專利名稱：桑葉中1-脫氧野尻霉素的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，特別涉及一種纖維素酶產生菌輔助提取桑葉中I-脫氧野尻霉素的方法。
背景技術：
現代藥理研究表明桑葉有效成分之一多羥基生物堿具有顯著的降血糖作用，而I-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)為桑葉中主要的生物堿(一種糖苷酶抑制劑)，是降血糖的主要活性成分。此外，I-脫氧野尻霉素還具有抗病毒、抑制腫瘤等功能。目前，I-脫氧野尻霉素的市場價格昂貴(98%純度I-脫氧野尻霉素約20萬元/克)，如果其生產成本降低，其應用領域還將進一步擴大。微生物發酵可以產生I-脫氧野尻霉素。目前已經發現枯草桿菌、放線菌等微生物可以發酵產I-脫氧野尻霉素。但是它們的產量較低， 一般為0.01g/L左右。由于產量極低，目前僅僅局限于菌株初步篩選和改造，沒有開展大規模發酵制備I-脫氧野尻霉素的嘗試。利用桑樹廢棄物為原料生產I-脫氧野尻霉素具有巨大的潛力。其優點在于原料來源豐富，價格低廉，是生產I-脫氧野尻霉素等活性物質的理想原料。因此很有必要建立一種高效的I-脫氧野尻霉素提取方法。目前桑葉中I-脫氧野尻霉素提取工藝的報道較少，而且提取效率低、成本高。目前I-脫氧野尻霉素的提取多采用溶劑提取法和酸提取法。溶劑提取主要采用乙酸乙酯、乙醇和石油醚等溶劑分部提取；而酸提取法主要采用稀鹽酸和稀硫酸提取桑葉中的I-脫氧野尻霉素。乙醇提取率(I-脫氧野尻霉素的提取量X100% /所用桑組織的質量)為0. 00139 %，蒸餾水提取法提取率為0. 00121 %，稀酸提取效率為0. 00147%。因此，桑樹中I-脫氧野尻霉素提取效率較低成為I-脫氧野尻霉素制備的瓶頸問題。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供了一種提取效率高、成本低的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法。技術方案本發明所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，包括以下步驟(I)發酵將桑葉加入纖維素酶產生菌種子液中，恒溫振蕩培養得到發酵液；(2)提取及純化采用酸提取法或醇提取法提取發酵液，將所得提取液純化，得到I-脫氧野尻霉素。其中，步驟(I)中，所述纖維素酶產生菌種子液由纖維素酶產生菌于產酶培養基中恒溫振蕩培養制得。為了獲得更好的培養效果，采用的培養條件為培養溫度為26 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為3 5天。為了使纖維素酶產生菌對桑葉的纖維素充分降解，本發明優化了發酵條件所述纖維素酶產生菌為里氏木霉(Trichoderma reseei ATCC 26921)、康寧木霉(Trichoderma koningii CICC 13012)、綠色木霉(Trichoderma viride CICC 40502)或黑曲霉(Aspergillus niger DSMZ 821);所述產酶培養基的配方為葡萄糖I 3g/L,微晶纖維素2 3g/L,蛋白胨I 2gL, (NH4)2S042 3gL, KH2P043 4gL,尿素 0. 4 0. 6g/L, CaCl2 2H20 0. 6 I. OgL, MgSO4 7H200. 4 0. 8gL, FeSO4 7H20 0. 7 I. I X l(T2g/L, MnSO4 H2O 2. 6 4. 8 X l(T3gL, ZnSO4 H2O2. 6 4. OX l(T3gL, CoC12 6H20 5. 0 8. OX l(T3g/L，吐溫 800. 3 0. 5g/L，其余為水，pH5.0。每IOOmL種子液中加入桑葉0.2-1. 0g。所述種子液的pH為5. 0 7. 0，培養溫度為28 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為6 24h。步驟(2)中，所述酸提取法包括以下步驟離心發酵液，下層沉淀與酸水溶液恒溫浸提后離心，取上層提取液；下層沉淀重復上述操作；合并提取液。為了提高提取率，本發明優化了提取條件所述酸水溶液為鹽酸水溶液，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 03 0. 07mol/L,每IOOmL鹽酸水溶液中加入l_3g沉淀，浸提溫度為60_80°C。所述提取液純化包括以下步驟提取液加入三氯乙酸水溶液后離心；所得上清液經大孔吸附樹脂分離，洗 脫劑為無水乙醇；濃縮洗脫液，即得I-脫氧野尻霉素。有益效果本發明與現有技術相比，其顯著優點是本發明提取方法利用纖維素酶產生菌對桑葉進行發酵處理，產生的纖維素酶可以將桑葉中的部分纖維素降解，從而提高了桑葉中I-脫氧野尻霉素提取效率，其提取率達到0. 299%,比未經發酵處理的桑葉中的提取率高出27倍。同時，使用纖維素酶產生菌發酵制備I-脫氧野尻霉素，減少了單位產量有機試劑的使用量，是一種綠色環保的提取方法。另外，本發明的提取方法利用纖維素酶產生菌與桑葉為原料，該原料來源豐富，價格低廉。


