：

玉(yu)米(mi)(Zea mays)是一種(zhong)重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)(de)作物(wu)，是世界上(shang)很多地區的(de)(de)(de)(de)主要(yao)食物(wu)來源(yuan)。隨(sui)著(zhu)植物(wu)基因工(gong)程的(de)(de)(de)(de)發展，通過導(dao)入(ru)外源(yuan)基因來進行遺傳(chuan)改造成(cheng)為(wei)遺傳(chuan)育種(zhong)的(de)(de)(de)(de)主要(yao)手段之一。在玉(yu)米(mi)生(sheng)產中(zhong)，抗(kang)(kang)蟲(chong)和(he)(he)抗(kang)(kang)除(chu)草(cao)劑(ji)都是非常需要(yao)的(de)(de)(de)(de)農(nong)藝(yi)性狀(zhuang)。抗(kang)(kang)蟲(chong)轉基因玉(yu)米(mi)能夠大(da)幅(fu)度(du)地降低(di)化學(xue)殺蟲(chong)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)使用量，從而(er)降低(di)生(sheng)產成(cheng)本并且減少農(nong)藥對(dui)環境和(he)(he)農(nong)作物(wu)產品的(de)(de)(de)(de)污染(ran)。抗(kang)(kang)除(chu)草(cao)劑(ji)玉(yu)米(mi)可以大(da)幅(fu)度(du)降低(di)防治雜草(cao)所需要(yao)的(de)(de)(de)(de)農(nong)業勞動力，降低(di)勞動力的(de)(de)(de)(de)投入(ru)，減少雜草(cao)對(dui)玉(yu)米(mi)產量的(de)(de)(de)(de)影響。此外，利用除(chu)草(cao)劑(ji)防治雜草(cao)也更加(jia)有(you)利于推廣免耕技術，減少土壤和(he)(he)肥料(liao)的(de)(de)(de)(de)流失。因此抗(kang)(kang)蟲(chong)和(he)(he)抗(kang)(kang)除(chu)草(cao)劑(ji)性能在玉(yu)米(mi)生(sheng)產中(zhong)具有(you)突出的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)性。

轉化(hua)事(shi)件(jian)是由外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組插入(ru)位點(dian)的(de)(de)(de)上下游側翼區和(he)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)構成的(de)(de)(de)分子結(jie)(jie)構。通常，外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)轉化(hua)植(zhi)物可以得(de)(de)到(dao)一(yi)個(ge)(ge)轉化(hua)體(ti)群體(ti)，這(zhe)(zhe)個(ge)(ge)轉化(hua)體(ti)群體(ti)包含(han)大(da)量獨(du)立(li)的(de)(de)(de)事(shi)件(jian)，其中(zhong)(zhong)每個(ge)(ge)事(shi)件(jian)都是獨(du)特的(de)(de)(de)。外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)植(zhi)物中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)受到(dao)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)所插入(ru)的(de)(de)(de)染(ran)色(se)(se)體(ti)位置的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。這(zhe)(zhe)可能(neng)(neng)(neng)源(yuan)(yuan)自染(ran)色(se)(se)質結(jie)(jie)構或者整合位點(dian)附近轉錄調控元件(jian)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。相同基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)不同轉化(hua)事(shi)件(jian)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)水平具有很大(da)的(de)(de)(de)差(cha)異，在(zai)(zai)表(biao)達(da)(da)的(de)(de)(de)空間(jian)或時間(jian)模式上也可能(neng)(neng)(neng)存在(zai)(zai)差(cha)異。而且外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)插入(ru)也可能(neng)(neng)(neng)會影(ying)響(xiang)內源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)。因(yin)(yin)(yin)(yin)此，每個(ge)(ge)獨(du)立(li)轉化(hua)事(shi)件(jian)對受體(ti)植(zhi)物的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)都是不同的(de)(de)(de)。獲得(de)(de)能(neng)(neng)(neng)有效表(biao)達(da)(da)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，同時不影(ying)響(xiang)植(zhi)株本身農藝性(xing)狀的(de)(de)(de)植(zhi)物轉化(hua)事(shi)件(jian)在(zai)(zai)培育轉基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)作物新(xin)品(pin)種中(zhong)(zhong)具有重要的(de)(de)(de)應用價值。

目前(qian)并不清(qing)楚外(wai)源基(ji)因在(zai)植物中的插入位點整合規(gui)律，因此研發(fa)過(guo)程中需要產生(sheng)大量(liang)轉化體并從中篩選理想的轉化事(shi)件(jian)。通常(chang)需要產生(sheng)數(shu)百(bai)乃至(zhi)數(shu)千的不同(tong)轉化事(shi)件(jian)，并在(zai)這些轉化事(shi)件(jian)中篩選出具有預(yu)期(qi)轉基(ji)因表達水平(ping)和(he)模式(shi)的單一轉化事(shi)件(jian)。利用育(yu)種方法、體細胞原生(sheng)質融合技術可以將該轉化事(shi)件(jian)導入到不同(tong)遺傳背景的玉米基(ji)因組中，從而賦(fu)予玉米抗蟲抗草甘膦的能力。

通(tong)過(guo)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件專利對(dui)轉(zhuan)基因(yin)農(nong)作物進(jin)行知識產(chan)權保護(hu)是目前國(guo)際上通(tong)用(yong)方法，能夠進(jin)入商(shang)業(ye)(ye)化(hua)(hua)(hua)的(de)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件是從(cong)大量轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件中篩選(xuan)鑒定獲得，外源(yuan)基因(yin)與受(shou)體作物基因(yin)組(zu)特(te)(te)異位點(dian)整合，具(ju)有(you)獨特(te)(te)的(de)分(fen)子特(te)(te)征，同(tong)時外源(yuan)基因(yin)表達(da)規(gui)律與生產(chan)實(shi)(shi)際需要相(xiang)吻合，在基因(yin)分(fen)子特(te)(te)征和表達(da)規(gui)律上都(dou)與一(yi)般轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件不同(tong)，因(yin)此具(ju)有(you)明(ming)顯的(de)新穎性、實(shi)(shi)用(yong)性和創造性。目前，國(guo)際上商(shang)業(ye)(ye)化(hua)(hua)(hua)的(de)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件多獲得知識產(chan)權保護(hu)，部分(fen)轉(zhuan)化(hua)(hua)(hua)事(shi)件在中國(guo)申請并獲得專利保護(hu)。

(三)

技術實現要素：

本發明目的(de)(de)是(shi)提(ti)供(gong)優良的(de)(de)玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)膦轉(zhuan)化(hua)(hua)事件(jian)“雙(shuang)抗(kang)(kang)12-5”和“雙(shuang)抗(kang)(kang)12-15”，這(zhe)兩個獨立轉(zhuan)化(hua)(hua)事件(jian)所含(han)外源基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)設(she)計(ji)構思相同，是(shi)同個植物轉(zhuan)化(hua)(hua)載體(ti)(ti)侵染(ran)玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)后，通過篩選獲得的(de)(de)優良轉(zhuan)化(hua)(hua)事件(jian)，這(zhe)兩個轉(zhuan)化(hua)(hua)事件(jian)都可實(shi)現將外源基(ji)因(yin)(yin)引入到玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)品系中，賦(fu)予(yu)受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)具有抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)膦的(de)(de)能力；抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)膦基(ji)因(yin)(yin)外源基(ji)因(yin)(yin)在受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)中能夠(gou)穩定(ding)遺傳；抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)膦基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)表(biao)達對受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)(yu)(yu)米(mi)的(de)(de)農藝性狀不會產生(sheng)不良影響。

本(ben)發明(ming)提供一種(zhong)玉米轉化(hua)事件，所(suo)(suo)(suo)述轉化(hua)事件以(yi)SEQ ID NO.1所(suo)(suo)(suo)示(shi)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基因(yin)(yin)的(de)左側翼區(qu)，以(yi)SEQ ID NO.3所(suo)(suo)(suo)示(shi)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基因(yin)(yin)的(de)右側翼區(qu)或者以(yi)SEQ ID NO.14所(suo)(suo)(suo)示(shi)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基因(yin)(yin)的(de)左側翼區(qu)，以(yi)SEQ ID NO.15所(suo)(suo)(suo)示(shi)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基因(yin)(yin)的(de)右側翼區(qu)。所(suo)(suo)(suo)述外(wai)(wai)(wai)源(yuan)基因(yin)(yin)包括(kuo)抗(kang)蟲基因(yin)(yin)和(he)抗(kang)草(cao)甘膦基因(yin)(yin)，所(suo)(suo)(suo)述抗(kang)蟲基因(yin)(yin)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)SEQ ID NO.4所(suo)(suo)(suo)示(shi)，所(suo)(suo)(suo)述抗(kang)草(cao)甘膦基因(yin)(yin)的(de)核(he)(he)苷(gan)(gan)酸序(xu)(xu)列為(wei)(wei)SEQ ID NO.5所(suo)(suo)(suo)示(shi)。

