專利名稱:天然大分子的解聚的制作方法
本發明涉及一個用于有控解聚天然存在的聚陰離子，尤其是針對核酸類和葡糖氨基聚糖類的新方法。特別是本方法是用于對難以被解聚的肝素和硫酸皮膚素(DS)進行有控解聚的。本發明包含從天然聚陰離子類解聚所得的產品及當這些產品是用本專利權限范圍的方法得到時，含有這些產品的藥物組合物。
當對實驗模型或人類用口服或不經腸道的方法服藥時，一些聚陰離子類的生物利用率和生物學效應取決于平均分子量(
MW)的這一實驗觀察結果越來越引起人們的興趣。例如，商品肝素由于當它被用作輔助因子時，對一種有效的蛋白酶禁阻劑[抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)]由于其激活性能，因而是一種眾所周知的抗凝(血)劑。肝素是一種硫酸化的葡糖氨基聚糖，平均分子量為12，000D(道爾頓)，相當于約20個二糖單位并且在凝血過程中，它對5種名為FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅩ、FⅡ的因子起禁阻作用。用解聚方法可能得到分子量低于起始肝素的碎片。最近，發現平均分子量為4000～6000D的肝素片段(較低分子量的肝素)對一些因子起禁阻作用，而對其它因子不起禁阻作用，特別對一些在血(栓)性靜脈類發作中的關鍵因子如FX不起禁阻作用。因此可以認為低平均分子量的肝素可作為比商品肝素具有較小出血危險的有效的抗血栓形成劑。
已經觀察到低平均分子量肝素的血液中的半壽期比商品肝素的長。因此，可以避開逐滴灌輸和回縮現象實現一種長周期的療法。
低平均分子量肝素的另一個優點是不會干擾血小板凝集。這是一種不希望有的影響，以前曾引起病人在肝素服藥期間嚴重的血栓血細胞減少癥。
可以描述另一個對于聚陰離子的與分子量有關的性質的例子，即與解聚有關的脫氧核糖核酸(DNA)的性質DNA由于它的平均分子量(高于106D)而不能經非腸道途徑使用，但是在它被解聚后，它顯示了很有意義的性質。事實上，平均分子量為25000～70000D的低聚脫氧核糖核苷酸(defibrotide)顯示出抗超纖維蛋白溶解作用和免疫激發效應及預防梗塞的作用。
由于很難實行天然聚陰離子類的有控的解聚，因此，進行許多試驗來研究對于這些方法的合適操作條件。
在實際操作中，有許多理由說明聚陰離子類的有控的解聚是一項困難的任務a)化學試制及目前所用的操作(亞硝酸、具塔-消除(bethaelimination)，氧化、酸或堿水解)會改變受影響鍵附近或其它區域中的分子結構而這對活性來說十分關鍵，并會因而產生可被認為是新的化合物而不是低聚物的進一步的物質。
b)當必須把解聚停止在一個預先選定的水平上時，酶很難被控制。進一步說，有些聚陰離子類，如肝類、硫酸皮膚素和DNA不易受現有酶的影響。
c)物理的或化學-物理分餾方法，例如用分子篩、超濾或選擇性沉淀方法不適宜于大規模的經濟的生產。
因此，本發明的目的是通過化學反應模擬在動物組織(特別是在玻璃體尤其是軟骨中)觀察和研究出的導至透明質酸(HA)解聚的一些條件。在體內HA是一種在有連接作用的組織中發現的聚陰離子，被引發氧化-還原反應的一種自由基解聚。自由基(過氧化物和羥基)是由生物化學系統產生的，如在氧氣和抗氧化載體如半胱氨酸、谷胱甘肽或抗壞血酸的存在下的黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶。在病理條件如局部炎癥、內障、關節病及可能還有動脈粥樣硬化的發作和發展中由自由基引發的天然大分子的裂解被認為是頭等重要的。這種裂解是一種真正的過氧化水解(peroxydolysis)，除了引起碳-氧鍵的水解導至HA的解聚外不會引起分子內的變化。
在一個化學實驗室中模擬氧化-還原解聚的重要性是顯而易見的，同樣，利用自由劑消除劑使該反應迅速完全地停止在任何預定的水平上也是十分重要的。
本發明方法的特征在于在作為自由基產生系統的催化有效量的亞鐵鹽和作為自由基清除劑的乙醇的存在下在加氣反應(aereated)條件中使用過量的過氧化氫(化學計量數的2～5倍)以及用本方法從解聚后的天然聚陰離子類得到的產物。操作的pH為中性或微酸性[pH＝4.0～7.0]。操作溫度的范圍(溫度上限為100℃)[20℃和80℃之間]允許穩定反應速度，主要是為了在過程控制中用粘度測定法測定平均分子量。
這個方法一般可用于天然聚陰離子類的有控的化學解聚。尤其是，用這個方法可達到核酸和葡糖氨基聚糖如肝素和DS的有控解聚，而用酶的方式是難以使它們解聚的。
下面的例子揭示了這個方法而并不是限止本申請的。