圖I為I-脫氧野尻霉素提取液的高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例I :用里氏木霉(Trichoderma reseei, ATCC26921,購于中國微生物菌種保藏中心)輔助提取桑葉中I-脫氧野尻霉素，步驟如下I、對里氏木霉進行活化在無菌條件下，將里氏木霉干粉接種至PDA培養基上，28°C恒溫靜置培養6天。PDA培養基的配方為馬鈴薯200g、蔗糖20g、水lOOOmL、瓊脂20g。2、對里氏木霉進行擴大培養在無菌條件下，將里氏木霉從PDA培養基中接種至50mL擴大培養基中，28°C恒溫
靜置培養2天。擴大培養基的配方為葡萄糖10g/L，蛋白胨lg/L，吐溫800. 5g/L，(MM)2SO4L 4g/L, KH2P042g/L，尿素 0. 3g/L, CaCl2 2H20 0. 4g/L, MgSO4 7H20 0. 3g/L, FeSO4 7H200. 005g/L, MnSO4 H2O 0. 0016g/L, ZnSO4 H20 0. 0014g/L, CoCl2 6H20 0. 0037g/L, pH5. 0。3、種子液的制備在無菌條件下，從擴大培養基上量取5mL里氏木霉擴大培養液轉移至含有50mL的液態產酶培養基中，于轉速為180r/min的振蕩搖床上30°C恒溫培養5天。產酶培養基的配方為葡萄糖I. 5g/L,微晶纖維素3g/L,蛋白胨2g/L, (NH4)2S042. 8g/L, KH2P044g/L,尿素 0. 6g/L, CaCl2 2H20 0. 8g/L, MgSO4 7H20 0. 6g/L, FeSO4 7H200. OlOg/L, MnSO4 H2O 0. 0032g/L, ZnSO4 H2O 0. 0028g/L, CoC12 6H200. 0074g/L,吐溫800. 5g/L，其余為水，pH 5. O04、對桑葉進行發酵處理將種子液的pH值調至5. 0，準確稱取0. 2g桑葉粉加入種子液中，于轉速為180r/min的振蕩搖床上30°C恒溫培養12h。5、酸提發酵液a、將發酵液離心IOmin,離心機轉速為5000r/min,將上清液傾出；b、下層沉淀加入5mL 0. 05mol/L的鹽酸溶液潤旋混合lmin, 70°C恒溫水浴浸提20min,離心IOmin,離心機轉速為5000r/min,取上清液即為上層提取液；
C、下層沉淀再加入IOmL 0. 05mol/L的鹽酸溶液同步驟(b)的操作重復提取一次，合并兩次提取液并加去離子水定容至50mL。6、對I-脫氧野尻霉素的提取液進行高效液相層析(HPLC)取I-脫氧野尻霉素提取液IOuL于1.5mL的離心管中加IOuL硼酸鹽緩沖液(pH8. 5)，再加入20uL 5mmol/L芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)的乙腈溶液混勻后于20°C水浴反應，以去離子水作為空白對照。20min之后加入IOuL 0. lmol/L的甘氨酸溶液，讓剩余的衍生化試劑反應，最后加入950uL 0. 1% (V/V)的醋酸水溶液混勻后用0. 45um的一次性針頭過濾器過濾。色譜條件色譜柱HiQSiLC18分析柱(5um, 250mmX4. 6mm)及 0DS3 預柱(5um,IOmmX4. 6mm);流動相:乙腈 _0. I %醋酸(55 45V/V);流速1.0mL/min ;柱溫25°C ;熒光檢測器激發波長254nm，發射波長322nm;進樣量為10uL。HPLC色譜圖見圖I。結論利用菌液輔助提取I-脫氧野尻霉素，提取率可達到0. 299%。7、純化將提取液濃縮離心處理后，加3倍體積的三氯乙酸除去蛋白質；用DHlOl大孔吸附樹脂除雜質，流速為IBV / h過大孔樹脂(1BV相當于一個柱床體積)；用10倍體積的無水乙醇洗脫，然后70°C減壓蒸餾除去乙醇，得I-脫氧野尻霉素為210mg/L濃縮液；再經過-40°C冷凍干燥，得到成品I-脫氧野尻霉素。實施例2 :用康寧木霉(Trichoderma koningii, CICC 13012)輔助提取桑葉中