進一步(bu)，優選(xuan)所述外源基因的核(he)苷酸序列(lie)為SEQ ID NO.2所示。

進(jin)一步，優選所述玉(yu)米(mi)轉化(hua)事件以(yi)SEQ ID NO.1所示的核(he)苷酸序(xu)(xu)列(lie)(lie)為(wei)外源(yuan)基因(yin)的左(zuo)(zuo)側翼(yi)區，以(yi)SEQ ID NO.3所示的核(he)苷酸序(xu)(xu)列(lie)(lie)為(wei)外源(yuan)基因(yin)的右側翼(yi)區，即(ji)本發明提供抗蟲抗草甘膦玉(yu)米(mi)轉化(hua)事件“雙(shuang)抗12-5”，其特(te)征DNA序(xu)(xu)列(lie)(lie)由外源(yuan)T-DNA插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.2、插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)左(zuo)(zuo)側翼(yi)區玉(yu)米(mi)基因(yin)組(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.1和(he)插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)右側翼(yi)區玉(yu)米(mi)基因(yin)組(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.3構成。

進一步，所述玉(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)件以(yi)SEQ ID NO.14所示(shi)的(de)核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)為外(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因(yin)的(de)左(zuo)側翼區(qu)，以(yi)SEQ ID NO.15所示(shi)的(de)核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)為外(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因(yin)的(de)右(you)側翼區(qu)，即本發明提供(gong)抗蟲抗草(cao)甘(gan)膦玉(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)件“雙抗12-15”，其特征DNA序(xu)(xu)列(lie)(lie)由外(wai)源(yuan)(yuan)T-DNA插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.2、插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)左(zuo)側翼區(qu)玉(yu)米(mi)基(ji)因(yin)組(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.14和(he)插入序(xu)(xu)列(lie)(lie)右(you)側翼區(qu)玉(yu)米(mi)基(ji)因(yin)組(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)SEQ ID NO.15構(gou)成(cheng)。

本發明所述玉(yu)米(mi)轉化(hua)(hua)事(shi)件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”是利(li)用(yong)(yong)農桿菌侵染法(fa)，將含有抗蟲抗草甘膦(lin)基(ji)(ji)因表達(da)框(kuang)的外源T-DNA序列導入玉(yu)米(mi)細胞中(zhong)，通過再(zai)生(sheng)含有外源基(ji)(ji)因的玉(yu)米(mi)細胞獲(huo)得玉(yu)米(mi)轉基(ji)(ji)因群體，并利(li)用(yong)(yong)分子(zi)生(sheng)物(wu)學和生(sheng)物(wu)測(ce)定的方(fang)法(fa)篩選(xuan)得到能夠滿足(zu)生(sheng)產(chan)需(xu)要(yao)的玉(yu)米(mi)轉化(hua)(hua)事(shi)件。

本發明提供的外源T-DNA含有抗(kang)蟲(chong)基因(yin)表(biao)達框和抗(kang)草甘膦基因(yin)表(biao)達框。

本發(fa)明提供的抗(kang)蟲(chong)(chong)基(ji)因表達框由玉米(mi)polyubiquitin-1基(ji)因啟動子(pZmUbi-1)、抗(kang)蟲(chong)(chong)融合基(ji)因cry1Ab-cry2Aj和(he)玉米(mi)PEP carboxylase基(ji)因(pepc)終止(zhi)子構成(cheng)。其中玉米(mi)polyubiquitin-1基(ji)因啟動子(pZmUbi-1)大(da)小為2.1kb，核苷酸(suan)(suan)序列為SEQ ID NO.7，是(shi)組成(cheng)型啟動子，可驅動目的基(ji)因在(zai)玉米(mi)所有組織中表達。PEP carboxylase基(ji)因(pepc)終止(zhi)子，來源于玉米(mi)，大(da)小為0.2kb，核苷酸(suan)(suan)序列為SEQ ID NO.8。

進一步(bu)，所(suo)述(shu)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)是(shi)(shi)cry1Ab和(he)(he)(he)cry2Aj的(de)融合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，核苷酸(suan)序列(lie)為SEQ ID NO.4，其中(zhong)，1-1947bp為cry1Ab的(de)核苷酸(suan)序列(lie)；1948-1965bp核苷酸(suan)序列(lie)為CCCGGGAAGGGTGGAGGA，編碼Cry1Ab和(he)(he)(he)Cry2Aj之間的(de)連接肽(tai)，連接肽(tai)序列(lie)為PGKGGG；1966-3861bp為cry2Aj改(gai)良基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)核苷酸(suan)序列(lie)。融合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)全長(chang)(chang)為3861bp，編碼的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序列(lie)為SEQ ID NO.6。所(suo)編碼的(de)蛋(dan)(dan)白質由1287個氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)組成，蛋(dan)(dan)白分(fen)子量大小為142.8kDa。Cry1和(he)(he)(he)Cry2是(shi)(shi)兩(liang)類被廣(guang)泛應用(yong)的(de)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，其中(zhong)Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1F和(he)(he)(he)Cry2Ab等在玉米(mi)(mi)(mi)、棉花中(zhong)已(yi)經(jing)大規模推(tui)廣(guang)應用(yong)，Cry1Ab是(shi)(shi)一種殺(sha)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)能(neng)力比(bi)較強的(de)Bt晶(jing)體殺(sha)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)蛋(dan)(dan)白質，特(te)別是(shi)(shi)其對(dui)玉米(mi)(mi)(mi)螟的(de)殺(sha)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)活性尤為高。Cry2Aj對(dui)主要農作(zuo)物鱗翅目害蟲(chong)(chong)(chong)(chong)具有(you)比(bi)較高的(de)殺(sha)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)能(neng)力，與目前(qian)生(sheng)產大量推(tui)廣(guang)的(de)Cry2Ab的(de)殺(sha)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)譜比(bi)較接近(jin)，氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序列(lie)也(ye)比(bi)較相(xiang)似。這些基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)安全性和(he)(he)(he)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)能(neng)力已(yi)經(jing)得到充分(fen)證明(ming)。本(ben)發(fa)明(ming)使用(yong)了cry1Ab和(he)(he)(he)cry2Aj的(de)融合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，其特(te)點是(shi)(shi)同時(shi)利用(yong)兩(liang)種不同的(de)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)Bt基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，并(bing)且它們在玉米(mi)(mi)(mi)中(zhong)表(biao)達量相(xiang)同。目前(qian)的(de)研究(jiu)認為，二個不同類型抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)同時(shi)表(biao)達有(you)可能(neng)減緩(huan)害蟲(chong)(chong)(chong)(chong)抗(kang)(kang)性的(de)發(fa)生(sheng)(Zhao et al.,2003,Nat.Biotechnol.21:1493-1497)，有(you)利于(yu)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)轉(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)玉米(mi)(mi)(mi)的(de)長(chang)(chang)期(qi)有(you)效利用(yong)。

本(ben)發明提(ti)供的(de)抗草(cao)甘膦表達框是由(you)花椰菜(cai)花斑病病毒(du)(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的(de)35S啟(qi)動子(zi)和玉米(mi)polyubiquitin-1基(ji)因(yin)啟(qi)動子(zi)組成的(de)復合啟(qi)動子(zi)(p35S-pZmUbi-1，核苷酸(suan)序列為(wei)(wei)SEQ ID NO.9)，5’端連有一(yi)段編碼(ma)AHAS基(ji)因(yin)葉(xie)綠體信號肽(tai)的(de)G10evo(EPSPS)(核苷酸(suan)序列為(wei)(wei)SEQ ID NO.5，編碼(ma)的(de)氨基(ji)酸(suan)序列為(wei)(wei)SEQ ID NO.10)和CaMV的(de)35S基(ji)因(yin)終(zhong)止子(zi)(SEQ ID NO.11)構成。

進一步，所述抗(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)基因是5-烯(xi)醇丙酮(tong)莽(mang)草(cao)酸-3-磷(lin)酸合成(cheng)酶(EPSPS)基因。草(cao)甘(gan)膦(lin)是一種廣譜滅(mie)生(sheng)(sheng)性(xing)除草(cao)劑，它(ta)通過抑制(zhi)植物(wu)中5-烯(xi)醇丙酮(tong)莽(mang)草(cao)酸-3-磷(lin)酸合成(cheng)酶的活性(xing)，導致植物(wu)不能(neng)合成(cheng)芳(fang)香族氨(an)基酸而死亡(wang)。為了方便雜草(cao)控制(zhi)，通過在作物(wu)轉入對(dui)草(cao)甘(gan)膦(lin)具有抗(kang)性(xing)的EPSPS可以使作物(wu)獲得抗(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)的能(neng)力，實現在農作物(wu)生(sheng)(sheng)長的同時選擇(ze)性(xing)地除草(cao)。

