本發明涉及一(yi)種重組bsai限制(zhi)性內切酶的(de)制(zhi)備方法。

背景技術：

限制性核(he)酸(suan)內切酶(mei)是(shi)可以(yi)識別特定(ding)的核(he)苷酸(suan)序列，并在每條(tiao)鏈中特定(ding)部位的兩個核(he)苷酸(suan)之間(jian)的磷酸(suan)二酯鍵進行切割的一類(lei)酶(mei)，簡稱限制酶(mei)。根(gen)據限制酶(mei)的結構，輔因子的需(xu)求(qiu)切位與作用方式，可將限制酶(mei)分為三(san)種(zhong)類(lei)型，分別是(shi)第(di)(di)一型(typei)、第(di)(di)二型(typeii)及第(di)(di)三(san)型(typeiii)。

第一(yi)型限制酶同時具有修飾及識(shi)(shi)(shi)別切割的(de)作用(yong)；另有識(shi)(shi)(shi)別dna上特定(ding)堿(jian)(jian)基序(xu)列的(de)能力，通常其切割位(wei)距離識(shi)(shi)(shi)別位(wei)可達數千個堿(jian)(jian)基之遠(yuan)。例如：ecob、ecok。

第二型限制酶只具有識別(bie)切割的(de)(de)(de)作用(yong)(yong)，修飾(shi)作用(yong)(yong)由其他酶進(jin)行。所識別(bie)的(de)(de)(de)位置(zhi)多為(wei)短(duan)的(de)(de)(de)回文序列；所剪切的(de)(de)(de)堿(jian)基序列通常即為(wei)所識別(bie)的(de)(de)(de)序列。是遺傳工程(cheng)上，實用(yong)(yong)性較高(gao)的(de)(de)(de)限制酶種(zhong)類。例如(ru)：banhi、hindiii。

第三型(xing)限制酶與第一型(xing)限制酶類(lei)似，同時具有修飾及識(shi)別切割的作用(yong)。可識(shi)別短(duan)的不對稱序(xu)列(lie)，切割位與識(shi)別序(xu)列(lie)約距24～26個堿(jian)基對。例如：hinfiii。

ii型限制(zhi)與修飾系統所占的比例最大，達(da)93％。

其中ii型酶相對來說最簡單，它們識別回文對稱序列，在回文序列內部或附近切割dna，產生帶3′-羥基和5′-磷酸基團的dna產物，需mg²⁺的(de)存在才能發揮活性，相應(ying)的(de)修飾酶只需sam。識(shi)別序(xu)列(lie)主要(yao)為4～6bp，或(huo)更長且(qie)呈(cheng)二重(zhong)對稱(cheng)的(de)特殊序(xu)列(lie)，但有(you)少數酶識(shi)別更長的(de)序(xu)列(lie)或(huo)簡(jian)并序(xu)列(lie)，切割位置因酶而(er)異，有(you)些是隔開的(de)。

限制性內切(qie)酶typeii又分(fen)了四種子(zi)型：iip，iis，iic和iit。大多數情況下實驗(yan)室使(shi)用的(de)iip只(zhi)有(you)一個(ge)(ge)蛋白(bai)(bai)結構域(yu)，具有(you)同時識別序(xu)列和在(zai)序(xu)列內進行切(qie)割(ge)的(de)能力(li)，而(er)iis擁有(you)兩(liang)個(ge)(ge)結構域(yu)，其中一個(ge)(ge)負(fu)責識別序(xu)列，另一個(ge)(ge)負(fu)責切(qie)割(ge)，由于兩(liang)個(ge)(ge)結構域(yu)具有(you)一定(ding)的(de)距離，導致(zhi)蛋白(bai)(bai)的(de)切(qie)割(ge)位(wei)點在(zai)識別序(xu)列之外(wai)。

本發明(ming)的(de)bsai限制性(xing)內切酶(mei)即屬(shu)于iis型(xing)限制酶(mei)，其識別位點為：

5’-ggtctc(n)1^-3’

