專利名稱：將蘆薈色苷a轉化成蘆薈苦素的方法
將蘆薈色苷A轉化成蘆薈苦素的方法發明背景本發明涉及將，薈色苷(aloeresin) A轉化成,薈苦素的方法。,薈是已知存在超過300種的肉質植物，大部分是非洲本土的。 將來自,薈的產物用于傳統醫藥中已經有幾個世紀了，特別是已經用 于皮膚病學的應用中，用于治療燒傷、瘡和其他創傷。現代治療觀察 包括抗炎活性、抗肺瘤活性、抗酸活性、抗糖尿病活性、酪氨酸酶抑 制活性和抗氧化活性。,薈產物還廣泛用于化妝品和保健食品工業中， 尤其是隨著近來天然產品流行性的增加。從其獲得藥物、治療、皮膚病學或化妝品應用的主要非洲,薈種 是開普蘆薈(Aloe ferox), —種局限于南部非洲的種。其他種的蘆 薈也可用于相似的目的。在USA,庫拉索,薈(Aloe vera)廣泛用于 皮膚護理產品、香波和保健飲料中。然而，已經發現開普蘆薈具有幾 個優于庫拉索,薈的特性。例如，開普,薈的鈣和總氨基酸含量高于 庫拉索蘆薈。栽培的開普蘆薈植物的切割葉還產生比生長于其旁邊的 庫拉索,薈植物多大約20倍的苦汁(重量對重量而言)。因為開普蘆 薈葉厚寬得多，每個葉片的苦汁總產量甚至更大。從開普蘆薈回收的 凝膠量以體積計也一向大于從庫拉索蘆薈獲得的。存在許多分離蘆薈特定成分的方法(參見，例如，US專利 4， 735， 935和4， 656， 029 )。蘆薈的商業產品之一是從蘆薈葉產生的汁 液獲得的，并且由于其苦味稱為蘆薈苦味物質(aloe bitters)。汁 液通過本領域技術人員已知的傳統方法收集并干燥以產生暗棕色的固 體物質，稱為,薈苦味物質或Cape Aloes。商業聲薈苦味物質含有四種主要成分，即,薈素A、,薈素B、蘆 薈苦素和,薈色苷A。開普聲薈葉滲出物中主要化合物的總體組成是非常固定的，尤其 是考慮到該種的形態變異和廣泛的天然分布區域時。在開普,薈中，蘆薈色苷A、蘆薈苦素和蘆薈素(差向異構體A和B兩者)構成總干 重的70%至97%，各自以大約4: 3: 2的比例。通常通過選擇性提取從蘆薈苦味物質分離,薈素A和B (或蘆薈 苷)，其主要用作瀉藥。蘆薈苦素也是從蘆薈苦味物質分離的并用作 皮膚美白和防曬劑(US專利4,656,029 )。通常將蘆薈色苷A丟棄。 因此，盡管蘆薈色苷A以最大量存在于蘆薈汁液中，但其具有甚少的 或沒有商業價值。因此將,薈色苷A轉化成具有更高商業價值的化合 物是有利的。在以下的描述中，任何提及,薈汁液也旨在提及,薈苦味物質或 蘆薈苦味物質的提取物。發明概述根據本發明的第一個實施方案，提供了將蘆薈色苷A轉化成,薈 苦素的方法，該方法包括將至少部分,薈色苷A水解成蘆薈苦素和對 香豆酸的步驟。該方法可以進一步包括將聲薈苦素與對香豆酸分離的步驟。 可以使用酸水解來進行,薈色苷A水解成聲薈苦素的步驟。 或者，可以使用水解酶來進行蘆薈色苷A水解成蘆薈苦素的步驟。 在酸水解的情況中，酸可以是任何有機或無機酸。特別地，酸可 以是選自鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸中的一種或多種酸。在酶水解的情況中，水解酶可以是酯酶、脂酶或蛋白酶。 特別地，水解酶可以選自米曲霉(J^ei^//7^ar/^3e)蛋白酶、 來自Diversa的ESL 001-02 ,來自Nordisk的NOVO 388"*和來自Altus Chiroscreen KitTM的米赫毛霉(Mucor miehei )脂酶。更特別地，酶 可以是 Amano Protease M 或來自 Quest International 的 Bioprotease P conc ，這兩者都是來自米曲霉的蛋白酶。或者，酶可以是由DNA或氨基酸序列編碼的酶，該序列至少實質 上對應于上述任一種酶的DNA或氨基酸序列或其部分序列。
酶的DNA或氨基酸序列可以與上述酶的DNA或氨基酸序列具有至 少70%的同源性。酶可以是固體或液體形式。優選，,薈色苷A轉化成,薈苦素和對香豆酸而不形成副產物， 特別地，不形成聚合物。蘆薈色苷A可以從任何種的聲薈植物獲得，特別是來自開普蘆薈 或庫拉索蘆薈種，更特別是來自開普,薈種。可以從聲薈植物葉產生的汁液獲得f薈色苷A。汁液可以是液體 或固體形式。蘆薈色苷A可以是部分純化的形式。使用酸時的水解步驟可以在約0. 5N至約10N的酸濃度范圍內進 行，最佳在約2N至約5N酸的濃度下進行。水解步驟可以在約20至約121。C進行，并且使用酸時，通常在約 90'C進行。使用水解酶時，水解步驟通常在約37X:進行，除了使用 ESL001-0r時一在這種情況下，水解步驟可以在約50至約90。C下進 行，更優選約70°C。可以在反應介質中使用緩沖劑。緩沖劑可以是鈉磷酸鹽、碳酸鹽 或硼酸鹽緩沖劑或水，或任何其他具有在約4至約8 pH范圍內的p《 的緩沖劑。緩沖劑濃度可為0. OIM至IM的范圍，優選O. 1M。可以加入有機溶劑，如乙醇或丙酮，濃度為約10至50%，優選約30%。根據本發明的第二個實施方案，提供了從蘆薈植物的汁液提取, 薈苦素的方法，該方法包括步驟將蘆薈植物中的至少部分聲薈色苷A水解成蘆薈苦素和對香豆 酸；和從汁液提取天然存在的,薈苦素和從蘆薈色苷A轉化而來的,薈 苦素。蘆薈植物可以是開普，薈種的植物。汁液可以是液體或固體形式。 可以根據基本上如上描述的方法來水解蘆薈色苷A。
根據本發明的第三個實施方案，提供了通過基本上如上所述將蘆薈色苷A水解成聲薈苦素和對香豆酸而形成的蘆薈苦素。蘆薈色苷A可以來自，薈植物的汁液，更特別地可以來自開普蘆 薈種的汁液。蘆薈苦素可以是天然存在的聲薈苦素和根據上述方法從聲薈色苷 A轉化而來的,薈苦素的組合。發明詳述在此描述了將蘆薈色苷A水解轉化成,薈苦素的方法。 蘆薈色苷A是對香豆酸的蘆薈苦素基(aloesinyl)酯，并且申請 人發現可以有效而經濟地將蘆薈色苷A水解成蘆薈苦素( 一種C-糖苷 -5-甲基色酮)，因此提高從,薈植物汁液可提取的蘆薈苦素量。因為 ,薈苦素比^薈色苷A更有商業價值，該方法還提高了來自蘆薈植物 的汁液或,薈苦味物質的商業價值。以下描繪了蘆薈色苷A轉化成蘆 薈苦素的反應HO OH,薈色苷A ,薈苦素 對香豆酸，薈色苷A轉化成蘆薈苦素還有助于從蘆薈苦味物質選擇性地取 出蘆薈苦素，以及副產物蘆薈素A和B。蘆薈色苷A不存在情況下蘆 薈苦素的提取和純化的困難和成本比蘆薈色苷A存在時要低得多，出 于兩個主要的原因(a) 轉化后，存在更多可以提取的聲薈苦素；和(b) 轉化后，只需要從聲薈苦味物質中分離兩種主要的成分(蘆 薈苦素和蘆薈素)，并且因為這些成分具有非常不同的物理性質，蘆
薈苦素的選擇性提取變得容易得多。該方法還包括將,薈苦素與對香豆酸分離的步驟。合適的分離步驟是本領域技術人員清楚的，在此不詳細討論了，盡管常用的分離方法包括溶劑提取、色語和結晶。可以用于該方法中的水解步驟實例是酸水解、堿水解和酶水解。 在酸水解的情況中，酸可以是任何有機或無機酸，如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等。在酶水解的情況中，水解酶可以是酯酶、脂酶或蛋白酶，如米曲霉蛋白酶、來自Diversa的ESL 001-02 ，來自Nordisk的NOVO 388 (特別是制劑中的蛋白酶污染物)或來自Altus Chiroscreen Kit 的米赫毛霉脂酶。更特別地，酶是來自Amano的Protease Nf或來自 Quest International的Bioprotease P cone , 兩者都是來自米曲 霉的蛋白酶。或者，酶可以是通過DNA或氨基酸序列編碼的酶，該序 列至少實質上對應于上述任一種酶的DNA或氨基酸序列或其部分序 列。酶的DM或氨基酸序列可以與上述酶的DNA或氨基酸序列具有至 少70°/。的同源性。酶可以是固體或液體形式。蘆薈色苷A通常轉化成蘆薈苦素和對香豆酸而不形成副產物，如 聚合物。任何種的,薈植物都適宜作為蘆薈色苷A的來源，其可從,薈植 物的葉產生的汁液獲得。汁液可以是液體或固體形式，且,薈色苷A 可以是純化形式、部分純化形式或可以是汁液或聲薈植物另一部分內 的未純化形式。使用酸時的水解步驟通常在約0. 5N至約10N的酸濃度范圍內進 行，最佳地在約2N至約5N酸的濃度下進行。濃度為約10至50%，優 選約30%的有機溶劑，如乙醇或丙酮，可以任選地加入反應過程中。水解步驟通常在約20至約12rc進行，并且使用酸時，通常在約 9(TC進行。使用水解酶時，水解步驟通常在約37'C進行，除了使用酶 ESL001-O2時，在這種情況下，水解步驟在約50至約90'C下進行，更 特別是約70°C。可以在反應介質中使用緩沖劑。緩沖劑可以是鈉磷酸鹽、碳酸鹽
或硼酸鹽緩沖劑或水，或任何其他具有在約4至約8 pH范圍內的p^ 的緩沖劑。緩沖劑濃度可為約0. OIM至IM的范圍，優選O. 1M。
通過上述水解方法獲得的蘆薈苦素可以用于局部皮膚組合物中。 聲薈素可以用于各種用于人和獸醫市場的組合物中。
實施例
在實施例中，使用鹽酸和硫酸來展示酸水解聲薈色苷A成蘆薈苦 素的能力，使用米曲霉蛋白酶來展示聲薈色苷A至蘆薈苦素的酶水解。
開發定量HPLC方法作為分析工具來監測在此所述的水解方法的 優化過程中,薈色苷A、,薈苦素和對香豆酸的量。測試的詳細內容 和結果列于以下的實施例中。
實施例1:使用HC1和丙酮的酸水解
在丙酮存在或不存在下用1. 3或5N的HC1在90。C隨著時間水解 含有聲薈色苷A (15%)的蘆薈汁液。使用丙酮來提高蘆薈汁液中底物 的溶解性。以定時的間隔取出等份的反應試樣(20|^1),并加入100mM pH7.2的含有30。/。丙酮的磷酸鹽緩沖劑中。使用確立的方法，通過HPLC
進行樣品的分析。
結果顯示出水解的速率取決于酸強度，使用SNHCl時獲得40y。至 80%的轉化。10。/。丙酮的存在略微提高了水解。在較高的酸強度，蘆薈 色苷A消失的速率較大。結果還顯示出在3至5N HC1，在^內消失 了 90-95%蘆薈色苷A。
實施例2:使用HC1或1^04和乙醇的酸水解
將乙醇用作丙酮的替代物。在所示時間內在50% ( v/v)乙醇存在 下使用IN HC1或H2S04在90C水解含有蘆薈色苷A的蘆薈提取物。蘆 薈提取物的量為10至50% (v/v)。在所示的時間間隔取出每個反應 的等份試樣(lml),并加入0. 5ml冷的丙酮中。使用確立的方法，通
過HPLC進行樣品的分析。
使用H2S0,作為水解酸和30%的聲薈汁液濃度，4h反應后蘆薈色苷 A和蘆薈苦素之間的摩爾差額閉合(mole balance closures)在80% 的區域內(并且在該階段內可能更高)。H2S04用作酸時，與HC1相比 較，摩爾差額閉合高約10%，但觀察到摩爾差額喪失地較快。
實施例3:使用米曲霉蛋白酶的酶水解
測試了各種條件，以便初步優化,薈提取物或純,薈色苷A中的 ,薈色苷A向蘆薈苦素的酶水解。選擇米曲霉蛋白酶作為水解酶的實 例，并測試了兩種米曲霉蛋白酶， 一種是來自Amano的Protease M ， 另 一種是來自Quest International 的Bioprotease P conc 。
Protease N^說明
來源米曲霉(Non-GM0) 稀釋劑土豆糊精(Non-GMO) 稀釋劑含量大約15%
Bioprotease P concTM說明
最少400， 000 HUT蛋白酶u/gm -總活菌計數〈50， 000/gm -酵母&霉菌〈200/gm -大腸桿菌25gm中不存在 -沙門氏菌25gm中不存在 -符合所有其他國際規范
(重金屬、鉛、砷等)，如FCC & JECFA所列出的。
以小規模研究了以下參數 酶濃度 l至50mgl酶 ,薈提取物每3ml 15pl至200 nl緩沖劑類型鈉磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽 緩沖劑濃度0. OOIM至1M pH: 4至7
Tween濃度0、 1和10%v/v 丙酮濃度0至50%
使用聲薈汁液作為底物時，通常獲得,薈苦素濃度至少50%提高。
實施例4:使用米曲霉蛋白酶的酶水解
以每lml反應3mg純(91%),薈色苷A進行反應，使用Amano Protease NT或Quest Bioprotease P concTM作為酶。研究的參數是
酶濃度2和20mg 緩沖劑濃度0. OIM鈉磷酸鹽 pH: 5.5