本(ben)發明(ming)還涉(she)及一種(zhong)含玉米轉化(hua)事件的重組載(zai)(zai)體，其含有本(ben)發明(ming)所(suo)述T-DNA插入序列(lie)。在一個實施方(fang)案中，所(suo)述載(zai)(zai)體圖譜如(ru)附圖1所(suo)示，載(zai)(zai)體序列(lie)為SEQ ID NO.13。

本(ben)發明(ming)提(ti)供(gong)一種(zhong)含玉米轉化事(shi)件的(de)重組(zu)細(xi)胞，重組(zu)細(xi)胞中含有本(ben)發明(ming)所述(shu)(shu)的(de)重組(zu)載體(ti)(ti)。在一個實施方案(an)中，所述(shu)(shu)重組(zu)細(xi)胞為含有本(ben)發明(ming)所述(shu)(shu)重組(zu)載體(ti)(ti)的(de)重組(zu)農桿菌細(xi)胞。

本發明提供用于(yu)檢測轉化(hua)事件(jian)“雙抗(kang)12-5”的(de)引(yin)物(wu)對，所(suo)述引(yin)物(wu)對由特異性識(shi)(shi)別(bie)T-DNA插入序(xu)列(lie)的(de)第(di)一引(yin)物(wu)和任意特異性識(shi)(shi)別(bie)SEQ ID NO.1或(huo)SEQ ID NO.3的(de)第(di)二引(yin)物(wu)組成。在一些(xie)實(shi)施方案中，所(suo)述第(di)一引(yin)物(wu)序(xu)列(lie)為：SP1或(huo)R1，所(suo)述第(di)二引(yin)物(wu)序(xu)列(lie)為：RB-Test或(huo)LB-test。

本發明(ming)提供一種鑒定(ding)玉米轉化事件“雙抗12-5”的方(fang)法，其包括：

1)從待(dai)鑒(jian)定的(de)玉米(mi)樣品提(ti)取基因組DNA；

2)以提取的DNA樣品為模板，使用本(ben)發(fa)明提供(gong)的引物對(dui)進行PCR擴增；

3)檢測(ce)PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)產物，如果擴(kuo)(kuo)增(zeng)產物長度與轉化事(shi)件上所述(shu)PCR引物對的序列(lie)之間的理論長度一致，則說(shuo)明所述(shu)樣品中含有“雙抗12-5”。

本發明還提供一種玉(yu)(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)件“雙抗12-5”特(te)異性(xing)的PCR鑒定(ding)方法，所(suo)述用于(yu)玉(yu)(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)件“雙抗12-5”特(te)異性(xing)PCR鑒定(ding)的引物(SP1和RB-Test是檢(jian)測外(wai)源基(ji)(ji)因右側是否與玉(yu)(yu)米(mi)基(ji)(ji)因組特(te)異性(xing)位(wei)點連接，R1和LB-test是檢(jian)測外(wai)源基(ji)(ji)因左側是否與玉(yu)(yu)米(mi)基(ji)(ji)因組特(te)異性(xing)位(wei)點連接)為(wei)：

SP1：5’-TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3’(SEQ ID NO.17)；

RB-Test：5’-CTCGTCATCGACCAAGTCATGAAG-3’(SEQ ID NO.18)。

R1：5’-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG-3’(SEQ ID NO.19)；

LB-test：5’-AAGACGTCCGGGGGAACCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.20)；

本(ben)發明(ming)所(suo)述(shu)PCR反(fan)應(ying)體系為：

PCR反應條件為：32個循環，每個循環是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

本發明(ming)提供用于(yu)檢測(ce)轉(zhuan)化事件(jian)“雙抗12-15”的(de)引(yin)物對，所述(shu)引(yin)物對由特異(yi)(yi)性(xing)識(shi)(shi)別T-DNA插入(ru)序(xu)列(lie)的(de)第(di)一(yi)引(yin)物和任意特異(yi)(yi)性(xing)識(shi)(shi)別SEQ ID NO.14或(huo)SEQ ID NO.15的(de)第(di)二引(yin)物組成。在一(yi)些(xie)實施方案(an)中，所述(shu)第(di)一(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)為：LB-15T或(huo)RB-15T，所述(shu)第(di)二引(yin)物序(xu)列(lie)為：LB-15G或(huo)RB-15G。

本(ben)發明提供一(yi)種鑒定玉米轉化事件“雙(shuang)抗(kang)12-15”的方法，其包括：

4)從(cong)待鑒(jian)定的玉米樣品提取基因(yin)組(zu)DNA；

5)以提(ti)取的DNA樣品為模板，使用(yong)本發明提(ti)供的引物對進行PCR擴(kuo)增；

6)檢測PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)產物，如果擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)產物長度與(yu)轉化事件(jian)上所述PCR引物對的序列之間(jian)的理(li)論

長(chang)度一致，則說(shuo)明所述樣品中含(han)有“雙抗(kang)12-15”。

本發明還提供一種玉米轉(zhuan)化(hua)(hua)事(shi)件“雙抗12-15”特(te)異(yi)性(xing)(xing)的PCR鑒定(ding)方法(fa)，所述(shu)用于玉米轉(zhuan)化(hua)(hua)事(shi)件“雙抗12-15”特(te)異(yi)性(xing)(xing)PCR鑒定(ding)的引物(RB-15T和RB-15G是(shi)檢(jian)測外源基因右側(ce)是(shi)否與(yu)玉米基因組(zu)特(te)異(yi)性(xing)(xing)位(wei)(wei)點(dian)連(lian)接(jie)，LB-15T和LB-15G是(shi)檢(jian)測外源基因左側(ce)是(shi)否與(yu)玉米基因組(zu)特(te)異(yi)性(xing)(xing)位(wei)(wei)點(dian)連(lian)接(jie))為：

LB-15T：5’-CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC-3’(SEQ ID NO.21)；

LB-15G：5’-GCCGTACGTTTCCCAGCC-3’(SEQ ID NO.22)。

RB-15T：5’-AGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGT-3’(SEQ ID NO.23)；

RB-15G：5’-CGTACAGGGAGCTTAGGGGG-3’(SEQ ID NO.24)；

本發明所述PCR反應(ying)體系為：

PCR反應條件為：32個循(xun)環(huan)，每個循(xun)環(huan)是95℃，45秒(miao)；65℃，50秒(miao)；72℃，30秒(miao)。

本(ben)發(fa)明提供一種所述(shu)(shu)玉(yu)(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)(shi)件(jian)在制備抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)玉(yu)(yu)米(mi)細(xi)胞(bao)中的(de)應用(yong)，利用(yong)含(han)(han)有所述(shu)(shu)玉(yu)(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)(shi)件(jian)的(de)玉(yu)(yu)米(mi)材(cai)料與(yu)玉(yu)(yu)米(mi)育種材(cai)料進(jin)行雜交(jiao)(jiao)后(hou)，進(jin)一步(bu)進(jin)行回交(jiao)(jiao)，獲得所述(shu)(shu)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)玉(yu)(yu)米(mi)細(xi)胞(bao)。具體利用(yong)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)轉化(hua)事(shi)(shi)件(jian)“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”培(pei)育抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)玉(yu)(yu)米(mi)的(de)方法，包括(kuo)：利用(yong)含(han)(han)有轉化(hua)事(shi)(shi)件(jian)“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”的(de)玉(yu)(yu)米(mi)材(cai)料與(yu)其它玉(yu)(yu)米(mi)育種材(cai)料進(jin)行雜交(jiao)(jiao)后(hou)，進(jin)一步(bu)進(jin)行回交(jiao)(jiao)，獲得含(han)(han)有本(ben)發(fa)明所述(shu)(shu)轉化(hua)事(shi)(shi)件(jian)“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”的(de)新材(cai)料。

本發明提供(gong)利(li)用抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草甘膦轉化(hua)事件(jian)“雙抗(kang)(kang)12-15”培育抗(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)草甘膦玉(yu)米(mi)的(de)(de)方(fang)法，包括(kuo)：利(li)用含有轉化(hua)事件(jian)“雙抗(kang)(kang)12-15”的(de)(de)玉(yu)米(mi)材(cai)料(liao)(liao)與其(qi)它玉(yu)米(mi)育種材(cai)料(liao)(liao)進(jin)行雜交后(hou)，進(jin)一(yi)步進(jin)行回(hui)交，獲得含有本發明所(suo)述轉化(hua)事件(jian)“雙抗(kang)(kang)12-15”的(de)(de)新材(cai)料(liao)(liao)。