5’-ccagag(n)5^-3’

bsai作為一個typeiis限制性內切酶(mei)(mei)，在生物(wu)(wu)領(ling)域(yu)屬于(yu)新型酶(mei)(mei)類，常用(yong)于(yu)goldengate技術。目前商(shang)品(pin)化(hua)bsai蛋白(bai)的價格(ge)偏高(gao)，較(jiao)少生物(wu)(wu)公(gong)司有此(ci)類產品(pin)。通(tong)過(guo)對本蛋白(bai)的研發可以(yi)增加在產品(pin)方面(mian)的競爭(zheng)力，同時可以(yi)用(yong)于(yu)goldengate技術的研究。

技術實現要素：

本發明要解決(jue)的(de)技術問題是(shi)提(ti)供一種重組bsai蛋(dan)白在大(da)腸桿菌中(zhong)(zhong)的(de)誘(you)導表達(da)以(yi)及純(chun)化方法(fa)。該方法(fa)通過將(jiang)目的(de)基因重組到(dao)表達(da)載(zai)體并轉化至(zhi)大(da)腸桿菌表達(da)菌株中(zhong)(zhong)進而進行誘(you)導表達(da)。

為了(le)解決上述技術問題，本發(fa)明采用的(de)技術方(fang)(fang)案(an)是，重組(zu)bsai限制(zhi)性內切酶的(de)制(zhi)備(bei)方(fang)(fang)法(fa)，包括以下步驟(zou)：

(1)表達(da)質粒pcreatsii-bsai的構建；

(2)bsai蛋白的誘導表達與鑒定；

(3)bsai蛋白(bai)的純(chun)化與鑒定。

作(zuo)為(wei)優選(xuan)，步驟(1)所述表達(da)質(zhi)粒pcreatsii-bsai的(de)構建，具體包括以下步驟：

(4)bsai的(de)基因合(he)成：根據密(mi)碼子優化后(hou)的(de)基因序列，直接(jie)進(jin)行基因合(he)成；

(5)gibson重組連接：將pcreatsii通過酶(mei)切進(jin)行線(xian)性化(hua)(hua)，線(xian)性化(hua)(hua)產(chan)物與步驟(zou)(4)的基因合成(cheng)產(chan)物進(jin)行無縫克隆；

(6)重(zhong)組產物(wu)轉(zhuan)(zhuan)化：將上(shang)(shang)述重(zhong)組連接產物(wu)20μl轉(zhuan)(zhuan)移到top10感受態細(xi)胞中，冰(bing)上(shang)(shang)靜置(zhi)30min，42℃熱激90s，冰(bing)上(shang)(shang)再靜置(zhi)2min；加(jia)入(ru)600ullb液體培(pei)養基，37℃搖(yao)床200rpm搖(yao)45min，涂(tu)布于含50ug/ml卡那(nei)霉素(su)的lb平板中，37℃培(pei)養箱(xiang)培(pei)養過夜；

(7)重組克隆(long)的鑒定(ding)：隨(sui)機挑取(qu)至少(shao)4個克隆(long)，接入4ml含卡那霉素(su)lb中(zhong)；37℃搖(yao)床220rpm搖(yao)過夜(ye)，抽提質粒并測(ce)序。

作為優選，步(bu)驟(2)具(ju)體包括以(yi)下步(bu)驟：

(8)重組(zu)質(zhi)粒(li)轉化大腸桿菌(jun)

將(jiang)上述(shu)鑒定為(wei)陽性的重組質(zhi)粒pcreatsii-bsai轉(zhuan)入感受態bl21(de3)中，涂布于含卡那霉(mei)素的lb平板(ban)上，37℃倒置培(pei)養(yang)過夜(ye)；

(9)iptg誘(you)導(dao)蛋白表達

挑(tiao)單克隆(long)于(yu)含卡那(nei)(nei)霉素lb中，37℃搖床，220rpm培養過(guo)夜，以1∶100接過(guo)夜菌于(yu)4ml含卡那(nei)(nei)霉素lb板中，繼續培養2.5h，od600nm達到0.6～0.8時加入iptg至0.5mm，于(yu)15℃過(guo)夜誘導蛋白(bai)表達；