I-脫氧野尻霉素。(I)種子液的制備將康寧木霉于產酶培養基中恒溫振蕩培養制得康寧木霉種子液，所述產酶培養基的配方為葡萄糖13g/L,微晶纖維素 3g/L,蛋白胨 2g/L, (NH4) 2S043g/L, KH2P044g/L,尿素0. 6g/L, CaCl2 2H20 I. Og/L, MgSO4 7H20 0. 8g/L, FeSO4 7H20 I. I X l(T2g/L, MnSO4 H2O
4.8 X l(T3g/L, ZnSO4 H2O 4. OX l(T3g/L, CoC12 6H20 8. OX l(T3g/L，吐溫 800. 5g/L,其余為水，pH 為 7.0 ；(2)發酵將桑葉加入康寧木霉種子液中，每IOOmL康寧木霉種子液中加入桑葉
0.2g，恒溫振蕩培養得到發酵液，康寧木霉種子液的pH為6. 0，培養溫度為28 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為6h ；(3)提取及純化離心發酵液，下層沉淀與鹽酸水溶液恒溫浸提后離心，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 05mol/L,每IOOmL鹽酸水溶液中加入2g沉淀，浸提溫度為70°C，取上層提取液；下層沉淀重復上述操作；合并提取液；提取液加入三氯乙酸水溶液后離心；所得上清液經大孔吸附樹脂分離，洗脫劑為無水乙醇；濃縮洗脫液，即得I-脫氧野尻霉素。實施例3 :用綠色木霉輔助提取桑葉中I-脫氧野尻霉素(Trichoderma virideCICC40502)。(I)種子液的制備將綠色木霉于產酶培養基中恒溫振蕩培養制得綠色木霉種子液，所述產酶培養基的配方為葡萄糖lg/L,微晶纖維素 2g/L,蛋白胨 lg/L, (NH4) 2S042g/L, KH2P043g/L,尿素 0. 4g/L, CaCl2 2H20 0. 6g/L, MgSO4 7H20 0. 4g/L, FeSO4 7H20 0. 7 X l(T2g/L, MnSO4 H202. 6 X l(T3g/L·, ZnSO4 H2O 2. 6 X l(T3g/L, CoC12 6H20 5. OX l(T3g/L，吐溫800. 3g/L，其余為水，pH 為 5. 0 ;(2)發酵將桑葉加入綠色木霉種子液中，每IOOmL綠色木霉種子液中加入桑葉
I.Og,恒溫振蕩培養得到發酵液，綠色木霉種子液的pH為7. 0，培養溫度為28 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為24h ；(3)提取及純化離心發酵液，下層沉淀與鹽酸水溶液恒溫浸提后離心，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 03mol/L,每IOOmL鹽酸水溶液中加入Ig沉淀，浸提溫度為60°C，取上層提取液；下層沉淀重復上述操作；合并提取液；提取液濃縮離心后，加入三氯乙酸水溶液除去蛋白質后再離心；所得上清液經DXA-6大孔吸附樹脂分離，洗脫劑為無水乙醇；濃縮洗脫液，即得I-脫氧野尻霉素。實施例4:用黑曲霉(Aspergillus niger, DSMZ 821)輔助提取桑葉中I-脫氧野
尻霉素。( I)種子液的制備將黑曲霉于產酶培養基中恒溫振蕩培養制得黑曲霉種子液，所述產酶培養基的配方為葡萄糖I. 5g/L,微晶纖維素 3g/L,蛋白胨 2g/L, (NH4) 2S042. 8g/L, KH2P044g/L,尿素 0. 6g/L, CaCl2 2H20 0. 8g/L, MgSO4 7H20 0. 6g/L, FeSO4 7H20 0. OlOg/L, MnSO4 H2O0. 0032g/L, ZnSO4 H2O 0. 0028g/L, CoC12 6H20 0. 0074g/L,吐溫 800. 5g/L，其余為水，pH為 5. 0。(2)發酵將桑葉加入黑曲霉種子液中，每IOOmL黑曲霉種子液中加入桑葉0. 6g,恒溫振蕩培養得到發酵液，黑曲霉種子液的pH為5. 0，培養溫度為28 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為12h ；(3)提取及純化離心發酵液，下層沉淀與鹽酸水溶液恒溫浸提后離心，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 07mol/L,每IOOmL鹽酸水溶液中加入3g沉淀，浸提溫度為80°C，取上層提取液；提取液濃縮離心后，加入三氯乙酸水溶液除去蛋白質后再離心；所得上清液經DXA-6大孔吸附樹脂分離，洗脫劑為無水乙醇；濃縮洗脫液，即得I-脫氧野尻霉素。實施例5直接利用鹽酸水溶液提取I-脫氧野尻霉素提取步驟桑葉一鹽酸浸提20min — HPLC分析。本實施例的提取過程和相應參數與實施例I中5-7步驟相同。結論1-脫氧野尻霉素的提取率為0. 010%。實施例6僅使用纖維素酶輔助提取桑葉中I-脫氧野尻霉素提取步驟為桑葉一纖維素酶處理一鹽酸浸提20min — HPLC分析。本實施例的提取過程和相應參數與實施例5基本相同，所不同的是桑葉要經過纖維素酶處理，然后再進行鹽酸浸提。在纖維素酶處理體系中，纖維素酶的濃度為0. 5g/L，pH為0. 5，處理時間為12h,體系體積為40mL。結論I-脫氧野尻霉素的提取率為0. 016%。