本發明所述含“雙(shuang)抗(kang)12-5”轉化(hua)事件(即SEQ ID NO.12)的植物細胞，即玉蜀黍屬(shu)玉米Zeamays L.雙(shuang)抗(kang)12-5種子，保(bao)藏(zang)于中國典型(xing)培(pei)養物保(bao)藏(zang)中心，保(bao)藏(zang)號CCTCC NO：P201506，保(bao)藏(zang)日期：2015年4月27日，保(bao)藏(zang)地址：中國武漢武漢大學，郵編430072。

本發明所述含“雙抗12-15”轉化(hua)事件(即SEQ ID NO.16)的(de)植物細胞，即玉(yu)蜀(shu)黍屬玉(yu)米Zeamays L.雙抗12-15種(zhong)子，保(bao)藏于中(zhong)國典型(xing)培養(yang)物保(bao)藏中(zhong)心，保(bao)藏號CCTCC NO:P201607，保(bao)藏日期：2016年(nian)4月11日，保(bao)藏地址(zhi)：中(zhong)國武漢武漢大學，郵編430072。

與現(xian)(xian)有(you)技(ji)術相(xiang)比(bi)，本(ben)發明(ming)的(de)(de)(de)有(you)益效果主要體(ti)(ti)現(xian)(xian)在(zai)：本(ben)發明(ming)提供(gong)了優良的(de)(de)(de)轉(zhuan)化事件“雙(shuang)抗12-5”和(he)“雙(shuang)抗12-15”，所述轉(zhuan)化事件可實現(xian)(xian)將外源基(ji)(ji)因特(te)異性(xing)引(yin)入到玉(yu)(yu)米品系(xi)中，賦(fu)予(yu)受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)米具有(you)抗蟲(chong)抗草(cao)甘膦(lin)的(de)(de)(de)能(neng)力；抗蟲(chong)抗草(cao)甘膦(lin)基(ji)(ji)因在(zai)受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)米中能(neng)夠(gou)穩定遺傳；抗蟲(chong)抗草(cao)甘膦(lin)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)表達對受體(ti)(ti)玉(yu)(yu)米的(de)(de)(de)農(nong)藝性(xing)狀(zhuang)不會產生(sheng)不良影(ying)響。

(四)附圖說明

圖1、實(shi)施例(li)1含(han)目(mu)的基(ji)因的質粒結構(gou)圖，LB和RB：T-DNA的邊界(jie)序列；pZmUbi-1：玉(yu)米polyubiqutin-1啟(qi)動子(zi)(zi)；p35S：35S啟(qi)動子(zi)(zi)(CaMV病毒(du))；G10evo：抗草甘膦EPSPS基(ji)因；Cry1Ab-Cry2Aj：抗蟲Bt融合基(ji)因cry1Ab/cry2Aj。

圖2、雙抗(kang)12-5抗(kang)草甘膦基(ji)因(yin)的(de)Southern雜交(jiao)后(hou)的(de)熒光顯(xian)影圖；BamHI為基(ji)因(yin)組(zu)經(jing)BamHI單(dan)酶切；XbaI為基(ji)因(yin)組(zu)經(jing)XbaI單(dan)酶切；以(yi)地(di)高辛標記(ji)的(de)G10evo全長DNA作為探(tan)針雜交(jiao)到尼龍基(ji)質(zhi)膜(mo)上以(yi)后(hou)熒光顯(xian)影；圖右側(ce)為DNA長度標準(bp)標記(ji)，箭(jian)頭(tou)指(zhi)雜交(jiao)產生的(de)特異性條帶。

圖(tu)3、雙(shuang)抗(kang)12-5抗(kang)蟲基因(yin)的Southern雜(za)交后(hou)熒光(guang)顯影(ying)圖(tu)；KpnI為雙(shuang)抗(kang)12-5的基因(yin)組DNA經過KpnI酶切；SmaI為“雙(shuang)抗(kang)12-5”的基因(yin)組DNA經過SmaI酶切，地(di)高辛標(biao)(biao)記的Cry1Ab全(quan)長(chang)DNA作為探針，雜(za)交到尼龍基質膜上以后(hou)熒光(guang)顯影(ying)，圖(tu)右側為DNA長(chang)度標(biao)(biao)準(zhun)(bp)。

圖(tu)4、雙(shuang)抗12-15抗蟲基(ji)因(yin)的Southern雜交后的熒(ying)光顯影圖(tu)；SacI為(wei)基(ji)因(yin)組經SacI單酶(mei)(mei)切,AclI位(wei)雙(shuang)抗12-15基(ji)因(yin)組經AclI單酶(mei)(mei)切，M為(wei)DNA長度標(biao)準(bp).

圖(tu)5、雙抗12-15抗草甘膦基(ji)(ji)因的Southern雜交后的熒光顯影(ying)圖(tu)；BamHI為(wei)(wei)(wei)雙抗12-15基(ji)(ji)因組(zu)經BamHI單酶切(qie)；XbaI為(wei)(wei)(wei)雙抗12-15基(ji)(ji)因組(zu)經XbaI單酶切(qie)；以(yi)地高辛標記的G10evo全長(chang)DNA作為(wei)(wei)(wei)探針雜交到尼(ni)龍基(ji)(ji)質膜上以(yi)后熒光顯影(ying)；M為(wei)(wei)(wei)DNA長(chang)度(du)標準(bp)標記。

圖6、插入(ru)位點的PCR驗證電(dian)泳圖；1為(wei)(wei)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因玉米雙抗(kang)12-5左側(ce)翼(yi)PCR；2為(wei)(wei)非轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因對照(zhao)左側(ce)翼(yi)PCR；3為(wei)(wei)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因玉米右側(ce)翼(yi)PCR；4為(wei)(wei)非轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因對照(zhao)右側(ce)翼(yi)PCR；M為(wei)(wei)DNA大小標準(PCR產物在200-500bp之間)。

圖7、插入位點的PCR驗證(zheng)電泳(yong)圖；玉(yu)米(mi)“雙抗12-15”左側翼PCR；1和2為非轉(zhuan)基(ji)因(yin)對(dui)照；泳(yong)道3-6為轉(zhuan)基(ji)因(yin)玉(yu)米(mi)“雙抗12-15”；M為DNA大小標準(PCR產(chan)物在1170bp左右)。

圖(tu)8、插(cha)入位點的PCR驗證電泳圖(tu)；玉米“雙(shuang)抗(kang)12-15”右側翼PCR；1和2為非轉基因對(dui)照；泳道3-6為轉基因玉米“雙(shuang)抗(kang)12-15”；M為DNA大小(xiao)標準(PCR產物在(zai)600bp左右)。

圖9、雙抗(kang)12-5在受體玉(yu)米中的DNA遺傳穩定性檢測(ce)電(dian)泳圖；M為(wei)DNA大小(xiao)標準樣(yang)品(100bp梯度)；-為(wei)陰性對照(非轉(zhuan)基因(yin)玉(yu)米)；+為(wei)陽(yang)性對照(加入了經過(guo)序列測(ce)定驗(yan)證(zheng)的PCR陽(yang)性產(chan)物(wu)的非轉(zhuan)基因(yin)玉(yu)米樣(yang)品)；1，2，3，4，5，6，7分別是第1，2，3，4，5，6，7代(dai)的受體玉(yu)米樣(yang)品；PCR產(chan)物(wu)的預期大小(xiao)是145bp，與PCR產(chan)物(wu)電(dian)泳分析的大小(xiao)基本一致(zhi)。

圖10、“雙抗12-15”在受體(ti)玉米(mi)中的(de)(de)DNA遺傳(chuan)穩定性(xing)檢測電泳圖；M為(wei)DNA大小標準樣品(pin)(100bp梯度)；-為(wei)陰性(xing)對(dui)(dui)照(非轉基(ji)(ji)因(yin)玉米(mi))；+為(wei)陽(yang)性(xing)對(dui)(dui)照(加入(ru)了經(jing)過序(xu)列測定驗(yan)證的(de)(de)PCR陽(yang)性(xing)產(chan)物的(de)(de)非轉基(ji)(ji)因(yin)玉米(mi)樣品(pin))；1，2，3，4，5，6，7分別是(shi)第1，2，3，4，5，6，7代的(de)(de)受體(ti)玉米(mi)樣品(pin)；PCR產(chan)物的(de)(de)預期大小是(shi)1000bp，與PCR產(chan)物電泳分析的(de)(de)大小基(ji)(ji)本一(yi)致。