例1把20克美國藥典鈉肝素溶于100毫升水中，在攪拌下加入4克氫型陽離子樹脂(如AmberliteRIR-120)。一當pH降低到4.0～4.5時，把樹脂濾出并把濾液收集在一個圓底燒瓶中，在一個水浴中及回流下加熱濾液至80℃，然后在攪拌下把它加入通過混合4.0毫升30%H2O2和0.2毫升亞鐵鹽溶液(溶液A為與1.5Fe SO4·7H2O加入100毫升水中)而制備好的4.2毫升反應劑中。
把其保持在80℃并經錄其pH值。在預先設定的幾個時間，從燒瓶中收集多份20毫升樣品。對每份樣品，在攪拌下迅速加入幾滴0.1MNaOH以使pH增加到7.0，0.5毫升的NaCl溶液，逐滴加入25毫升乙醇及3.3毫升20% NaCl溶液。收集沉淀，用乙醇洗滌之，然后放入丙酮中。在真空烘箱中于50～60℃下把它干燥過夜，而且用粘度測定法控制這些樣品的平均分子量及效能。結果總結在下表中時間 pH
MW效能IU/mg % 殘留H2O2(分)- 4.6 12，000 135 10030 4.3 6，000 82 6460 4.0 4，000 48 58120 3.6 ＜2，500 20 54180 3.5 ＜2，500 ＜20 47300 3.0 ＜2，500 ＜20 44例2把20克鈉肝素于微酸性的pH＝5.6下溶于100毫升水中。把溶液在一個水浴中于回流下加熱到50℃。然后加入通過混合4.0毫升30%H2O2和0.6毫升溶液A(見例1)制備好的4.6毫升的反應劑。把反應混合物保持在50℃并記錄pH。在預先設定的幾個時間內從燒瓶中收集幾份20毫升樣品。然而如例1那樣處理樣品。結果總結于下表中;
時間 pH
MW效能 % 殘留 H2O2(分) IU/mg- 5.6 12，000 135 10030 5.3 10，000 114 9660 4.9 8，000 109 90120 4.8 7，000 75 83180 4.4 5，000 56 71- - - - -480 3.4 ＜2，500 ＜10 3
例3把20g具有下列組成的天然存在的硫代粘多糖混合物20% 硫酸軟骨素 (CHS)，50% 硫酸皮膚素 (DS)，30% 乙酰肝素硫酸鹽 (HS)，(pH＝4.0 80℃下，30ppm二價鐵)，進行如例1那樣的處理，收集樣品并紀錄pH，評定其特性粘度和電泳。結果總結于下表中時間 pH 特性粘度 電泳(分) (dl/g) CHS DS HS- 4.7 0.459 20 50 30/10030 4.9 0.365 15 40 30/8560 4.7 - -120 4.5 - -180 4.4 - 15 30 30/75300 3.8 0.225 5 15 15/35例4把20克哺乳動物的脫氧核糖核酸鈉鹽在微酸性的pH＝6.3下溶于100毫升水中。在回流下加熱溶液，接著是例1中的程序。在幾個設定的周期內，從燒瓶中收集樣品。記錄每個樣品的pH值、殘留H2O2和乳光點(對于溶液的恒定的乳光來說需要逐滴加入毫升乙醇)。然后把2體積的乙醇加入沉淀物即解聚后的核酸。結果總結于下表中
時間 pH 殘留 H2O2乳光點(小時) vol/vol0 5.9 100 0.5001 6.5 65 0.5502 6.5 59 0.6303 6.5 50 0.6804 6.5 42 0.680
權利要求
1.一種用于天然存在聚陰離子類，特別是核酸類和葡糖氨基聚糖類的以自由基的產生(O-2和OH)為基礎的有控解聚的方法，其中，自由基通過使過氧化氫和亞鐵鹽反應得到。
2.根據權利要求
1的一種方法，其中過氧化氫是過量的，為化學計量數的2～5倍。
3.根據權利要求
1的一種方法，其中兩價鐵鹽以催化有效量加入。
4.根據權利要求
1的一種方法，其中反應在酸性或中性pH[＝4.0～7.0]和溫度上限為100℃[＝20～80℃]下進行。
5.根據權利要求
1的一種方法，其中利用自由劑清除劑使反應在任何時候終止。
6.根據權利要求
1和6的一種方法，其中所說的清除劑是乙醇。
7.用根據獨立權項1和從屬權項2～6的方法得到的天然聚陰離子類解聚產物。
8.含有按權利要求
1～6的每項權利要求
所描述的方法制備的解聚后聚陰離子類的藥物組合物。
專利摘要
本發明涉及一種用于天然存在的聚陰離子類；尤其是針對核酸類和葡糖氨基聚糖類的有控解聚的新方法。這種方法是以通過在亞鐵鹽的存在下過氧化氫的作用形成自由基系統為基礎的。作用自由基清除劑可使該反應迅速停止在任一預先選擇的水平上。
文檔編號C08B37/00GK87105497SQ87105497
公開日1988年4月13日 申請日期1987年8月5日
發明者維克托·鮑特斯坦·德茨, 里卡多·雨果·多曼尼柯, 弗南多·富歇 申請人:阿喬凱有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan