專利名稱：形成二酮哌嗪的二肽連接子的制作方法
技術領域：
本發明系關于一種用于N端肽片段PEP-N及C端肽片段C-PEP的均質溶液相肽合成(HSPPS)的方法，其中C-PEP帶有包含二酮哌嗪(DKP)的特定C端保護基，其含有柄狀基團(handle group)HG，其中該HG系連接至肽片段的C端；從而此包含DKP的特定C端保護基可自肽如同習知所用的C端保護基一般選擇性裂解。藉由使用此包含DKP及HG的C端保護基，可避免基于HSPPS及固相肽合成(SPPS)的組合的匯集肽合成中的某些方法步驟。本發明進一步關于一種藉由SPPS制備該經特定保護的片段C-PEP的方法，其系藉由使用包含特定二肽及HG的連接子以使生長中的肽鏈連接至樹脂而達成，當肽片段C-PEP自支撐樹脂裂解時，該連接子形成該DKP基團；且進一步關于制備方法的中間物。
背景技術：
在本文中，除非另外說明，否則根據「Nomenclature and symbolism for aminoacidsand peptides J, Pure& Appl.Chem.,第 56 卷，第 5 期，第 595-624 頁,1984 使用氨基酸及肽的命名。除非另外說明，否則以下縮寫具有下列清單中所給出的意義:CTC氯三苯甲基氯Alloc 烯丙氧基羰基Boc叔丁氧羰基Bsmoc 1，1-二側氧基苯并[b]噻吩_2_基甲氧羰基Bzl或Bn苯甲基c Hx環己基CtC 端Dpr2，3-二胺基丙酸DdeN_l_ (4，4_ 二甲基_2，6_ 二側氧基亞環己基)乙基ivDde 1-(4，4_ 二甲基_2，6_ 二側氧基亞環己基)3_甲基丁基Ddzα，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基DKP2，5-二酮哌嗪Dmab 二甲胺基硼烷Fm9_荷基甲基Fmoc N-(荷基_9_甲氧擬基)Hpr哌啶-2-甲酸，高脯胺酸HSHSPPS混合固相及均質溶液相肽合成HSPPS 均質溶液相肽合成Hyp反_4_羥脯胺酸Mmt4-甲氧基三苯甲基Mpe3_ 甲基戊 _3_ 基
Mtt 4-甲基三苯甲基Orn 鳥胺酸Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基PG 保護基2-PhiPr 2_苯基異丙基 Pmc 2，2，5，7，8-五甲基色滿_6_磺酰基PNO2Z 硝基苯甲氧基羰基Py吡啶SPPS 固相肽合成tBu 叔丁基TES SiEt3,三乙基硅烷基TFA 三氟乙酸Tfac 二氣乙酸基Trt或Tr三苯基甲基或三苯甲基Z苯甲氧基羰基除非另外說明，否則術語「片段(fragment)」與「肽片段(peptide fragment)」以同義使用。除非另外說明，否則術語「柄狀物(handle)」及「柄狀基團(handle group)」(例如「Fmoc-Rink酸胺柄狀基團(Fmoc-Rink amide handle group)」、「Rink酸胺柄狀物(Rinkamide handle)」或「Rink酰胺柄狀基團(Rink amide handle group)」)與術語「連接子(linker)J (例如「Fmoc-Rink 酸胺連接子(Fmoc-Rink amide linker)」或 Fmoc-Rink-OH)常常以同義使用。常常藉由混合固相及均質溶液相肽合成HSHSPPS來制備肽:首先藉由固相肽合成SPPS來制備兩個或兩個以上肽片段，的后在溶液相中藉由均質溶液相肽合成HSPPS使其偶合，得到所需的目標肽。此方法因其組合SPPS與HSPPS兩者的優勢而尤其適用于工業規模制備大型肽。特定而言，可研發片段的SPPS且快速地按比例擴大而避免在相對較長片段的HSPPS中常常遇到的眾多溶解性問題。生產周期時間相較于溶液相方法較短。另外，由于尤其在偶合反應期間使用過量試劑而使得產率及純度常常較高，常常使得中間物無需純化。在對由SPPS制備的片段序列的選擇最佳化的后，方法的最終階段可藉由習知HSPPS方法按比例擴大。方法的此等最終階段為片段偶合及最終脫除氨基酸殘基的保護基，亦即脫除側鏈以及N端及C端的保護基，兩個階段皆在溶液中進行。因此，當應用HSHSPPS合成時，可利用SPPS的優勢(亦即快速合成具有高純度的片段)與溶液相合成的優勢(亦即充分監測偶合反應以及分離及視情況存在的純化，包括充分特性化所形成的中間片段)以尤其在工業規模上高效地制備妝。
在HSHSPPS中，始終使由SPPS制備的至少兩個片段PEP-N與C-PEP在溶液相中偶合以得到所需肽PEP，該PEP為最終肽，或同樣為中間肽片段而的后再與第三肽片段偶合，諸如此類。片段PEP-N在本文中提供肽PEP的N端，片段C-PEP提供肽PEP的C端，且因此片段PEP-N的C端與片段C-PEP的N端偶合得到肽PEP。在溶液相偶合期間需要保護片段PEP-N的N端且需要保護片段C-PEP的C端以免片段PEP-N與片段PEP-N、片段C-PEP與片段C-PEP，或片段C-PEP與片段PEP-N以錯誤方向發生不合需要的偶合。除非另外說明，否則此N端經保護的肽片段PEP-N在下文中亦稱為PEP-Ν。由SPPS在支撐樹脂上制備的片段C-PEP在添加最后一個氨基酸殘基的后將帶有N端保護基，且接著將在最終步驟中自支撐樹脂裂解。此裂解通常產生C端未經保護的片段C-PEP，其須在片段C-PEP與片段PEP-N在HSPPS中偶合之前在另一步驟中加以保護。實際上，此對片段C-PEP的C端的必要保護并非僅包含I個步驟，而是包含若干個步驟，諸如反應、純化及分離，可能具有另一后續純化及分離。在欲制備的目標肽PEP為肽酰胺PEP-NH2 (亦即其中C端為羧酰胺基)的情況下，在于HSPPS中片段偶合期間，由于羧酰胺基自身可充當保護基，故各別片段C-PEP-NH2的C端通常不需要保護。雖然C端為羧酸的片段C-PEP-OH可容易地在SPPS的后藉由使用在裂解后形成羧酸基的樹脂來獲得，但使用在裂解后形成羧酰胺基的樹脂(例如齊貝爾酰胺樹脂(Sieber amide resin))會因片段C-PEP-NH2的側鏈在裂解期間部分脫除保護基而引發問題，此系因為自酰胺樹脂裂解典型地需要酸性條件，諸如使用于溶劑中的3重量％至5重量％的TFA，而側鏈保護基(諸如在Fmoc/Trt SPPS的情況下為Trt (例如His (Trt))或諸如假脯胺酸衍生物(亦即Fmoc-Ser (tBu) -Thr (psiMe, Mepro) -OH)中的縮醛)在該等裂解條件下不完全穩定，導致側鏈保護基部分喪失。因此為制備片段C-PEP-NH2，通常以自所需片段C-PEP-NH2的C端氨基酸殘基起第二位置上的氨基酸而非以片段C-PEP-NH2的C端氨基酸本身，且以在裂解后提供羧酸 作為C端的樹脂開始SPPS。自樹脂裂解因此可得到無所需片段C-PEP-NH2的C端氨基酸的片段C-0H，且其中此片段C-OH的C端為自最終所需片段C-PEP-NH2的C端起第二位置上的氨基酸且帶有羧酸基。接著使片段C-PEP-NH2缺少的C端氨基酸在溶液相中以其酰胺H-Xaa-NH2形式單獨偶合至片段C-0H。W090/09395揭示在肽與支撐樹脂之間使用可裂解連接子，其在自樹脂裂解時形成二酮哌嗪(DKP)連接子基團，其中該DKP基團經由連接子基團中的Lys的ε胺基與肽的C端之間的酰胺鍵連接至肽。此DKP連接子基團在隨后階段中不可自肽選擇性移除。因此，其不允許制備適用于HSPPS中的具有未經保護的N端且C端完全經保護的片段。此外，W090/09395的連接子基團不允許制備天然或未經修飾的肽。其僅適用于合成C端永久經修飾的肽，此系因為任何自樹脂裂解的肽在其C端上始終帶有DKP連接子基團，其在肽的其它肽鍵不裂解的情況下不可裂解。另一缺點為其裂解僅限于在裂解步驟期間使用三氟乙酸(TFA)，表示將會部分或全部移除肽的氨基酸殘基側鏈的任何基于tBu、Boc, Trt或縮醛的保護基，從而其使用僅限于制備具有未經保護的側鏈的肽或除tBu、B0C、Trt及縮醛以外的側鏈保護基。

發明內容
需要藉由減少反應順序中的步驟數目來簡化HSHSPPS的程序。令人驚奇的是，此可藉由在用于制備片段C-PEP的SPPS中使用特定的形成二酮哌嗪基的二肽連接子來達成，該二肽連接子帶有特定的包含二酮哌嗪的C端保護基，以及適當組合不同類型的保護基與連接子與片段C-PEP連接的特定化學性質以使連接子有可能自片段特定裂解。就本發明而言，保護基(PG)根據其系用于保護氨基酸側鏈中的官能基或用于保護氨基酸或肽的N端胺基或C端羧基而分為四個不同群組:1.堿可裂解型保護基，在下文中稱為“堿型PG”，2.強酸可裂解型保護基，在下文中稱為“強型PG”，3.弱酸可裂解型保護基，在下文中稱為“弱型PG”，及4.還原可裂解型保護基，在下文中稱為“還原型PG”，其中兩個群組「強型PG」及「弱型PG」亦統稱為“酸可裂解型保護基”或“酸型PG”。在本發明的意義范圍內，任何PG系根據下列四種分類反應條件加以分類。使用加載容量為每克樹脂1.5mmol至1.7mmol的CTC樹脂進行分類，僅以帶有欲分類的各別PG的一種氨基酸加載樹脂。除非另外說明，否則下列四種分類程序中的術語「份(part)」意謂所加載的CTC樹脂起始物質的重量份率。1.用于堿型PG的分類反應條件，在下文中稱為“堿性分類條件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液處理加載有帶有堿型PG的氨基酸的樹脂25 土 5分鐘，該裂解溶液由22.5 ± 2.5重量％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液組成，重量％系以裂解溶液的總重量計。2.用于強型PG的分類反應條件，在下文中稱為“強分類條件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液處理加載有帶有強型PG的氨基酸的樹脂25 ± 5分鐘，該裂解溶液由85 ± 5重量％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液組成，重量％系以裂解溶液的總重量計。3.用于弱型PG的分類反應條件，在下文中稱為“弱分類條件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液處理加載有帶有弱型PG的氨基酸的樹脂25±5分鐘，該裂解溶液由2± I重量％TFA的DCM溶液組成，重量％系以裂解溶液的總重量計。4.用于還原型PG的分類反應條件，在下文中稱為“還原分類條件”:在25 ± 5°C下用溶解于DMF中的7 ± I份DMF及0.1摩爾當量的可溶性有機Pd (O)催化劑(較佳為Pd[PPhJ4)處理加載有帶有還原型PG的氨基酸的樹脂30±5分鐘，摩爾當量系以加載至樹脂上的可裂解基團的摩爾數計。肽化學中習知使用的PG以及用于裂解PG的典型反應條件及參數以及試劑在此項技術中已知，例如 T.W.Greene, P.G.M.Wuts,「Protective Groups in OrganicSynthesis」，John ffiley&Sons, Inc., 1999 ;或 Lloyd-ffilliams, P., Albericio, F., Giralt,E., 「Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins」，CRC:BocaRaton, Florida, 1997。堿型PG較佳在下列可能的反應條件(在下文中稱為“堿性裂解條件”)下裂解:堿性裂解條件涉及用堿性裂解溶液處理各別物質。堿性裂解溶液包含堿性試劑及溶劑。堿性裂解溶液較佳由堿性試劑及溶劑組成。若堿性試劑在進行堿性裂解的溫度下為液體，則堿性試劑亦可同時用作溶劑，亦即不使用不同于堿性試劑的溶劑。堿性試劑較佳為二級胺，堿性試劑更佳選自由以下組成的群:哌啶、4_(胺基甲基)哌唆、三(2-胺基乙基)胺、嗎啉、二環己胺、1，3-環己烷雙(甲基胺)哌嗪、1，8_ 二氮雜雙環[5.4.0] i^一 -7-烯，及其混合物。堿性試劑甚至更佳為哌啶。堿性裂解溶液亦可包含添加劑， 添加劑較佳選自由以下組成的群:6_氯-1-羥基-苯并三唑、2，4- 二硝基苯酚、苦味酸、1-羥基-7-氮雜苯并三唑、1-羥基-苯并三唑及2-氰基-2-羥亞胺基-乙酸乙酯，及其混合物。溶劑較佳選自由以下組成的群:二甲亞砜(DMS0)、二噁烷、四氫呋喃(THF)U-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)、吡啶、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、氯仿、二噁烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲苯、乙腈及其混合物；溶劑更佳為1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物。在此對堿性裂解條件的描述中術語「份(part)」意謂帶有堿型PG的所處理物質的重量份率。較佳使用5份至20份堿性裂解溶液，更佳使用5份至15份堿性裂解溶液。 堿性試劑的量較佳為I重量％至30重量％，更佳為10重量％至25重量％，甚至更佳為15重量％至20重量％，其中重量％系以堿性裂解溶液的總重量計。較佳在10°C至50°C的溫度下，更佳在10°C至30°C的溫度下，甚至更佳在15°C至25 0C的溫度下進行堿性裂解。較佳在大氣壓下進行堿性裂解。堿性裂解的反應時間較佳為5分鐘至2小時，更佳為10分鐘至I小時，甚至更佳為15分鐘至30分鐘。強型PG較佳在下列可能的反應條件(在下文中稱為“強裂解條件”)下裂解:強裂解條件涉及用強裂解溶液處理各別物質。強裂解溶液包含酸解性試劑(acidolytic reagent)。酸解性試劑較佳選自由以下組成的群:氫酸,諸如三氟乙酸(TFA)、鹽酸(HC1)、鹽酸(HCl )水溶液、液體氫氟酸(HF)或三氟甲燒磺酸；劉易斯酸(Lewis acid),諸如三氟硼酸-乙醚加合物或三甲基硅烷基溴，及其混合物。強裂解溶液較佳包含一或多種清除劑，該等清除劑選自由以下組成的群:二硫蘇糖醇(DTT)、乙烷二硫醇(EDT)、二甲基硫化物(DMS)、三異丙基硅烷(TIS)、三乙基硅烷(TES)、1，3-二甲氧基苯(DMB)、苯酚、苯甲醚、對甲酚及其混合物。強裂解溶液亦可包含水、溶劑或其混合物，該溶劑在強裂解條件下穩定。較佳，溶劑選自由以下組成的群:二氯甲烷、二氯乙烷、乙腈、甲苯、四氫呋喃、TFA、二噁烷及其混合物。更佳，酸解性試劑同時用作溶劑，因此不需要其它溶劑。在此對強裂解溶液的描述中術語「份(part)」意謂帶有強型PG的所處理物質的重
量份率。較佳使用10份至30份強裂解溶液，更佳使用15份至25份強裂解溶液，甚至更佳使用19份至21份強裂解溶液。酸解性試劑的量較佳為30重量％至100重量％，更佳為50重量％至100重量％，甚至更佳為70重量％至100重量％，尤其為80重量％至100重量％，其中重量％系以強裂解溶液的總重量計。較佳使用總量為I重量％至25重量％的清除劑，更佳使用總量為5重量％至15重量％的清除劑，其中重量％系以強裂解溶液的總重量計。較佳在-10°C至30°C的溫度下，更佳在-10°C至30°C的溫度下，甚至更佳在5°C至15°C的溫度下進行強裂解。
較佳在大氣壓下進行強裂解。強裂解的反應時間較佳為30分鐘至20小時，更佳為I小時至10小時，甚至更佳為I小時至5小時。弱型PG較佳在下列可能的反應條件(在下文中稱為“弱裂解條件”)下裂解:弱裂解條件涉及用弱裂解溶液處理各別物質。弱裂解溶液包含酸解性試劑。酸解性試劑較佳選自由以下組成的群:氫酸，諸如三氟乙酸(TFA)、三氟乙醇(TFE)、鹽酸(HC1)、乙酸(AcOH)，其混合物及/或與水的混合物。弱裂解溶液亦包含水、溶劑或其混合物，該溶劑在弱裂解條件下穩定。溶劑較佳選自由以下組成的群:二氯甲烷、二氯乙烷、乙腈、甲苯、四氫呋喃、TFA、二噁烷及其混合物。在此對弱裂解溶液的描述中術語「份(part)」意謂帶有弱型PG的所處理物質的重
量份率。較佳使用4份至20份弱裂解溶液,更佳使用5份至10份弱裂解溶液。酸解性試劑的量較佳為0.01重量％至5重量％，更佳為0.1重量％至5重量％，甚至更佳為0.15重量％至3重量％，其中重量％系以弱裂解溶液的總重量計。較佳在10°C至50°C的溫度下，更佳在20°C至40°C的溫度下，甚至更佳在25°C至35°C的溫度下進行弱裂解。較佳在大氣壓下進行弱裂解。

弱裂解的反應時間較佳為5分鐘至2小時，更佳為10分鐘至I小時，甚至更佳為10分鐘至30分鐘。弱型PG可再分為其它群組，此等群組彼此相區別且可根據裂解所需的酸的量連續排列。根據上述對弱分類條件的定義，所有弱型PG可使用2±1重量％TFA的DCM溶液裂解，重量％系以裂解溶液的總重量計。僅可由至少I重量％TFA的DCM溶液裂解，而不可由含較少量TFA的溶液裂解的弱型PG稱為「弱I型PG」且該等裂解條件稱為“弱I型裂解條件”；已可由至少0.1重量％TFA的DCM溶液裂解，而不可由含較少量TFA的溶液裂解的弱型PG稱為“弱2型PG”且該等裂解條件稱為“弱2型條件”；已可由至少0.01重量％TFA的DCM溶液裂解的弱型PG稱為”弱3型PG”且該等裂解條件稱為“弱3型條件”；重量％系以裂解溶液的總重量計。還原型PG較佳在下列可能的反應條件(在下文中稱為“還原裂解條件”)下裂解:還原裂解條件涉及用還原性裂解溶液處理各別物質。還原性裂解溶液包含催化齊U、添加劑及溶劑。催化劑較佳選自由Pd(O)的有機衍生物及Pd(II)的有機衍生物組成的群，更佳選自由以下組成的群:Pd[PPh3]4>PdCl2[PPh3]2> Pd[OAc]2[P(2，4-二甲苯酰基)3]2、Pd
2[P(鄰甲苯基)3]2、就地制備的Pd(O)催化劑，其系藉由混合穩定性較低的配位Pd錯合物與配體來制備，諸如 PdCl2 (PPh3) 2/PPh3、PdCl2 (PPh3) 2/P (鄰甲苯基)3、Pd (DBA) 2/P (鄰甲苯基)3 或Pd [P (鄰甲苯基)3] 2、Pd (OAc) / 亞磷酸三乙酯、Pd (OAc) 2/PPh3 或 Pd (OAc) 2/P (鄰甲苯基)3，
及其混合物；甚至更佳選自由以下組成的群:Pd[PPh3] 4、PdCl2 [PPh3] 2、Pd [OAc] 2 [P (2，4_ 二甲苯酰基)3] 2、Pd [OAc] 2 [P (鄰甲苯基)3] 2及其混合物。添加劑較佳選自由以下組成的群:二甲基巴比妥酸、硫代水楊酸、N-甲基苯胺、Bu4N+BH4' NH3BH3、Me2NHBH3、tBu_NH2BH3、Me3NBH3、PyBH3、HC00H/DIEA、二乙基二硫代胺基甲酸鈉、雙甲酮(dimedone)、嗎啉、AcOH/NMM、苯基硅烷、亞磺酸(包含PhS02H、tolS02Na)、2_乙基己酸鈉(SHO、2-噻吩亞磺酸鈉(STS)、4-氯-3-硝基苯亞磺酸鈉(SCNBS)及i_BuS02Na，及其混合物；添加劑更佳為tolS02Na。溶劑較佳選自由以下組成的群:二甲亞砜(DMS0)、二噁烷、四氫呋喃(THF)、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)、吡啶、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、氯仿、二噁烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲苯、乙腈及其混合物；溶劑更佳為1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物。較佳，催化劑 可溶解于溶劑中且已溶解于溶劑中。在此對還原裂解條件的描述中術語「份(part)」意謂帶有還原型PG的所處理物質
的重量份率。較佳使用4份至20份還原性裂解溶液，更佳使用5份至10份還原性裂解溶液。較佳使用0.001摩爾當量至I摩爾當量的催化劑，更佳使用0.01摩爾當量至0.05摩爾當量的催化劑，該摩爾當量系以加載至樹脂上的還原可裂解基團的摩爾數計。較佳使用I摩爾當量至10摩爾當量的添加劑,更佳使用1.5摩爾當量至5摩爾當量的添加劑，該摩爾當量系以加載至樹脂上的還原可裂解基團的摩爾數計。較佳在10°C至60°C的溫度下，更佳在30°C至50°C的溫度下，甚至更佳在35°C至45 °C的溫度下進行還原裂解。較佳在大氣壓下進行還原裂解。還原裂解的反應時間較佳為15分鐘至10小時，更佳為30分鐘至4小時，甚至更佳為30分鐘至2小時。還原性裂解溶液較佳應避光保存。較佳在由金屬制成的容器中進行還原裂解。堿型PG不可由強裂解條件或弱裂解條件所裂解。較佳，堿型PG不可由強裂解條件、弱裂解條件或還原裂解條件所裂解。強型PG不可由弱裂解條件或堿性裂解條件所裂解。較佳，強型PG不可由弱裂解條件、堿性裂解條件或還原裂解條件所裂解。弱型PG不可由堿性裂解條件所裂解，但其可由強裂解條件所裂解。較佳，弱型PG不可由堿性裂解條件或還原裂解條件所裂解，但其可由強裂解條件所裂解。弱I型PG不可由弱2型裂解條件或弱3型裂解條件所裂解；弱2型PG可由弱I型裂解條件所裂解，但不可由弱3型裂解條件所裂解；弱3型PG可由弱I型裂解條件及弱2型裂解條件所裂解。較佳，弱I型PG、弱2型PG及弱3型PG亦不可由堿性裂解條件或還原裂解條件所裂解。較佳，還原型PG不可由強裂解條件、弱裂解條件及堿性裂解條件所裂解，此等PG稱為“單獨還原型PG”。還原型PG不可由弱裂解條件及堿性裂解條件所裂解，但可由強裂解條件所裂解；此等PG稱為“混合型PG”。連接子與肽的連接亦可分類為可在此四種裂解條件之一下裂解。氨基酸與樹脂的連接亦可分類為可在此四種裂解條件之一下裂解。較佳,堿型PG選自由以下組成的群:Fmoc、Bsmoc> Tfac、Dde> Dmab及cHx。較佳，強型PG 選自由以下組成的群:Boc、tBu、Pmc、Mpe、Pbf、Z、Bzl、cHx、pN02Z 及Ddz。較佳,弱型PG選自由以下組成的群:Trt、Mmt、Mtt、縮醒及2_PhiPr。弱型PG實際上為弱I型PG抑或弱2型PG，視其保護的側鏈基團而定。較佳,還原型PG選自由Alloc、烯丙基、ivDde及Z組成的群。更佳，堿型PG為Fmoc。 更佳，強型PG為Boc。更佳，弱型PG為Trt。更佳，還原型PG為Alloc。在習知SPPS中，在完成SPPS的后自樹脂裂解肽，該裂解產生視SPPS中所用的樹脂及可能選用的柄狀物而定C端呈自由羧酸基形式或呈羧酰胺形式的肽。若在HSPPS中使用此在C端上具有自由羧基的肽作為C端肽片段C-PEP，則首先須保護此自由羧酸基，的后該肽可用于HSPPS中。此對自由C端的保護需要若干方法步驟(反應、分離，或許純化)。本發明揭示一種減少此等為保護片段中由在SPPS后自樹脂裂解片段而產生的C端自由羧酸所需的步驟的方法。此系藉由在SPPS中使用該形成二酮哌嗪的二肽連接子以使所需片段C-PEP的第一氨基酸XaaCil)經由該連接子偶合于樹脂支撐物上來達成，該連接子在完成SPPS且自樹脂裂解所合成的片段C-PEP時形成包含二酮哌嗪殘基的C端保護基。形成二酮哌嗪的二肽連接子包含二肽部分，其第一氨基酸Xaal經由其羧酸基連接至樹脂，且其第二氨基酸Xaa2經由其側鏈連接柄狀基團HG，該柄狀基團HG連接至肽基，且Xaa2帶有N端保護基PG2。該包含二酮哌嗪殘基的C端保護基系藉由以下而形成:裂解Xaa2的保護基PG2，從而使得Xaa2與Xaal之間有可能進行分子內死循環，該死循環形成該二酮哌嗪殘基且同時使Xaal自樹脂裂解。此藉由自樹脂裂解而形成的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基在自樹脂裂解后仍連接至片段C-PEP的C端且從而充當片段C-PEP的C端的保護基，該片段C-PEP因此可直接用于HSPPS中。在此C端片段C-PEP與N端肽片段PEP-N藉由HSPPS偶合產生肽PEP后，使包含二酮哌嗪殘基的C端保護基自肽PEP裂解，較佳與脫除片段PEP中的任何經保護側鏈的保護基同時進行。形成二酮哌嗪的二肽連接子及所得的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基包含柄狀基團HG，其使得肽PEP有可能自包含二酮哌嗪殘基的C端保護基裂解。為使此所需功能成為可能，以某種方式建構該形成二酮哌嗪的二肽連接子，以使以下四個主要裂解步驟:1.在SPPS的循環期間裂解氨基酸的各N端保護基，
2.藉由以下使片段C-PEP自樹脂裂解:使保護基PG2自Xaa2裂解，且接著藉由形成包含二酮哌嗪殘基的C端保護基使Xaal自樹脂裂解，及3.使包含二酮哌嗪殘基的C端保護基自肽PEP裂解，該裂解為使肽自包含二酮哌嗪殘基的C端保護基中的HG裂解；4.裂解任何側鏈PG;可在不同反應條件下進行，因此各裂解可各別地且獨立于其它裂解在反應順序中的適當時間點進行。為達成此功能，涉及反應策略中的各種PG的化學性質以及連接子的柄狀基團HG與肽的連接的化學性質系以如下方式選擇，以使任何PG以某種方式屬于四種PG類型之一，且柄狀基團HG與肽的連接可在該等反應條件下裂解，以使此對保護基的分組以及此對柄狀基團HG與肽的連接性質的選擇允許所需且必要的各別及逐步裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多個側鏈PG，則一個較佳具體實例為1.任何側鏈保護基為強型PG、還原型PG或混合型PG ;及2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外) 的任何N端PG為堿型PG，或若任何側鏈保護基不為還原型PG或混合型PG，則SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG為堿型PG、還原型PG或混合型PG ;及3.若任何側鏈保護基及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不為還原型或混合型PG，則PG2為弱型、還原型或混合型PG，或PG2為弱型PG;及4.SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型PG或弱型PG，或若任何側鏈保護基不為還原型或混合型PG，則SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型PG、弱型PG、還原型PG或混合型PG ;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基可在以下條件下自肽PEP或C-PEP裂解:在強裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為還原型或混合型PG,則在強裂解條件或還原裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為弱型PG，則在弱裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為弱I型PG，則在弱I型裂解條件下裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多個側鏈PG，則一個更佳具體實例為
1.任何側鏈保護基為強型PG ;及
2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG為堿型PG ;及3.若任何側鏈保護基及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不為還原型或混合型PG，則PG2為弱型、還原型或混合型PG ;及4.若任何側鏈保護基不為還原型或混合型PG，則SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型PG、弱型PG、還原型PG或混合型PG;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基可在以下條件下自肽PEP或C-PEP裂解:在強裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為還原型或混合型PG,則在強裂解條件或還原裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為弱型PG，則在弱裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為弱I型PG，則在弱I型裂解條件下裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多個側鏈PG，則另一個更佳具體實例為1.任何側鏈保護基為強型PG、還原型PG或混合型PG ;及2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG為堿型PG ;及3.PG2 為弱型 PG;及4.SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型PG或弱型PG ;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基可在以下條件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為還原型或混合型PG,則在強裂解條件或還原裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為弱I型PG，則在弱I型裂解條件下裂解。若所需肽C-PEP中不存在側鏈PG，則一個較佳具體實例為1.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG為堿型、還原型或混合型PG ;及2.若SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不為還原型或混合型PG，則PG2為強型、弱型、還原型或混合型PG，或
PG2為強型、弱型或混合型PG ;及3.SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型、強型、弱型、還原型或混合型PG ;及4.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基可在以下條件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型PG，則在強裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型、還原型及混合型PG，則在強裂解條件或還原裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型或弱型PG，則在弱裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型或弱I型PG，則在弱I型裂解條件下裂解。若所需肽C-PEP中不存在側鏈PG，則一個更佳具體實例為1.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一個氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG為堿型PG ;及2.PG2為強型、弱型、還原型或混合型PG，或3.SPPS中用于合成C-PEP的最后一個氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG為堿型、強型、弱型、還原型或混合型PG ;及4.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪殘基的C端保護基可在以下條件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型PG，則在強裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型、還原型及混合型PG，則在強裂解條件或還原裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型或弱型PG，則在弱裂解條件下裂解，或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不為強型或弱I型PG，則在弱I型裂解條件下裂解。本發明的主題為制備肽C-PEP的方法(C-PEP)，C-PEP包含肽基PEP-C，PEP-C的C端由保護基DKP-PG保護，DKP-PG包含柄狀基團HG，視情況包含間隔基SG且包含二酮哌嗪殘基DKP ；SG為肽化學中習知使用的間隔基；DKP為衍生自二肽殘基DPR的二酮哌嗪殘基；DPR包含α氨基酸殘基Xaal及Xaa2 ；Xaal為DPR 的C端氨基酸殘基；Xaa2為DPR的N端氨基酸殘基，且Xaa2具有側鏈，該側鏈經官能基FG取代；PEP-C 經由 XaaC(1)連接至 HG ；
XaaC為PEP-C的氨基酸殘基；XaaC(1)中的索引(I)表示PEP-C的C端位置；XaaCω為PEP-C的C端氨基酸殘基； HG為固相肽合成SPPS中習知用于使肽的C端連接至固相的柄狀基團，其允許C端在不使肽中連接兩個氨基酸殘基的酰胺鍵裂解的條件下自HG裂解；HG直接連接至FG，或若存在SG，則HG連接至SG且SG連接至FG ；方法(C-PEP)包含步驟(iii);步驟(iii)包含反應(INRIFO);反應(INRIFO)為如下反應，其包含在肽PEP-C-DKP-L-樹脂A中的分子內成環反應及同時的裂解反應；PEP-C-DKP-L-樹脂A為C-PEP的前驅體且包含PEP-C及樹脂DKP-L-樹脂A，其中PEP-C系連接至DKP-L-樹脂A ；DKP-L-樹脂A包含樹脂A及形成DKP-PG的連接子DKP-L，其中樹脂A系連接至DKP-L,樹脂A為在SPPS中習知用作固相`的樹脂，DKP-L包含HG，視情況包含SG，及DPR，其中DPR的C端羧酸基(其為Xaal的羧酸基)連接至樹脂A ；
`
反應(INRIFO)中的分子內成環為DPR的N端胺基(其為Xaa2的α胺基)與DPR的C端羧酸基進行反應，從而形成DKP，從而同時使Xaal自樹脂A裂解且形成DKP-PG ；HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCw之間的鍵不在反應(INRIFO)期間裂解。藉由使用HG，提供XaaC(1)與樹脂A之間的裂解位點，該裂解位點可在肽中任何介于兩個氨基酸之間的酰胺鍵不裂解的情況下選擇性裂解；該裂解位點為XaaCw與HG之間的鍵。藉由此裂解，以未經保護的自由羧酸基形式釋放XaaC(1)的C端，或以酰胺基形式，較佳以C(O)NH2形式釋放C端羧酸基，視HG的化學性質而定。藉由使用HG，此包含DKP的特定C端保護基如同肽化學中習知使用的C端保護基
一般起作用。較佳，在反應(INRIFO)之前藉由固相肽合成SPPS (PEP-C)制備PEP-C，SPPS(PEP-C)更佳使用DKP-L-樹脂A作為固相。因此，本發明的另一主題為方法(C-PEP)，其中該方法(C-PEP)以及其所有較佳具體實例如上文所定義，其中在步驟(iii)之前藉由固相肽合成SPPS (PEP-C)制備PEP-C，SPPS (PEP-C)更佳使用DKP-L-樹脂A作為固相。在SPPS (PEP-C)中，藉由使XaaC首先連續地偶合至固相，接著偶合至生長中的肽鏈來構筑PEP-C。各個XaaC可個別且依序地偶合，但其中兩者或兩者以上亦可例如以二肽、三肽或寡肽形式偶合至固相或偶合至生長中的肽鏈。樹脂A以某種方式選擇，以使樹脂A與Xaal之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。較佳，SPPS (PEP-C)進一步包含步驟(i)及步驟(ii)；在步驟(i )中，使XaaC(1)連接至DKP-L-樹脂A ；在步驟(ii)中，藉由SPPS (PEP-C)使其它氨基酸XaaC根據PEP-C的序列連續地最初連接至XaaCw且接著連接至生長中的肽基鏈的N端，該生長中的肽基鏈經由DKP-L結合至樹脂A ;HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCw之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解；且HG與XaaC(1)之間的鍵不在反應(INRIFO)期間裂解；其中C-PEPjMg A、DKP-PG, HG、SG、DPR、DKP、XaaU XaaC(1)、XaaC, PEP-C、SC-PG,反應(INRIFO)以及其所有較佳具體實例如上文所定義；且其中PEP-C、HG、SG及DPR以及樹脂A之間的連接性以及其所有較佳具體實例如上文所定義。在反應(INRIF0)之前，藉由保護基PG2保護DPR的N端，該N端為Xaa2的α胺基。因此，本發明的另一主題為方法(C-PEP)，其中該方法(C-PEP)以及其所有較佳具體實例如上文所定義，其中步驟(iii)包含裂解保護基PG2 ；PG2為肽化學中習知使用的N端保護基且選自由以下組成的群:堿可裂解型保護基、酸可裂解型保護基以及還原可裂解型保護基。在反應(INRIFO)之前在步驟(iii)中使PG2自Xaa2裂解。較佳，在SPPS (PEP-C)的后使PG2自Xaa2裂解。較佳，在步驟(ii)中添加PEP-C的N端氨基酸殘基的后使PG2自Xaa2裂解。

使PG2自Xaa2裂解可與反應(INRIFO)連續或同時進行。PG2以某種方式選擇，以使PG2與Xaa2之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。PG2及HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCil)之間的鍵不在使PG2自Xaa2裂解期間裂解。在C-PEP或PEP-C中存在I個以上SC-PG的情況下，C-PEP或PEP-C的任何側鏈可獨立于C-PEP或PEP-C的任何其它側鏈由保護基SC-PG保護，此等SC-PG彼此獨立地相同或不同。任何SC-PG為肽化學中習知用于在SPPS期間或在HSPPS期間保護肽的氨基酸殘基的側鏈或保護氨基酸的側鏈的保護基。較佳，任何SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期間裂解。較佳，任何SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在反應(INRIFO)期間裂解。較佳，PG2及任何保護基SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在使PG2自Xaa2裂解期間裂解。為避免冗述，針對用于合成PEP-C及C-PEP的氨基酸使用縮寫XaaC，或將其分別用于PEP-C及C-PEP或PEP-N的氨基酸殘基；且同樣，針對用于合成PEP-N的氨基酸使用XaaN,或將其用于PEP-N的氨基酸殘基。因此，此等縮寫不區分氨基酸與氨基酸殘基。熟習此項技術者可根據上下文明確區分表示氨基酸抑或氨基酸殘基。為概述連接性:PEP-C 經由 XaaC(1)連接至 HG。HG經由FG直接連接至Xaa2，或若存在SG，則HG連接至SG且SG經由FG連接至
Χββ2 οXaa2經由肽鍵與Xaal連接，在DPR中Xaa2為N端氨基酸且Xaal為C端氨基酸。
在PEP-C-DKP-L-樹脂A中，Xaal的羧酸基連接至樹脂A。樹脂A以某種方式選擇，以使樹脂A與Xaal之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCw之間的鍵不在反應(INRIFO)期間裂解。HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCw之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。PG2以某種方式選擇，以使PG2與Xaa2之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。PG2及HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCil)之間的鍵不在使PG2自Xaa2裂解期間裂解。較佳，任何SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期間裂解。較佳，任何SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在反應(INRIFO)期間裂解。較佳，PG2及任何保護基SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在使PG2自Xaa2裂解期間裂解。較佳，C-PEP為 PEP-C，其 C 端由 DKP-PG 保護。較佳，DPR由氨基酸殘基Xaal及Xaa2組成。Xaal及Xaa2以某種方式選擇，以使其允許藉由反應(INRIFO)形成DKP。較佳，C-PEP的任何側鏈由保護基SC-PG保護。若C-PEP中存在任何SC-PG，則較佳以某種方式選擇HG，以使HG及從而DKP-PG在裂解SC-PG、較佳所有SC-PG的反應中同時自XaaCw裂解。較佳，SC-PG選自由堿可裂解型保護基、酸可裂解型保護基及還原可裂解型保護基組成的群。更佳，任何SC-PG為強型PG。較佳，FG在連接至HG或連接至SG時以連接基團CG形式存在。較佳，FG選自由C00H、NH2、OH及SH組成的群，更佳選自由NH2及OH組成的群；因此CG較佳選自由-C (O) O-、-N (H) _、-O-及-S-組成的群，更佳選自由-N (H)-及-O-組成的群。HG與FG之間的鍵，或若DKP-PG中存在SG，則HG與SG之間的鍵及SG與FG之間的鍵，經選擇而具有如下化學性質，其不在SPPS (PEP-C)期間裂解；且其不在反應(INRIF0)、步驟(i )、步驟(ii )或步驟(iii )期間裂解；較佳，其亦不在任何保護基的任何裂解期間裂解。較佳，HG與FG之間的鍵，或若DKP-PG中存在SG，則HG與SG之間的鍵及SG與FG之間的鍵，為酰胺鍵或酯鍵，更佳為酰胺鍵。尤其，此等鍵與肽中介于兩個氨基酸殘基之間的習知酰胺鍵具有相似的性質或穩定性。C-PEP的N端可由保護基N-PG保護，N-PG為肽化學中習知使用的N端保護基。較佳，N-PG選自由堿可裂解型保護基、酸可裂解型保護基及還原可裂解型保護基組成的群。 因此，C-PEP包含N端未經保護的具體實例及PEP-C的N端由N-PG保護的具體實例。本發明的另一主題為制備C-PEP的方法(C-PEP)，其特征在于步驟(i)、步驟(ii)及步驟(iii)，該等步驟包含固相肽合成SPPS (PEP-C)及后續反應(INRIFO)；在作為固體支撐物的樹脂DKP-L-樹脂A上進行SPPS (PEP-C),DKP-L-樹脂A為帶有形成DKP-PG的連接子DKP-L作為官能基的樹脂A，DKP-L包含HG，視情況包含SG，及DPR，其中DPR的Xaal經由其C端羧酸基連接至樹脂A，反應(INRIFO)為DPR的N端胺基與DPR的C端羧酸基進行分子內成環反應，從而形成DKP ；且藉由反應(INRIF0)，使Xaal同時自樹脂A裂解且形成DKP-PG ;在步驟(i )中，使XaaC(1)連接至DKP-L-樹脂A ；在步驟(ii)中，藉由SPPS (PEP-C)使其它氨基酸XaaC根據PEP-C的序列連續地最初連接至XaaCw且接著連接至生長中的肽鏈的N端，該生長中的肽鏈經由DKP-L結合至樹脂A ；

在步驟(ii)中添加PEP-C的N端氨基酸殘基的后進行步驟(iii)，在步驟(iii)中，藉由反應(INRIFO)形成C-PEP，樹脂A以某種方式選擇，以使樹脂A與Xaal之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解；HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCw之間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解；且HG與XaaC(1)之間的鍵不在反應(INRIF0)期間裂解；保護C-PEP的側鏈的任何SC-PG以某種方式選擇，以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期間裂解；且SC-PG不在反應(INRIF0)期間裂解；其中C-PEPjMg A、DKP-PG, HG、SG、DPR、DKP、XaaU XaaC(1)、XaaC、PEP-C、SC-PG、反應(INRIFO)以及其所有較佳具體實例如上文所定義；且其中PEP-C、HG、SG及DPR以及樹脂A之間的連接性以及其所有較佳具體實例如上文所定義。本發明的另一主題為制備形成DKP-PG的連接子DKP-L的方法(DKP-L)，方法(DKP-L)包含步驟(DKP-L-1)、步驟(DKP_L_iii)且視情況包含步驟(DKP-L-1i)；在步驟(DKP-L-1)中，使 Xaa2 偶合至 Xaal ；若DKP-L中存在SG，則在視情況選用的步驟(DKP_L_ii )中，使SG偶合至Xaa2 ；在步驟(DKP-L-1ii)中，若DKP-L中存在SG，則使HG偶合至SG，或使HG偶合至Xbb2 ；其中DKP-PG、DKP-L、DKP、Xaa2、Xaa1、HG及SG以及其所有較佳具體實例如上文所定義。步驟(DKP-L-1)、步驟(DKP-L-1ii)及視情況選用的步驟(DKP-L-1i)可以任何次
序進行。較佳，首先進行步驟(DKP-L-1)，若DKP-L中存在SG，則接著進行視情況選用的步驟(DKP-L-1 i )，且進行步驟(DKP-L-1 i i )作為最后步驟。本發明的另一主題為制備DKP-L-樹脂A的方法(DKP-L-樹脂A)，
方法(DKP-L-樹脂A)為方法(XI)或方法(X2)；方法(Xl)包含步驟(Xl-1)、步驟(Xl-1i)、步驟(Xl-1v)且視情況包含步驟(Xl-1ii)；在步驟(Xl-1)中，使氨基酸Xaal偶合至樹脂A ;在步驟(Xl-1i)中，使氨基酸Xaa2偶合至Xaal ；若DKP-L-樹脂A中存在SG，則在視情況選用的步驟(Xl_iii )中，使SG偶合至Xaa2的側鏈；在步驟(Xl-1v)中，若DKP-L-樹脂A中存在SG，則使HG偶合至SG，或使HG偶合至 Xaa2 ；方法(X2 )包含步驟(X2_i ); 在步驟(X2_i )中，使DPK-L偶合至樹脂A ；

其中DKP-L-樹脂 A、樹脂 A、DKP-PG、DKP-L、DKP、Xaa2、Xaa1、HG 及 SG 以及其所有
較佳具體實例如上文所定義。在方法(Xl)中，步驟(Xl-1)、步驟(Xl-1i)、步驟(Xl-1v)及視情況選用的步驟(Xl-1ii)可以任何次序進行。較佳，首先進行步驟(Xl-1 )，接著進行步驟(Xl-1i )，若DKP-L-樹脂A中存在SG，則接著進行視情況選用的步驟(Xl-1iii)，且進行步驟(Xl-1v)作為最后步驟。HG、任何SG、Xaa2及Xaal在方法(DKP-L-樹脂A)或方法(DKP-L)中用作構筑嵌段時可帶有保護基:在方法(Xl)或方法(DKP-L)中用作構筑嵌段的Xaal系以習知C端經保護的氨基酸形式使用，保護基為保護基C-PG。Xaal的α胺基未經保護且在各別偶合反應中為偶合位點。在方法(Xl)或方法(DKP-L)中用作構筑嵌段的Xaa2系以習知N端經保護的氨基酸形式使用，保護基為保護基N-PG。Xaa2的1_羧酸基未經保護且在各別偶合反應中為偶合位點。Xaal或Xaa2的任何側鏈亦較佳由SC-PG保護。C-PG為肽化學中習知用于保護氨基酸的羧酸基或用于保護肽的C端的保護基。較佳，C-PG選自由堿可裂解型保護基、酸可裂解型保護基及還原可裂解型保護基組成的群。呈用于各別偶合反應中的個別構筑嵌段形式的各HG及SG具有至少兩個活性官能基。第一活性官能基用作類似于肽合成中的氨基酸構筑嵌段的α胺基的官能基，且可由適合保護基保護，較佳由保護基N-PG保護；較佳，此官能基為OH或NH2且在經保護狀態下以-O-或-N⑶-形式存在。HG及SG的另一活性官能基用作類似于肽合成中的氨基酸構筑嵌段的羧酸基的官能基，且通常未經保護，且在各別偶合反應中為偶合位點。較佳，此未經保護的位點為羧酸基。在此偶合反應的后，第一活性官能基的任何保護基、較佳該N-PG可經裂解，以使此第一官能基可用于下一偶合反應。可由方法(DKP-L)獲得的形成DKP-PG的連接子DKP-L通常仍帶有HG的任何保護基，以可用于在方法(Χ2)中偶合至樹脂Α。
在方法(X2)中進行偶合之前，須使Xaal的C-PG裂解掉。較佳，方法(DKP-L)包含此使C-PG自Xaal裂解。因此，DKP-L包含兩個具體實例，一個具體實例在Xaal上具有保護基C-PG，另一個具體實例在Xaal上不具保護基C-PG。在DKP-L-樹脂A中，HG可仍帶有用于制備DKP-L-樹脂A的構筑嵌段HG中所存在的保護基。HG上的任何保護基須在方法(C-PEP)中的步驟(i)之前裂解。較佳，方法(DKP-L-樹脂A)包含此使任何保護基自HG裂解。因此，DKP-L-樹脂A包含兩個具體實例，一個具體實例在HG上具有任何保護基，另一個具體實例在HG上不具任何保護基。本發明的另一主題為制備肽PEP的方法(PEP-HSPPS)，方法(PEP-HSPPS)包含步驟(1-ρ印)及步驟(i1-ρ印)，在步驟(1-pep)中，根據方法(C-PEP)制備肽C-PEP ;接著在步驟(i1-p印)中，藉由均質溶液相肽合成HSPPS使在步驟(1-PEP)中獲得的C-PEP與N端經保護的氨基酸或N端經保護的肽PEP-N偶合；其中方法(C-PEP)、C-PEP及PEP-N以及其所有較佳具體實例如上文所定義。方法(PEP-HSPPS)為包含另一步驟(ii_p印)的方法(C-PEP)。在PEP-N中存在I個以上SC-PG的情況下，PEP-N的任何側鏈可獨立于PEP-N的任何其它側鏈由保護基SC-PG保護，此等SC-PG彼此獨立地相同或不同；其中SC-PG以及其所有較佳具體實例如上文所定義。在方法(PEP-HSPPS)中使用N端未經保護的C-PEP。因此，在方法(PEP-HSPPS)的偶合反應之前使保護C-PEP的N端的 任何保護基N-PG裂解。在方法(C-PEP)中較佳包含此裂解反應。由于藉由SPPS (PEP-C)制備PEP-C，故通常使用在α胺基上具有經保護的胺基N-PG的用于SPPS (C-PEP)中的PEP-C的N端氨基酸。視PEP-C的N端的此保護基N-PG的性質而定，此N-PG可在反應(INRIFO)中的成環的條件下同時自N端裂解，或其可在反應(INRIFO)之前與使PG2自Xaa2裂解同時自N端裂解。本發明的其它主題為下列方法:1.方法(PEP-HSPPS)，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)制備方法(C-PEP)的DKP-L-樹脂A ；2.方法(PEP-HSPPS )，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)的方法(Xl)制備方法(C-PEP)的DKP-L-樹脂A ；3.方法(PEP-HSPPS )，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)的方法(X2)制備方法(C-PEP)的DKP-L-樹脂A ;且其中已藉由方法(DKP-L)制備方法(DKP-L-樹脂A)的DKP-L ；4.方法(C-PEP)，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)制備DKP-L-樹脂A ；5.方法(C-PEP)，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)的方法(Xl)制備DKP-L-樹脂A ；6.方法(C-PEP)，其中已藉由方法(DKP-L-樹脂A)的方法(X2)制備DKP-L-樹脂A ;且其中已藉由方法(DKP-L)制備方法(DKP-L-樹脂A)的DKP-L。
本發明的另一主題為選自由以下組成的群的化合物:C_PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP-L-樹脂 A 及 DKP-L，其中 C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂 A、DKP-L-樹脂 A 及 DKP-L 以及其所有較佳具體實例如上文所定義。本發明的另一主題為C-PEP的用途，其中C-PEP以及其所有較佳具體實例如上文所定義，其在均質溶液相肽合成HSPPS中用于藉由C-PEP與N端經保護的氨基酸或N端經保護的肽PEP-N進行偶合反應來制備肽PEP。本發明的其它主題為選自由C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP_L_樹脂A及DKP-L組成的群的化合物的用途；或DKP-L的用途，其用作形成DKP-PG的連接子，其用于肽化學中；或用于制備肽；或用于制備肽的方法中；或
用于制備肽的方法的步驟中；或用于肽偶合反應中；或用于制備肽的SPPS中；或用于制備肽的HSPPS中；其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂 A、DKP-L-樹脂 A、DKP-L 及 DKP-PG 以及其所有較佳具體實例如上文所定義。在至此所述的本發明具體實例中包含本發明的下列任何具體實例。本發明的另一主題為制備式(II1-PEP-PG)化合物的方法(A)，
權利要求
1.一種制備肽C-PEP的方法(C-PEP)， C-PEP包含肽基PEP-C，PEP-C的C端由保護基DKP-PG保護，DKP-PG包含柄狀基團HG，視情況包含間隔基SG，及二酮哌嗪殘基DKP ； SG為肽化學中習知使用的間隔基； DKP為衍生自二肽殘基DPR的二酮哌嗪殘基； DPR包含α氨基酸殘基Xaal及Xaa2 ； Xaal為DPR的C端氨基酸殘基； Xaa2為DPR的N端氨基酸殘基，且Xaa2具有側鏈，該側鏈經官能基FG取代； PEP-C經由XaaC(1)連接至HG ； XaaC為PEP-C的氨基酸殘基； XaaCw中的索引(I)表示PEP-C的C端位置； XaaCw為PEP-C的C端氨基酸殘基； HG為固相肽合成SPPS中習知用于使肽的C端連接至固相的柄狀基團，其允許該C端在不使肽中連接兩個氨基酸殘基的酰胺鍵裂解的條件下自HG裂解； HG直接連接至FG，或若存在SG，則HG連接至SG且SG連接至FG ； 方法(C-PEP )包含步驟 (i i i ); 步驟(iii)包含反應(INRIFO)； 反應(INRIFO)為包含以下的反應:在肽PEP-C-DKP-L-樹脂A中的分子內成環反應及同時的裂解反應； PEP-C-DKP-L-樹脂A為C-PEP的前驅體且包含PEP-C及樹脂DKP-L-樹脂A，其中PEP-C系連接至DKP-L-樹脂A ； DKP-L-樹脂A包含樹脂A及形成DKP-PG的連接子DKP-L，其中樹脂A系連接至DKP-L， 樹脂A為在SPPS中習知用作固相的樹脂， DKP-L包含HG，視情況包含SG，及DPR，其中DPR的C端羧酸基為Xaal的羧酸基且連接至樹脂A; 反應(INRIFO)中的分子內成環為DPR的N端胺基與DPR的C端羧酸基反應，從而形成DKP，從而同時使Xaal自樹脂A裂解且形成DKP-PG，其中該DPR的N端胺基為Xaa2的α胺基; HG以某種方式選擇，以使HG與XaaCil)的間的鍵不在反應(INRIFO)期間裂解。
2.如權利要求第I項的方法(C-PEP)，其中在步驟(iii)的前藉由固相肽合成SPPS(PEP-C)制備 PEP-C ;且 樹脂A以某種方式選擇，以使樹脂A與Xaal的間的鍵不在SPPS (PEP-C)期間裂解。
3.一種制備形成DKP-PG的連接子DKP-L的方法(DKP-L)， 方法(DKP-L)包含步驟(DKP-L-1)、步驟(DKP-L-1ii)且視情況包含步驟(DKP_L_ii)； 在步驟(DKP-L-1 )中，使Xaa2偶合至Xaal ； 在視情況選用的步驟(DKP-L-1i)中，使SG偶合至Xaa2 (若在DKP-L中存在SG)； 在步驟(DKP-L-1ii)中，使HG偶合至SG (若在DKP-L中存在SG)或Xaa2 ； 其中DKP-PG、DKP-L, DKP、Xaa2、XaaUHG及SG如權利要求第I項中所定義。
4.一種制備DKP-L-樹脂A的方法(DKP-L-樹脂A)，方法(DKP-L-樹脂A)為方法(Xl)或方法(X2)； 方法(Xl)包含步驟(Xl-1)、步驟(Xl-1i)、步驟(Xl-1v)且視情況包含步驟(Xl_iii)； 在步驟(Xl-1)中，使氨基酸Xaal偶合至樹脂A ; 在步驟(Xl-1i)中，使氨基酸Xaa2偶合至Xaal ； 在視情況選用的步驟(Xl-1ii )中，使SG偶合至Xaa2的側鏈(若在DKP-L-樹脂A中存在 SG)； 在步驟(Xl-1v)中，使HG偶合至SG (若在DKP-L-樹脂A中存在SG)或Xaa2 ； 方法(X2)包含步驟(X2-1)； 在步驟(X2-1 )中，使DPK-L偶合至樹脂A ； 其中 DKP-L-樹脂 A、樹脂 A、DKP-PG, DKP-L, DKP、Xaa2、Xaal、HG 及 SG 如權利要求第 I項中所定義。
5.如權利要求第I項至第4項中任一項的方法，其中 HG為選自由以下組成的群的柄狀基團:式(HGF-1)柄狀基團、式(HGF-1I)柄狀基團、式(HGF-1II)柄狀基團、式(HGF-1V)柄狀基團、式(HGF-V)柄狀基團及式(HGF-VI)柄狀基團，
6.如權利要求第I項至第5項中任一項的方法，其中 SG為選自由以下組成的群的間隔基:式(SG-1)間隔基、式(SG-1I)間隔基、式(SG-1II)間隔基、式(SG-1V)間隔基及式(SG-V)間隔基；
7.如權利要求第I項至第6項中任一項的方法，其中 Xaal選自由以下組成的群:天然存在的α氨基酸殘基、α -N-甲基氨基酸殘基、L-Hpr殘基、D-Hpr殘基、DL-Hpr殘基、2- (C^5燒基)-D-氨基酸殘基、2- (C^5燒基)-L-氨基酸殘基、2- ((V5烷基)-DL-氨基酸殘基及衍生自式(HypX)化合物的殘基；
8.如權利要求第I項至第7項中任一項的方法，其中 Xaa2選自由以下組成的群:L_Lys殘基、D-Lys殘基、DL-Lys殘基、L-Orn殘基、D-Orn殘基、DL-Orn殘基、L-4-胺基脯胺酸殘基、D-4-胺基脯胺酸殘基、DL-4-胺基脯胺酸殘基、L-α, y-二胺基-丁酸殘基、D-a, y-二胺基丁酸殘基、DL-a , y-二胺基-丁酸殘基、L-α, β-二胺基丙酸殘基、D-a，β - 二胺基-丙酸殘基、DL-a，β - 二胺基丙酸殘基、L-Ser殘基、D-Ser 殘基、DL-Ser 殘基、L-Thr 殘基、D-Thr 殘基、DL-Thr 殘基、L-Cys 殘基、D-Cys殘基、DL-Cys殘基、L-高半胱胺酸殘基、D-高半胱胺酸殘基、DL-高半胱胺酸殘基、L-Asp殘基、D-Asp殘基、DL-Asp殘基、L-Glu殘基、D-Glu殘基及DL-Glu殘基。
9.如權利要求第I項至第8項中任一項的方法，其中 樹脂A選自由以下組成的群:羥甲基聚苯乙烯(HMPS)樹脂、基于聚乙二醇(PEG)的樹脂、PEG接枝至不同于PEG樹脂的樹脂上的樹脂、聚苯乙烯樹脂、對苯甲氧基苯甲醇樹脂、氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂、聚(乙烯醇)-接枝-聚(乙二醇)(PVA-g-PEG)樹脂。
10.一種制備肽PEP的方法(PEP-HSPPS)， 方法(PEP-HSPPS)包含步驟(1-p印)及步驟(i1-p印)， 在步驟(1-pep)中，根據如權利要求第I項中所定義的方法(C-PEP)制備肽C-PEP ； 接著 在步驟(i1-pep)中，藉由均質溶液相肽合成HSPPS使在步驟(1-PEP)中所獲得的C-PEP與N端經保護的氨基酸或與N端經保護的肽PEP-N偶合； 其中方法(C-PEP)及C-PEP如權利要求第I項中所定義。
11.一種化合物，其選自由以下組成的群:C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP-L-樹脂A及DKP-L ;其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP-L-樹脂A及DKP-L如權利要求第I項中所定義。
12.一種選自由C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP-L-樹脂A及DKP-L組成的群的化合物用于肽化學中的用途，或一種DKP-L作為形成DKP-PG的連接子的用途；其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-樹脂A、DKP-L-樹脂A、DKP-L及DKP-PG如權利要求第I項中所定義。
全文摘要
本發明系關于一種用于N端肽片段PEP-N及C端肽片段C-PEP的均質溶液相肽合成(HSPPS)的方法，其中C-PEP帶有包含二酮哌嗪(DKP)的特定C端保護基，其含有柄狀基團HG，其中HG系連接至肽片段的C端；從而此包含DKP的特定C端保護基可自肽如同習知所用的C端保護基一般選擇性裂解。藉由使用此包含DKP及HG的C端保護基，可避免基于HSPPS及固相肽合成(SPPS)的組合的匯集肽合成中的某些方法步驟。本發明進一步關于一種藉由SPPS制備該經特定保護的片段C-PEP的方法，其系藉由使用包含特定二肽及HG的連接子以使生長中的肽鏈連接至樹脂而達成，當肽片段C-PEP自支撐樹脂裂解時，該連接子形成該DKP基團；且進一步關于制備方法的中間物。
文檔編號C07K1/04GK103189384SQ201180052637
公開日2013年7月3日 申請日期2011年10月20日 優先權日2010年10月29日
發明者費爾南多·阿爾貝利西歐, 米謝勒·克里斯托, 馬蒂厄·吉羅, 米里亞姆·貢戈拉貝尼特斯, 茱蒂特·圖拉-普赫 申請人:隆薩有限公司