(五)具體實施方式

下面結合具體(ti)實施例(li)對本(ben)(ben)發明進行進一步(bu)描述(shu)，但本(ben)(ben)發明的保護范圍并不僅(jin)限于此：

實施(shi)例1：轉化事件的(de)獲得

(1)含有(you)外源基因的(de)質(zhi)粒載體的(de)獲得

本發明(ming)用于玉(yu)米轉(zhuan)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)載體圖譜如(ru)(ru)圖1所(suo)(suo)示(shi)(shi)(shi)，轉(zhuan)化(hua)質粒載體核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO.13，具(ju)體載體組成(cheng)(cheng)元件的(de)(de)(de)(de)(de)名稱(cheng)、位置如(ru)(ru)表(biao)(biao)1所(suo)(suo)示(shi)(shi)(shi)。其中(zhong)T-DNA基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO:2所(suo)(suo)示(shi)(shi)(shi)。SEQ ID NO:2包含完(wan)整的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)表(biao)(biao)達(da)框和(he)抗(kang)(kang)蟲表(biao)(biao)達(da)框，具(ju)體由如(ru)(ru)下部分(fen)組成(cheng)(cheng)，抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)表(biao)(biao)達(da)框：來源于CaMV的(de)(de)(de)(de)(de)35S啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)與玉(yu)米Polyubiqutin-1啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)形(xing)成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)復合啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)(核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ IDNO.9所(suo)(suo)示(shi)(shi)(shi))，該復合啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)驅(qu)動(dong)(dong)(dong)(dong)5’端連有(you)一段(duan)編碼AHAS基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)葉綠體信號肽的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)G10evo(EPSPS)(核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO.5所(suo)(suo)示(shi)(shi)(shi))，終止子(zi)(zi)是CaMV的(de)(de)(de)(de)(de)35S基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)終止子(zi)(zi)(長度為0.2kb，其核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO.11)。抗(kang)(kang)蟲表(biao)(biao)達(da)框：Cry1Ab-PGKGGG-Cry2Aj融合基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)，驅(qu)動(dong)(dong)(dong)(dong)Cry1Ab-Cry2Aj融合基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)為來源于玉(yu)米polyubiquitin-1基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)啟(qi)動(dong)(dong)(dong)(dong)子(zi)(zi)(pZmUbi-1)(通過PCR從玉(yu)米基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組獲(huo)得，大小(xiao)為2.1kb，核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO.7，pZmUbi-1可驅(qu)動(dong)(dong)(dong)(dong)目的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)所(suo)(suo)有(you)植(zhi)(zhi)物(wu)組織中(zhong)表(biao)(biao)達(da))，終止子(zi)(zi)為來源于玉(yu)米的(de)(de)(de)(de)(de)PEP carboxylase基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(pepc)終止子(zi)(zi)(大小(xiao)為0.2kb，核苷(gan)酸序(xu)列(lie)為SEQ ID NO.8)。利用電擊(ji)法(fa)(2500V)將獲(huo)得的(de)(de)(de)(de)(de)植(zhi)(zhi)物(wu)轉(zhuan)化(hua)質粒導(dao)入農(nong)桿(gan)菌LBA4404中(zhong)，獲(huo)得含有(you)植(zhi)(zhi)物(wu)轉(zhuan)化(hua)載體的(de)(de)(de)(de)(de)農(nong)桿(gan)菌。

表1玉米轉化載體(ti)組(zu)成元件的名稱(cheng)、位置和功能

(2)玉米遺傳轉化

本研(yan)究中(zhong)獲得玉(yu)米(mi)轉化(hua)事(shi)件所用的方(fang)法(fa)是(shi)農桿菌介導方(fang)法(fa)，根(gen)據Frame等報(bao)道的方(fang)法(fa)和培(pei)養基配方(fang)(Plant Physiol,2002,129:13-22)進(jin)行轉化(hua)，使用草甘膦為(wei)篩選試劑，具體步驟如下：

(1)取授粉后8～10天(tian)的親本(ben)玉米穗，收集大小(xiao)為1.0-1.5mm未成(cheng)熟胚。將(jiang)含有轉化載體的農桿(gan)菌與未成(cheng)熟胚在22℃共培養2-3天(tian)。

(2)將步驟(1)培養(yang)后的(de)未成熟胚轉移(yi)到(dao)含有終濃度200mg/L特美汀(ting)抗生素(葛(ge)蘭素史克，美國)的(de)愈(yu)傷組織誘導培養(yang)基(ji)上(shang)，28℃暗培養(yang)10-14天殺滅農桿菌。

(3)將步(bu)驟(2)誘導培(pei)養(yang)后的(de)所有(you)(you)愈傷組織轉到含有(you)(you)終濃度2mM草(cao)甘膦的(de)篩選(xuan)培(pei)養(yang)基上，28℃暗培(pei)養(yang)2-3周。

(4)轉移步驟(zou)(3)所(suo)有的愈傷組織到新(xin)鮮的含有(2mM)草甘膦的篩選(xuan)培(pei)養基(ji)上(shang)，28℃暗培(pei)養2-3周(zhou)。

(5)然后，轉移步驟(4)成活的胚性(xing)組織到再生培(pei)養(yang)基上，28℃暗培(pei)養(yang)10-14天，每(mei)皿一個株(zhu)系。

(6)轉移(yi)步驟(5)胚性組織到新鮮(xian)的(de)再生培養基上，26℃光(guang)照培養10-14天。

(7)轉移(yi)步驟(6)所有發(fa)育完全(quan)(quan)的植株(zhu)到生(sheng)根培養基上，26℃光照培養直到根發(fa)育完全(quan)(quan)，將(jiang)生(sheng)根后的再生(sheng)苗移(yi)植到溫(wen)室中生(sheng)長繁種(zhong)，用于(yu)篩選分析。

實施例2：轉化(hua)事件的篩(shai)選(xuan)

通過農桿菌介導獲得了240個抗(kang)(kang)蟲(chong)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)玉(yu)米(mi)(mi)獨立轉(zhuan)化(hua)體(ti)(實施(shi)例1)。根據(ju)載體(ti)序列(lie)(SEQID NO.13設計(ji)引(yin)物，用PCR方法篩選含(han)有(you)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)基(ji)因G10eve(核苷酸序列(lie)為(wei)(wei)SEQ ID NO.5所示)和抗(kang)(kang)蟲(chong)基(ji)因cry1Ab-cry2Aj(核苷酸序列(lie)為(wei)(wei)SEQ ID NO.4所示)，同時不含(han)載體(ti)骨架序列(lie)的(de)玉(yu)米(mi)(mi)轉(zhuan)化(hua)體(ti)，并在(zai)溫室中進行(xing)(xing)抗(kang)(kang)蟲(chong)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)性(xing)能的(de)初步(bu)測(ce)試：通過噴施(shi)0.4wt％的(de)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)，去除(chu)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)抗(kang)(kang)性(xing)差的(de)轉(zhuan)化(hua)體(ti)，在(zai)剩(sheng)余的(de)轉(zhuan)化(hua)體(ti)上接玉(yu)米(mi)(mi)螟，篩選沒有(you)玉(yu)米(mi)(mi)螟為(wei)(wei)害(hai)的(de)轉(zhuan)化(hua)體(ti)，共計(ji)獲得15個含(han)轉(zhuan)化(hua)事件編(bian)號為(wei)(wei)“雙(shuang)抗(kang)(kang)12-1”～“雙(shuang)抗(kang)(kang)12-15”的(de)具有(you)較(jiao)強抗(kang)(kang)蟲(chong)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)(lin)能力的(de)玉(yu)米(mi)(mi)轉(zhuan)化(hua)體(ti)。分別將含(han)雙(shuang)抗(kang)(kang)獨立轉(zhuan)化(hua)事件的(de)轉(zhuan)化(hua)體(ti)與玉(yu)米(mi)(mi)自(zi)交系B73雜交留種，進行(xing)(xing)隨后的(de)篩選分析。

(1)草甘膦抗性(xing)篩選

選擇15個含轉化(hua)事(shi)件(jian)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-1”-轉化(hua)事(shi)件(jian)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-15”的(de)轉化(hua)體的(de)T3和T5代轉基因(yin)玉米進行草(cao)甘(gan)膦(lin)抗(kang)性對(dui)比(bi)。轉基因(yin)玉米和親本(ben)非轉基因(yin)對(dui)照種子發芽后20-30天，長(chang)至4-5葉期，噴(pen)施(shi)終濃度(du)為(wei)0.4wt％的(de)草(cao)甘(gan)膦(lin)(農達(da)，孟山都公司，美國)，使用量為(wei)25L/畝，7天后記(ji)錄(lu)玉米生(sheng)長(chang)發育情況和死亡率。草(cao)甘(gan)膦(lin)噴(pen)施(shi)試驗結果如(ru)表(biao)2所示，轉基因(yin)品系都具有(you)明顯的(de)抗(kang)草(cao)甘(gan)膦(lin)能力。其(qi)中含有(you)轉化(hua)事(shi)件(jian)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-1”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-3”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-4”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-5”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-7”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-9”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-10”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-12”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-13”、“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-14”和“雙(shuang)(shuang)抗(kang)12-15”的(de)草(cao)甘(gan)膦(lin)抗(kang)性水平比(bi)較高。