權利要求
1.一種桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (1)發酵將桑葉加入纖維素酶產生菌種子液中，恒溫振蕩培養得到發酵液； (2)提取及純化采用酸提取法或醇提取法提取發酵液，將所得提取液純化，得到I-脫氧野尻霉素。
2.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于步驟(I)中，所述纖維素酶產生菌種子液由纖維素酶產生菌于產酶培養基中恒溫振蕩培養制得。
3.根據權利要求2所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于所述纖維素酶產生菌為里氏木霉(Trichoderma reseei)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、綠色木霉(Trichoderma viride)或黑曲霉 Aspergillus niger)。
4.根據權利要求2所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于所述產酶培養基的配方為葡萄糖I 3g/L,微晶纖維素2 3g/L,蛋白胨I 2g/L, (NH4)2SO42 3g/L, KH2P043 4g/L,尿素 O. 4 O. 6g/L, CaCl2 · 2H20 O. 6 I. Og/L, MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 8g/L, FeSO4 ·7Η20 O. 7 I. I X 10_2g/L, MnSO4 ·Η20 2· 6 4· 8 X 10_3g/L, ZnSO4 ·Η20 2· 6 4· 0Xl(T3g/L, CoC12 · 6Η20 5· O 8· 0Xl(T3g/L，吐溫 800. 3 O. 5g/L,其余為水，5. O 7. O。
5.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于步驟(I)中，每IOOmL纖維素酶產生菌種子液中加入桑葉O. 2-1. Og。
6.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于步驟(I)中，所述纖維素酶產生菌種子液的pH為5. O 7. O。
7.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于培養溫度為28 35°C，振蕩速度為150 180r/min，培養時間為6 24h。
8.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于步驟(2)中，所述酸提取法包括以下步驟離心發酵液，下層沉淀與酸水溶液恒溫浸提后離心，取上層提取液；下層沉淀重復上述操作；合并提取液。
9.根據權利要求8所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于所述酸水溶液為鹽酸水溶液，所述鹽酸水溶液的濃度為O. 03 O. 07mol/L，每IOOmL鹽酸水溶液中加入l_3g沉淀，浸提溫度為60-80°C。
10.根據權利要求I所述的桑葉中I-脫氧野尻霉素的提取方法，其特征在于步驟(2)中，所述提取液純化包括以下步驟提取液加入三氯乙酸水溶液后離心；所得上清液經大孔吸附樹脂分離，洗脫劑為無水乙醇；濃縮洗脫液，即得I-脫氧野尻霉素。
全文摘要
本發明公開了一種桑葉中1-脫氧野尻霉素的提取方法，包括步驟一發酵，將桑葉加入纖維素酶產生菌種子液中，恒溫振蕩培養得到發酵液；提取步驟二離心發酵液，下層沉淀與鹽酸水溶液恒溫浸提后離心，取上層提取液；下層沉淀重復上述操作；合并提取液；步驟三純化，用大孔樹脂除雜質，用無水乙醇洗脫1-脫氧野尻霉素，減壓蒸餾除去無水乙醇，冷凍干燥得到成品1-脫氧野尻霉素。本發明提供的一種桑葉中1-脫氧野尻霉素的提取方法提取效率高、成本低。
文檔編號C07D211/46GK102675188SQ201210159880
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月21日 優先權日2012年5月21日
發明者吳再強, 季更生, 李強, 谷緒頂, 費娟娟 申請人:江蘇科技大學