專利名稱：光敏感基團保護的功能基團亞磷酰胺及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及亞磷酰胺化合物，尤其涉及光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物及其制備方法，本發明還涉及該亞磷酰胺化合物在寡聚核苷酸固相合成及5'端功能化中的應用，屬于寡聚核苷酸的固相合成及功能化領域。
背景技術：
光活性基團指在光子激發下，能夠通過形成自由基或異裂中間體，發生化學變化的分子結構。它使在復雜體系中，尤其是在生理環境下，利用光控制小分子或生物大分子的變化成為可能。普遍認為，與溫度、酸堿度等其它的調控手段相比，光調控具有定位準確，調控及時，對體系影響小等諸多優點。通常所指的光活性基團可分為兩類，即光異構化基團和光可切除基團。前者的光化學過程是可逆的，后者則是不可逆的化學過程。光可切除基團(caged/caging moieties)的概念最早由J. F. Hoffman于1978年提出1，這類基團對340-370nm范圍內的光敏感，能夠有效地吸收這種能量的光子。最常見的光可切除基團是鄰 硝基苯基及其衍生物，此外還有對羥基苯乙酰氧基、香豆素類、咕噸酮乙酸類化合物等。由于鄰位硝基的存在，在光激發后，鄰硝基苯乙醇類化合物形成五元環狀中間體，進而得到鄰亞硝基苯乙酮類化合物，與化合物中的其它部分斷開。由于鄰硝基苯乙醇及其衍生物的結構相比其它光可切除基團在合成中或生理環境下較為穩定，因此在大多數生物體系中被廣泛采用，如ATP，DNA, RNA,蛋白質，適配體等。寡聚核苷酸可以用來做PCR引物，用于核酸序列檢測的探針、等位基因特異的寡聚核苷酸分析(Allele-specificoligonucleotide, ASO)、單喊基多樣性分析(Singlenucleotide polymorphism, SNP)、反義寡聚核苷酸,其在分子生物學領域有廣泛的應用。近幾十年來，寡聚核苷酸在分子生物學中發揮著越來越重要的作用，逐漸成為一種非常有效的研究工具。特別是近年來，相關的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸從基因水平上研究各種疾病的產生機理及其相關基因的表達網絡，并使其通過調節基因的表達量來預防、診斷和治療相關疾病，作為藥物研發的另一種思路。寡聚核苷酸功能化的傳統方法和應用一般地，5'端的功能化是在寡聚核苷酸合成后加入含磷試劑的小分子帶保護基的官能團，脫保護后再經由這些官能團連接其它功能分子。如5'氨基有對甲氧基三苯基(MMTr)保護和三氟乙酰(TFA)保護的模塊，選用何種保護基由寡聚核苷酸的后處理決定。連接臂一般為6個碳，12個碳的連接臂用于某些特定情形，如在近距離會發生熒光淬滅的分子內。5'巰基有三苯基(Tr)保護基和二硫鍵保護兩種模塊，與MMTr不同，Tr對酸穩定，需小心地用硝酸銀將其脫去，過量的硝酸銀用TCEP沉淀后離心除去，而此步中過量的TCEP需經脫鹽除掉。為保證硫醚鍵或二硫醚鍵不被氧化，合成循環中最后一步需用0. 2M的碘液。而二硫鍵保護的模塊可用TCEP斷開，脫鹽后直接使用。末端為巰基的ODN可繼續與熒光素、生物素或金屬納米粒結合，用于DNA芯片分析，熒光探針等分子生物學檢測。在一段末端為氨基的寡聚核苷酸中連入含二硫醚的戊酸NHS活化物后能與金、銀納米粒表面結合，形成兩個硫-金鍵，結合的效率可達91%，而單一巰基則僅48%。這種強的DNA-金表面結合模式為DNA控制的納米粒自組裝提供了另一種可行的策略。最初引入5'端磷酸基時需使用含有砜的磷試劑，但如果合成最后DMTr在ODN上，則氨水在會將該保護基脫下暴露磷酸基，這樣會給反相HPLC的純化造成困難。將鄰硝基芐醇結構保護的氨基和羧基與胸腺嘧啶單體的堿基連接，寡聚核苷酸合成后并光照處理后，即可暴露氨基和羧基。在鏈中加入功能分子還可通過修飾的DNA單體實現，即先將光活性基團連入胸腺嘧啶2'位置進行DNA合成，光脫保護后再連入功能分子。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種能夠應用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化的光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物；本發明的目的之二是提供一種合成所述亞磷酰胺化合物的方法；·本發明的目的之三是將所述的亞磷酰胺化合物應用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的應用于寡聚核苷酸固相合成及功能化的光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物，為式I或式II所示結構的化合物