(10)sds-page鑒定

取(qu)2ml菌液12000rpm離心(xin)1min收集(ji)菌體，加入100μl的(de)1×上樣(yang)緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心(xin)1min，取(qu)10μl樣(yang)品(pin)進行12％聚丙(bing)烯(xi)酰胺凝膠電泳(yong)，取(qu)下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導(dao)前后蛋(dan)白(bai)條帶的(de)變化，結(jie)果顯示目的(de)蛋(dan)白(bai)有表達(da)。

作(zuo)為(wei)優選，步驟(3)具(ju)體(ti)包(bao)括以(yi)下步驟：

(11)bsai蛋白的誘(you)導表達

將過(guo)夜(ye)培養(yang)已轉(zhuan)入pcreatsii-bsai的bl21(de3)菌液(ye)以(yi)1∶100接于800ml含卡(ka)那(nei)霉素lb中(zhong)，37℃搖(yao)床(chuang)，220rpm培養(yang)2h，od600nm達到(dao)0.6～0.8時，加入iptg至0.5mm，于15℃過(guo)夜(ye)誘導(dao)蛋白表達，8000rpm離心10min，收集菌體，-20℃保存；

(12)細菌蛋白表達形式的分析

-20℃凍存菌(jun)(jun)體按(an)每克(ke)濕(shi)菌(jun)(jun)5ml的比例加入(ru)細菌(jun)(jun)裂解液，超聲破菌(jun)(jun)，4℃，16000rpm離心(xin)15min，沉(chen)淀在(zai)底(di)部，分別取上清、包涵體做sds-page，結果(guo)顯示bsai蛋白一(yi)部分存在(zai)于上清中(zhong)；

(13)bsai蛋白的(de)純化

收(shou)集菌體(ti)加(jia)入裂(lie)解液重懸(xuan)，超聲破碎后離心(xin)，16000rpm離心(xin)15min，將上(shang)清液置于干凈的(de)50ml的(de)離心(xin)管中加(jia)入2mlni柱，4℃孵育2h，裂(lie)解液洗柱100ml；利(li)用含有20mm咪唑(zuo)的(de)裂(lie)解液洗脫(tuo)30ml，含有500mm咪唑(zuo)的(de)裂(lie)解液洗脫(tuo)5ml；以bsai儲存液作為流動相過分子篩superdex200，根(gen)據紫外吸收(shou)值收(shou)集合目(mu)(mu)的(de)蛋(dan)白的(de)洗脫(tuo)液，將目(mu)(mu)的(de)蛋(dan)白液用12％的(de)sds-page進行檢(jian)測。

本發(fa)明的(de)有益效果(guo)是：

本發明應用蛋白(bai)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)系統，superdex200分(fen)子篩層析(xi)對蛋白(bai)進(jin)行(xing)提純(chun)(chun)，經(jing)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)工藝(yi)摸索及(ji)(ji)(ji)條件優化(hua)(hua)(hua)，整個純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)過(guo)程僅需5～6h，極(ji)大簡化(hua)(hua)(hua)了(le)(le)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)過(guo)程及(ji)(ji)(ji)時間，從而保證(zheng)了(le)(le)酶(mei)活性(xing)，有利于(yu)酶(mei)產(chan)量(liang)的(de)提高，且純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)后bsai經(jing)酶(mei)活力與商業化(hua)(hua)(hua)酶(mei)相當，通過(guo)大腸桿菌表達bsai極(ji)大的(de)降低了(le)(le)成(cheng)本，效率也有很大的(de)提升。該純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)工藝(yi)的(de)新方法，為(wei)研(yan)發及(ji)(ji)(ji)生產(chan)其他(ta)ii型限(xian)制性(xing)內切酶(mei)奠定了(le)(le)基礎。

具體實施方式

以下通過具體的(de)實施例對本發明作進一步闡(chan)述。

1.菌種

宿主菌大(da)腸桿菌top10、bl21(de3)及表達載體pcreatsii。

2.試劑

限(xian)(xian)制(zhi)性內切(qie)酶為(wei)neb(北京)有限(xian)(xian)公(gong)司(si)產(chan)品；pcreatsii為(wei)通用(yong)(yong)生(sheng)物系統(安(an)徽)有限(xian)(xian)公(gong)司(si)研發；dna聚合酶為(wei)通用(yong)(yong)生(sheng)物系統(安(an)徽)有限(xian)(xian)公(gong)司(si)自產(chan)；膠(jiao)回收及質粒小抽試劑(ji)盒(he)為(wei)axygen產(chan)品；nintabeads6ff購自常(chang)州天地人和生(sheng)物科技有限(xian)(xian)公(gong)司(si)；t4dna連接(jie)酶購自thermo公(gong)司(si)。

3.蛋白酶基因合成

bsai蛋白酶(mei)與(yu)甲基化酶(mei)基因(yin)由通用(yong)生(sheng)物(wu)系統(安(an)徽)有(you)限公司基因(yin)部根據基因(yin)序列直接(jie)合成，5’及3’分別帶有(you)pcreatsii的同源(yuan)臂。

4.pcreatsii-bsai表達載(zai)體(ti)的構建

將bsai蛋白酶基因及線性化載體pcreatsii利(li)用(yong)利(li)用(yong)重(zhong)組(zu)(zu)酶進行同源重(zhong)組(zu)(zu)，重(zhong)組(zu)(zu)產物轉化大腸桿菌top10，抽提質粒由(you)本公司測序部進行測序驗證。

5.pcreatsii-bsai表(biao)達及產物純化

將測(ce)序正確的陽性重組(zu)子轉化(hua)到大腸桿菌(jun)bl21(de3)中(zhong)挑(tiao)取單菌(jun)落轉化(hua)到30ml含卡(ka)那霉素(su)(50mg/ml)的lb液體培(pei)(pei)養基(ji)中(zhong)，37℃培(pei)(pei)養過夜，次日按(an)1∶100接種至(zhi)800ml含卡(ka)那霉素(su)的液體培(pei)(pei)養基(ji)中(zhong)，37℃培(pei)(pei)養，當(dang)od600達到0.5時加(jia)入iptg(終濃度(du)0.5mm)于15℃誘導(dao)過夜。

收(shou)集菌體加入裂(lie)解液(ye)重(zhong)懸，超聲破碎后離心，16000rpm離心15min，將上清液(ye)置于干凈的(de)(de)50ml的(de)(de)離心管中加入2mlni柱(zhu)，4℃孵(fu)育2h，裂(lie)解液(ye)洗(xi)柱(zhu)100ml。利用含(han)有(you)20mm咪唑的(de)(de)裂(lie)解液(ye)洗(xi)脫(tuo)30ml，含(han)有(you)500mm咪唑的(de)(de)裂(lie)解液(ye)洗(xi)脫(tuo)5ml。以bsai儲存液(ye)作為流動相過分子篩(shai)superdex200，根據(ju)紫外吸收(shou)值收(shou)集含(han)目(mu)的(de)(de)蛋白的(de)(de)洗(xi)脫(tuo)液(ye)，將目(mu)的(de)(de)蛋白液(ye)用12％的(de)(de)sds-page進行檢(jian)測。

6.將目的蛋白(bai)純(chun)化(hua)產(chan)物進行酶(mei)切驗證(zheng)。

以上(shang)所述(shu)的(de)本(ben)發(fa)明(ming)(ming)實施方式，并不構成對本(ben)發(fa)明(ming)(ming)保護(hu)范(fan)圍的(de)限定。任(ren)何(he)在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)精(jing)神和(he)原則之內(nei)所作的(de)修改、等同替換和(he)改進等，均應包含在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)權利(li)要求保護(hu)范(fan)圍之內(nei)。