表2.雙抗玉米草甘膦抗性試驗

(2)抗蟲能力測試

1)田間抗蟲(chong)能力測試

分(fen)(fen)別選擇15個(ge)含轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化事件“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-1”～“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-15”的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化體的T3和T5代轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基因玉(yu)米進行(xing)抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)性能(neng)分(fen)(fen)析。轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基因玉(yu)米和親本非轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基因對照溫室(shi)中發(fa)芽后(hou)20天噴灑終濃度(du)為0.4wt％的草甘膦(lin)確定是轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)基因后(hou)，各取10株(zhu)，每株(zhu)接1齡亞洲玉(yu)米螟10個(ge)，亞洲玉(yu)米螟來(lai)自中國農業(ye)科學院植物(wu)保護研究所(suo)玉(yu)米害(hai)蟲(chong)(chong)(chong)組。將卵(luan)塊至于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)條件下孵(fu)化，選取孵(fu)化12小時內(nei)的幼蟲(chong)(chong)(chong)供生測(ce)實(shi)驗用(yong)。接蟲(chong)(chong)(chong)6天后(hou)調查玉(yu)米螟為害(hai)情況，進行(xing)抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)分(fen)(fen)級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)。抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)分(fen)(fen)級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)采用(yong)9級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)標準(Marcon et al.,1999)：1～3級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：蟲(chong)(chong)(chong)孔(kong)針刺(ci)狀(1級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：稀(xi)少(shao)、分(fen)(fen)散；2級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：中等(deng)數(shu)(shu)量；3級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：大(da)量)。4～6級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：蟲(chong)(chong)(chong)孔(kong)火柴頭大(da)小(4級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：稀(xi)少(shao)、分(fen)(fen)散；5級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：中等(deng)數(shu)(shu)量；6級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：大(da)量)。7～9級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：蟲(chong)(chong)(chong)孔(kong)大(da)于火柴頭(7級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：稀(xi)少(shao)分(fen)(fen)散；8級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：中等(deng)數(shu)(shu)量；9級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)：大(da)量)。抗(kang)(kang)(kang)(kang)性級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)別分(fen)(fen)類：1～2級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(高抗(kang)(kang)(kang)(kang))，3～4級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong))，5～6級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(感(gan)蟲(chong)(chong)(chong))，7～9級(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(高感(gan))。結(jie)果如表3所(suo)示(shi)，“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-1”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-9”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-10”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-11”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-13”、“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-14”和“雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-15”具(ju)有(you)高抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲(chong)(chong)(chong)性能(neng)。

表(biao)3：不同(tong)轉化事件(jian)對玉(yu)米螟的抗(kang)性(xing)等級鑒定

2)實驗室抗蟲性能測試

分別選擇15個含轉化事件“雙抗12-1”～“雙抗12-15”的轉化體的T3和T5代轉基因玉米，在轉基因玉米和對照玉米心葉中期(6-8葉完全展開)選擇未完全展開的心葉葉片在實驗室進行玉米螟抗性測定。接玉米螟2天后調查取食面積和玉米螟死亡情況。結果見表4所示，結果顯示大部分轉基因玉米抗性良好。它們的葉片被取食非常少，特別是雙抗12-5、雙抗12-9、雙抗12-11、雙抗12-14和雙抗12-15接蟲2天后玉米螟取食面積不到10mm²。接蟲2天(tian)以(yi)(yi)后玉(yu)米螟死亡率在80％以(yi)(yi)上，4天(tian)以(yi)(yi)后大部分轉基因玉(yu)米螟死亡率到達100％。

表4：轉基(ji)因玉(yu)米心葉期對亞洲玉(yu)米螟(ming)的抗蟲性(xing)

注：表4中a、b表示差(cha)異(yi)顯著(zhu)

(3)外源基因插入拷(kao)貝(bei)數鑒定

綜合(he)抗(kang)(kang)(kang)蟲和(he)(he)抗(kang)(kang)(kang)草甘(gan)(gan)膦(lin)測(ce)定結果，選(xuan)擇抗(kang)(kang)(kang)蟲和(he)(he)耐草甘(gan)(gan)膦(lin)能力都比較強的(de)雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-1、雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-5、雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-9、雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-10、雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-14和(he)(he)雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-15進行外(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因插(cha)入拷貝(bei)數鑒定。使(shi)用羅氏公司(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II，Roche)進行Southern分(fen)析，遵照試(shi)劑盒(he)提供的(de)操作步(bu)驟進行雜交探針(zhen)制(zhi)作和(he)(he)DNA雜交檢測(ce)。即提取玉(yu)米基(ji)因組(zu)DNA，分(fen)別經(jing)過(guo)限(xian)制(zhi)性內切(qie)(qie)(qie)酶BamHI和(he)(he)XbaI酶切(qie)(qie)(qie)(這些限(xian)制(zhi)性內切(qie)(qie)(qie)酶在(zai)外(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因中(zhong)具(ju)有單(dan)個的(de)識別位點)，在(zai)瓊脂糖膠(jiao)上(shang)(shang)電泳分(fen)離酶切(qie)(qie)(qie)片段，然后(hou)將DNA轉移(yi)到尼龍(long)基(ji)質(zhi)膜(mo)上(shang)(shang)，利用地高辛標記的(de)G10eve(核苷酸序列SEQ ID NO.5)全(quan)長DNA作為探針(zhen)雜交到尼龍(long)基(ji)質(zhi)膜(mo)上(shang)(shang)以后(hou)熒光顯影。結果顯示轉化事件“雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-5”在(zai)BamHI酶切(qie)(qie)(qie)時獲(huo)(huo)得一(yi)條大約(yue)14kb的(de)信號(hao)帶，利用XbaI酶切(qie)(qie)(qie)時獲(huo)(huo)得大約(yue)5.0kb的(de)信號(hao)帶(圖2)，證(zheng)明“雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-5”中(zhong)抗(kang)(kang)(kang)草甘(gan)(gan)膦(lin)基(ji)因是單(dan)拷貝(bei)插(cha)入。轉化事件“雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-15”在(zai)BamHI酶切(qie)(qie)(qie)時獲(huo)(huo)得一(yi)條大約(yue)2.5kb的(de)信號(hao)帶，而在(zai)XbaI酶切(qie)(qie)(qie)時獲(huo)(huo)得大約(yue)8.7kb的(de)信號(hao)帶(圖5)，證(zheng)明“雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)12-15”中(zhong)抗(kang)(kang)(kang)草甘(gan)(gan)膦(lin)基(ji)因是單(dan)拷貝(bei)插(cha)入。

利(li)用(yong)(yong)T-DNA中右邊的(de)(de)抗蟲(chong)融合基因(yin)的(de)(de)Cry1Ab作為探(tan)針對“雙抗12-5”抗蟲(chong)基因(yin)拷貝數進(jin)行Southern雜(za)交分(fen)析，分(fen)別用(yong)(yong)限制性(xing)內(nei)切酶KpnI和SmaI對“雙抗12-5”的(de)(de)基因(yin)組DNA進(jin)行單酶切，在(zai)瓊脂糖膠上(shang)分(fen)離以(yi)后，轉移到(dao)尼龍基質膜上(shang)，然后利(li)用(yong)(yong)地(di)高辛(xin)標記的(de)(de)Cry1Ab(核苷(gan)酸(suan)序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作為探(tan)針雜(za)交到(dao)尼龍基質膜上(shang)以(yi)后熒光顯影。結果(guo)顯示，用(yong)(yong)KpnI酶切時獲得一條(tiao)大約7kb的(de)(de)信(xin)號帶，而在(zai)SmaI酶切時獲得大約6.5kb的(de)(de)信(xin)號帶(圖(tu)3)。

分(fen)別用限(xian)制性內切(qie)酶(mei)(mei)SacI和AclI對轉化事(shi)件(jian)“雙抗12-15”的基因(yin)組DNA進行單(dan)酶(mei)(mei)切(qie)，在瓊(qiong)脂糖膠上分(fen)離以后(hou)，轉移(yi)到(dao)尼龍基質(zhi)膜上，然后(hou)利用地高辛標記的Cry1Ab(核苷酸序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作為(wei)探針雜交到(dao)尼龍基質(zhi)膜上以后(hou)熒(ying)光顯(xian)影。結果(guo)顯(xian)示，SacI酶(mei)(mei)切(qie)時(shi)獲得一條大約(yue)(yue)7.8kb的信(xin)號帶，而用AclI酶(mei)(mei)切(qie)時(shi)獲得大約(yue)(yue)5.0kb的信(xin)號帶(圖4)。

因(yin)此(ci)上述(shu)實驗證明(ming)轉化事件“雙抗(kang)12-5”和“雙抗(kang)12-15”是一(yi)個抗(kang)蟲基因(yin)和抗(kang)草甘膦基因(yin)都是單拷(kao)貝插入的(de)轉化事件。

(4)轉基因玉(yu)米的農藝性(xing)狀

根據抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲性(xing)能(neng)(neng)、抗(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘膦(lin)(lin)(lin)能(neng)(neng)力和(he)外源基因(yin)插(cha)入(ru)拷貝數，篩選獲得具有高(gao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)蟲抗(kang)(kang)(kang)(kang)草(cao)甘膦(lin)(lin)(lin)能(neng)(neng)力，外源基因(yin)單拷貝插(cha)入(ru)的(de)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”和(he)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-15”進行農(nong)藝性(xing)狀分析。結果顯示轉化(hua)事件“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”和(he)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-15”生長期、花期與非(fei)轉基因(yin)親本沒有差異(yi)，在轉基因(yin)玉米上使用草(cao)甘膦(lin)(lin)(lin)除(chu)草(cao)對“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-5”和(he)“雙(shuang)(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)12-15”的(de)產(chan)量沒有影(ying)響(表5)。

表5：轉基因玉(yu)米的每(mei)穗粒數、100粒重(zhong)量和(he)生育期(qi)

注：*表示由于嚴(yan)重的蟲(chong)害造成粒(li)重和粒(li)數降低。

實施例3：外源基因插入位點側翼序列的鑒定(ding)

使用(yong)Liu等報道的(de)TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)方法(Liu，Plant Journal1995，8(3):457-463)對(dui)優良轉(zhuan)化事件(jian)“雙抗(kang)12-5”和(he)“雙抗(kang)12-15”外源轉(zhuan)基(ji)因DNA插入點兩(liang)側的(de)區域序列進(jin)(jin)(jin)行(xing)測定(ding)。該方法通過3個嵌套的(de)特異性(xing)引(yin)物(wu)分(fen)別(bie)和(he)簡并(bing)引(yin)物(wu)組合進(jin)(jin)(jin)行(xing)連續(xu)的(de)PCR擴(kuo)增，利用(yong)不同退火溫(wen)度選擇(ze)性(xing)地(di)擴(kuo)增目標片段(duan)。對(dui)擴(kuo)增獲得的(de)DNA片段(duan)進(jin)(jin)(jin)行(xing)克隆、測序并(bing)與(yu)網(wang)上(shang)玉米(mi)基(ji)因組數據庫(//www.maizegdb.org)進(jin)(jin)(jin)行(xing)比對(dui)分(fen)析。

對(dui)轉化事件“雙抗12-5”T-DNA左側(ce)(ce)翼區(qu)的(de)(de)(de)(de)DNA片(pian)段(duan)進行(xing)測序(xu)(xu)和比(bi)(bi)對(dui)，獲得的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)為SEQ ID NO.1，其中(zhong)核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)1-576bp之間的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)對(dui)應于玉米(mi)(mi)基(ji)因組(zu)DNA，核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)577-826bp之間的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)對(dui)應于外(wai)源(yuan)DNA。對(dui)T-DNA右側(ce)(ce)翼區(qu)的(de)(de)(de)(de)DNA片(pian)段(duan)進行(xing)測序(xu)(xu)和比(bi)(bi)對(dui)，獲得的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)為SEQ ID NO.3，其中(zhong)，核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)1-210bp的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)對(dui)應于外(wai)源(yuan)DNA，核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)211-1007bp的(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)對(dui)應于玉米(mi)(mi)基(ji)因組(zu)DNA。將(jiang)上(shang)述經測序(xu)(xu)比(bi)(bi)對(dui)和驗(yan)證(zheng)過的(de)(de)(de)(de)插入位點(dian)上(shang)下(xia)游旁側(ce)(ce)序(xu)(xu)列(lie)(lie)和外(wai)源(yuan)T-DNA序(xu)(xu)列(lie)(lie)整合形成(cheng)本發(fa)明所述的(de)(de)(de)(de)轉化事件“雙抗12-5”的(de)(de)(de)(de)特(te)異性核(he)(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)，序(xu)(xu)列(lie)(lie)編號為SEQ ID NO.12(即(ji)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的(de)(de)(de)(de)拼接而成(cheng))。

對(dui)(dui)(dui)轉(zhuan)化(hua)事(shi)件“雙抗12-15”T-DNA左側(ce)翼區(qu)的(de)(de)DNA片(pian)段(duan)進(jin)行測(ce)序(xu)(xu)(xu)和(he)比對(dui)(dui)(dui)，獲得的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)SEQID NO.14，其(qi)(qi)中核(he)苷酸(suan)1-1064bp之間(jian)的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)對(dui)(dui)(dui)應于(yu)玉(yu)米基(ji)因(yin)組DNA，核(he)苷酸(suan)1065-1172bp之間(jian)的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)對(dui)(dui)(dui)應于(yu)外源DNA。對(dui)(dui)(dui)T-DNA右(you)側(ce)翼區(qu)的(de)(de)DNA片(pian)段(duan)進(jin)行測(ce)序(xu)(xu)(xu)和(he)比對(dui)(dui)(dui)，獲得的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)SEQ ID NO.15，其(qi)(qi)中，核(he)苷酸(suan)1-54bp的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)對(dui)(dui)(dui)應于(yu)外源DNA，核(he)苷酸(suan)55-604bp的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)對(dui)(dui)(dui)應于(yu)玉(yu)米基(ji)因(yin)組DNA。將(jiang)上述經測(ce)序(xu)(xu)(xu)比對(dui)(dui)(dui)和(he)驗證過的(de)(de)插入位(wei)點(dian)上下游(you)旁側(ce)序(xu)(xu)(xu)列(lie)外源T-DNA序(xu)(xu)(xu)列(lie)整合(he)形成本發明所述的(de)(de)轉(zhuan)化(hua)事(shi)件“雙抗12-15”的(de)(de)特異性核(he)苷酸(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)，序(xu)(xu)(xu)列(lie)編號(hao)為(wei)(wei)SEQ ID NO.16(即SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2和(he)SEQ ID NO.15的(de)(de)拼接(jie)而(er)成)。

(2)外源基因特異性檢測

根據轉(zhuan)化事件的(de)核苷酸序(xu)列(SEQ ID NO.12)設計可以用于(yu)特異(yi)性檢測“雙抗12-5”的(de)PCR引物(如(ru)表6所示)。

表(biao)6.“雙抗12-5”特異性檢測(ce)引物

所述PCR反應體系為：10×擴增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水(shui)至50μL。

PCR條件(jian)(jian)是(shi)：32個循(xun)環，每個循(xun)環是(shi)95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的條件(jian)(jian)可以根據(ju)使用的酶和(he)反(fan)應體系進行調整。對(dui)獲得PCR產物(wu)進行瓊脂(zhi)糖電泳分析。左右邊界的特異(yi)PCR產物(wu)分別(bie)是(shi)304bp和(he)350bp(圖6)。必(bi)要的時(shi)候也可以對(dui)PCR產物(wu)進行序列(lie)測定(ding)進一步驗證。

根據轉(zhuan)化(hua)事件(jian)的核苷酸(suan)序列(SEQ ID NO.16)設計可以用(yong)于(yu)特異性檢測雙(shuang)抗12-15的PCR引物(如表7所示)。

表7.雙抗12-15特異性檢測(ce)引物

所述PCR反應體系為：10×擴增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至(zhi)50μL。

PCR條(tiao)件是(shi)(shi)：32個循環，每個循環是(shi)(shi)95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的(de)條(tiao)件可以根(gen)據使用的(de)酶(mei)和反應體系進(jin)行調(diao)整。對獲(huo)得PCR產(chan)(chan)物(wu)進(jin)行瓊脂糖電(dian)泳分析。左(zuo)右邊界(jie)的(de)特異(yi)PCR產(chan)(chan)物(wu)分別是(shi)(shi)1171bp(圖7)和604bp(圖8)。必要的(de)時候也可以將PCR產(chan)(chan)物(wu)進(jin)行序列測定進(jin)一步(bu)驗(yan)證。

實(shi)施(shi)例4：遺傳(chuan)穩定性(xing)檢測

1)轉化事件“雙抗(kang)12-5”在受體(ti)玉米中的(de)遺傳(chuan)穩(wen)定性檢測(ce)

根(gen)據轉(zhuan)化事件“雙(shuang)抗12-5”的(de)重組DNA分子(zi)(SEQ ID NO.12)設(she)計(ji)引物進行插入位點特異(yi)性的(de)PCR檢(jian)測，分別取(qu)1-7代次的(de)受體玉米提取(qu)基因組，利(li)用(yong)PCR鑒定(ding)T-DNA整合(he)情況。引物為(wei)：BR-1(5’GGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCT-3’)(SEQ ID NO.25)和GN-1(5’CCTACTGCGATGACGTTCGGTGCC-3’)(SEQ ID NO.26)，

反應體系：10×擴增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

反(fan)應條件：95℃1分鐘(zhong)，60℃40秒，72℃30秒，30個(ge)循環(huan)。TAQ酶從(cong)上海(hai)生工獲(huo)得。結果顯示(shi)，所有代(dai)次的轉基因(yin)玉米PCR結果都為陽性。瓊脂糖電泳分析顯示(shi)，PCR產物大(da)小(xiao)與預期大(da)小(xiao)一致是145bp(圖9)。

“雙抗12-5”抗蟲抗草(cao)甘膦生(sheng)物測定(ding)

玉(yu)米螟生物測定(ding)(ding)(Marcon et al.,1999)表(biao)明(ming)第(di)1,2,3,4,5,6,7代(dai)的(de)(de)轉基因(yin)玉(yu)米對(dui)一齡玉(yu)米螟的(de)(de)殺蟲(chong)(chong)效(xiao)果都(dou)是(shi)100％，抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)能(neng)力穩定(ding)(ding)遺(yi)傳(chuan)。噴施草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)試驗表(biao)明(ming)，第(di)1,2,3,4,5,6,7代(dai)的(de)(de)轉基因(yin)玉(yu)米都(dou)能(neng)抗(kang)(kang)每畝100克活性草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)含量的(de)(de)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)農(nong)藥。抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)能(neng)力穩定(ding)(ding)遺(yi)傳(chuan)。結(jie)果證(zheng)明(ming)抗(kang)(kang)蟲(chong)(chong)和抗(kang)(kang)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)能(neng)力穩定(ding)(ding)遺(yi)傳(chuan)。

2)轉化事件“雙抗(kang)12-15”在受體玉米(mi)中的(de)遺傳穩定性檢測

根(gen)據轉化(hua)事件(jian)“雙(shuang)抗12-15”的(de)(de)重組(zu)(zu)DNA分子(SEQ ID NO.16)設計引物(wu)進行插入位(wei)點特異性的(de)(de)PCR檢測，分別取1-7代次(ci)的(de)(de)受體(ti)玉米提取基因(yin)組(zu)(zu)，利用PCR鑒定T-DNA整合(he)情況。引物(wu)為：LB-SP4：5’CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC(SEQ ID NO.27)和LB-M:CTGTTCTGATGGTGGCAGGCAGG(SEQ ID NO.28)，

反應體系：10×擴增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

反應(ying)條件：95℃1分鐘，60℃40秒，72℃30秒，30個(ge)循環。TAQ酶(mei)從上海生(sheng)工獲得。結果(guo)顯示，所有代(dai)次的轉基因玉米PCR結果(guo)都為陽性。瓊脂糖(tang)電(dian)泳分析顯示，PCR產物(wu)大小與預期(qi)大小一致(zhi)是1000bp(圖10)。

“雙抗12-15”抗蟲抗草甘膦生物測定

玉米螟(ming)生物(wu)測(ce)定(ding)表(biao)明第(di)1,2,3,4,5代的(de)轉基因玉米對一齡玉米螟(ming)的(de)殺蟲效(xiao)果(guo)都是100％，抗(kang)蟲性能(neng)穩定(ding)遺(yi)傳。噴(pen)施(shi)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)試(shi)驗表(biao)明，第(di)1,2,3,4,5代的(de)轉基因玉米都能(neng)抗(kang)每(mei)畝100克活(huo)性草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)含量的(de)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)農藥(yao)。抗(kang)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)性能(neng)穩定(ding)遺(yi)傳。結果(guo)證明抗(kang)蟲和(he)抗(kang)草(cao)(cao)甘(gan)(gan)膦(lin)能(neng)力(li)穩定(ding)遺(yi)傳。

實施例(li)5：抗(kang)蟲抗(kang)草(cao)甘膦玉米品種培育

1)“雙抗12-5”雜交轉(zhuan)育

以含(han)有(you)“雙抗(kang)(kang)12-5”轉(zhuan)化(hua)事件的(de)(de)玉米(mi)為供體親本(ben)(ben)，以玉米(mi)自交(jiao)(jiao)系(xi)B73為受體親本(ben)(ben)進行(xing)一次(ci)雜交(jiao)(jiao)，4次(ci)回交(jiao)(jiao)和3次(ci)自交(jiao)(jiao)。在回交(jiao)(jiao)過程中使用(yong)草(cao)甘(gan)膦來清(qing)除(chu)不(bu)含(han)“雙抗(kang)(kang)12-5”轉(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)復合(he)結(jie)構(gou)的(de)(de)分離株系(xi)。于BC4F3代(dai)(回交(jiao)(jiao)4代(dai)后自交(jiao)(jiao)3代(dai))獲(huo)得了含(han)有(you)本(ben)(ben)發明所(suo)述的(de)(de)復合(he)轉(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)結(jie)構(gou)的(de)(de)穩定自交(jiao)(jiao)系(xi)B735。從該(gai)株系(xi)葉片組織中提取DNA，擴增出外源插入基(ji)因(yin)(yin)及(ji)其側(ce)翼的(de)(de)DNA片斷，經(jing)測序(xu)分析證實(shi)，來自與供體親本(ben)(ben)的(de)(de)復合(he)轉(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)結(jie)構(gou)序(xu)列一致，說明“雙抗(kang)(kang)12-5”轉(zhuan)化(hua)事件穩定轉(zhuan)育到(dao)新的(de)(de)受體材料中。以B735為母本(ben)(ben)，Mo17為父本(ben)(ben)組配(pei)獲(huo)得雜交(jiao)(jiao)種(zhong)B7M，對B7M進行(xing)外源插入基(ji)因(yin)(yin)及(ji)其側(ce)翼DNA的(de)(de)PCR分析和測序(xu)，結(jie)果顯示B7M含(han)有(you)轉(zhuan)化(hua)事件“雙抗(kang)(kang)12-5”。田間(jian)抗(kang)(kang)性試驗(yan)顯示，B7M具有(you)良好的(de)(de)抗(kang)(kang)草(cao)甘(gan)膦能力(li)和抗(kang)(kang)蟲(chong)性能。

1)“雙抗12-15”有性雜交轉育

以(yi)(yi)含(han)(han)有(you)“雙抗12-15”轉化事件的玉米(mi)為(wei)供(gong)體(ti)親(qin)本，以(yi)(yi)玉米(mi)自(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)系(xi)MR-1為(wei)受(shou)(shou)體(ti)親(qin)本進行一(yi)次(ci)雜交(jiao)(jiao)(jiao)，4次(ci)回交(jiao)(jiao)(jiao)和(he)3次(ci)自(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)。在回交(jiao)(jiao)(jiao)過程中使用(yong)草甘(gan)膦來清除不含(han)(han)“雙抗12-15”轉基(ji)(ji)因(yin)復合(he)結構的分(fen)離株系(xi)。于BC4F3代(回交(jiao)(jiao)(jiao)4代后自(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)3代)獲得了含(han)(han)有(you)本發明所述的復合(he)轉基(ji)(ji)因(yin)結構的穩(wen)定(ding)(ding)自(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)系(xi)M45。從(cong)該株系(xi)葉片(pian)組織中提取DNA，擴(kuo)增出外(wai)源插入基(ji)(ji)因(yin)及其(qi)側翼的DNA片(pian)斷，經(jing)測序分(fen)析證實，來自(zi)與(yu)供(gong)體(ti)親(qin)本的復合(he)轉基(ji)(ji)因(yin)結構序列一(yi)致，說(shuo)明“雙抗12-15”轉化事件穩(wen)定(ding)(ding)轉育(yu)到新的受(shou)(shou)體(ti)材(cai)料中。以(yi)(yi)M45為(wei)母本，RF1為(wei)父本組配獲得雜交(jiao)(jiao)(jiao)種M7R，對M7R進行外(wai)源插入基(ji)(ji)因(yin)及其(qi)側翼DNA的PCR分(fen)析和(he)測序，結果顯示M7R含(han)(han)有(you)轉化事件“雙抗12-15”。田間抗性試驗顯示，M7R具(ju)有(you)良好的抗草甘(gan)膦能力和(he)抗蟲性能。