權利要求
1.光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物，其特征在于，其為式I或式II所示結構的化合物
2.一種合成權利要求I所述式I化合物的方法，其特征在于，包括將鄰硝基苯乙酮還原后得到鄰硝基芐醇；將鄰硝基芐醇在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫條件下進行反應，即得。
3.一種合成權利要求I所述式I化合物的方法，包括 (I)將鄰硝基芐醇與DSC形成中間體，直接與6-氨基己醇作用得I-(2-硝基苯基)乙基6-羥基己胺基碳酸酯；(2)將1-(2-硝基苯基)乙基6-羥基己胺基碳酸酯在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫進行反應，即得。
4.一種合成權利要求I式I所示化合物的方法，包括 (1)鄰硝基節醇經過溴代得到1-(1-溴乙基)-2-硝基苯；將1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(2)和被硅烷保護的6-羥基己酸在丙酮和無機堿作用下得到6-(6-(叔丁基二甲基硅氧)己酸I-(2-硝基苯基)乙酯；將6-￠-(叔丁基二甲基硅氧)己酸I-(2-硝基苯基)乙酯脫去娃燒保護基得到6-輕基己酸1-(2-硝基苯基)乙酯； (2)6-羥基己酸1-(2-硝基苯基)乙酯在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫進行反應，即得。
5.一種合成權利要求I式I所不化合物的方法，包括(1)將1-(1_溴乙基)-2-硝基苯被6-疏基己醇未核取代得到6-[I-(2-硝基苯基)乙疏基]I-己醇；(2)6-[I-(2-硝基苯基)乙巰基]I-己醇在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫進行反應，即得。
6.一種合成權利要求I式I所示化合物的方法，包括(I)鄰硝基芐醇的羥基被DSC活化后，得到S_6_輕己基0_1_(2_硝基苯)乙基硫代碳酸酷；(2) S-6-輕己基0_1_(2_硝基苯)乙基硫代碳酸酯在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫進行反應，即得。
7.一種合成權利要求I式II所示化合物的方法，包括(I)鄰硝基苯基乙二醇和4-羥基-2- 丁酮溶于THF中，在對甲基苯磺酸的催化和分子篩的脫水下，得到4-羥基丁 -2-酮1-(2-硝基苯基)-1，2_乙二醇縮酮；(2) 4-羥基丁 -2-酮I-(2-硝基苯基)-1，2-乙二醇縮酮在氮氣保護下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二異丙氨基膦氯和TEA，室溫條件下進行反應，即得。
8.按照權利要求2-7任何一項所述的方法，其特征在于所述的室溫的溫度范圍為20-30°C，優選為 25°C。
9.一種寡聚核苷酸，其特征在于含有權利要求I所述的亞磷酰胺化合物。
10.權利要求I所述的亞磷酰胺化合物在寡聚核苷酸的固相合成及5'端功能化中的應用，包括在寡聚核苷酸的固相合成中，將其作為最后一個單體加入到寡聚核苷酸的5'端；光照后脫去保護，再連上相應的功能分子或標記物。
全文摘要
本發明公開了光敏感基團保護的功能基團亞磷酰胺及其制備方法和應用，屬于核苷酸的固相合成領域。本發明式Ⅰ或式Ⅱ所示結構的亞磷酰胺化合物均有鄰硝基苯乙醇的母體結構，具有光切割活性，在寡聚核苷酸的固相合成中可作為光活性保護基，將其作為最后一個單體加入到ODN的5′端，能夠保護磷酸基、氨基、羧基、巰基或羰基。試驗結果表明，本發明式Ⅰ或式Ⅱ所示結構的化合物在寡聚核苷酸的固相合成中作為最后一個單體加入到ODN的5′端所得到的寡聚核苷酸產物經過光照后能脫去保護并在5′端接上相應的功能分子或標記物。
文檔編號C07C271/16GK102898464SQ20121016301
公開日2013年1月30日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者湯新景, 蘇蒙 申請人:北京大學