在37C進行反應，在振蕩攪拌器上進行攪拌，歷經20h。實現聲 薈色苷A完全轉化成,薈苦素。
對于所有的反應，將整個3ml的反應接受分析。用水曱醇THF (20: 40: 40 )將樣品補足至25ml并在HPLC上分析。
確定了在37X:米曲霉蛋白酶發揮功能最佳。使用上述的參數優化 ,薈色苷A向,薈苦素和對香豆酸的酶轉化，并發現了其中,薈色苷 A完全轉化成蘆薈苦素和對香豆酸的條件。4h后，,薈苦素含量100% 增加且蘆薈色苷A 100%降低。因此轉化完全，使用純蘆薈色苷A作為 底物時具有接近100%的摩爾差額。
實施例5:蘆薈苦素的大規模生產在夾套、攪拌罐、玻璃襯里的反應器中進行反應。使用等效質量(equivalent mass)的2M HC1溶液在攪拌下水解蘆薈汁液。將反應 器加熱至90匸并將溫度維持大約5. 5小時。獲得的聲薈色苷轉化是大 約94%，向聲薈苦素的平均選擇性為大約30%。在反應結束時，通過使冷卻水通過夾套而將反應器內含物冷卻至 70'C。使用45%苛性堿溶液(相對于酸大約0. 75當量)將系統中和至 大約4. 5的pH。將反應器進一步冷卻至28'C，并停止攪拌。使反應混合物分成2 相。水相(稱為水解產物)沉降至底部而含有固體的上層(稱為上層) 沉積在頂部。將水解產物排至存儲罐中。在加水之前用氮氣伴隨攪拌一起使上層充氣。然后用等效質量的 水洗滌反應器的內含物。將反應器在25。C攪拌30分鐘，然后再靜置 30分鐘。在"。C進行混合物的分離，上層保持在頂部。將水相排至存儲罐 中。將水洗滌物與之前排出的水解產物合并。從反應后流回收的總, 薈苦素為大約84%。通過溶解于10%苛性堿溶液從反應器中除去剩余的固體。然后排 出洗滌溶液并作為廢物處理。本發明不旨在限于在此所述的精確細節。例如，申請人設想其他 水解劑也可以用于水解反應中，如為所測試的酸或酶的化學或生物等 同物的酸和酶。
權利要求
1.將蘆薈色苷A轉化成蘆薈苦素的方法，該方法包括將至少部分蘆薈色苷A水解成蘆薈苦素和對香豆酸的步驟。
2. 根據權利要求l的方法，其進一步包括將蘆薈苦素與對香豆酸 分離的步驟。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中使用酸水解來進行蘆薈色苷 A水解成,薈苦素的步驟。
4. 根據權利要求1或2的方法，其中使用酶水解來進行，薈色苷 A水解成蘆薈苦素的步驟。
5. 根據權利要求3的方法，其中將有機酸用于酸水解。
6. 根據權利要求3的方法，其中將無機酸用于酸水解。
7. 根據權利要求6的方法，其中酸選自鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸。
8. 根據權利要求4的方法，其中用于進行酶水解的酶選自酯酶、 脂酶和蛋白酶。
9. 根椐權利要求4或8任一項的方法，其中酶選自米曲霉 (Aspergillus oryzae)蛋白酶、ESL 001-02 、 NOVO 3887"和米赫毛霉(Mucor miehei )月旨酶。
10. 根據權利要求9的方法，其中米曲霉蛋白酶是Protease M 或Bioprotease P conc 。
11. 根據之前任一項權利要求的方法，其中？薈色苷A轉化成蘆薈苦素和對香豆酸而不形成副產物。
12. 根據之前任一項權利要求的方法，其中,薈色苷A轉化成蘆薈苦素和對香豆酸而不形成聚合物。
13. 根據之前任一項權利要求的方法，其中從任何種的蘆薈植物 獲得,薈色苷A。
14. 根據之前任一項權利要求的方法，其中從開普蘆薈(Aloe ferox)種獲得蘆薈色苷A。
15. 根據1-13任一項權利要求的方法，其中從開普蘆薈種獲得蘆薈色苷A。
16. 根據之前任一項權利要求的方法，其中從，薈植物葉產生的 汁液獲得聲薈色苷A。
17. 根據之前任一項權利要求的方法，其中,薈色苷A是部分純 化的或純化的形式。
18. 根據權利要求3的方法，其在約0. 5N至約10N酸的酸濃度范 圍中進行。
19. 根據權利要求3的方法，其在約2至約5N酸的酸濃度范圍中 進行。
20. 根據之前任一項權利要求的方法，其中在約20至約12rc的溫度下進行水解步驟。
21. 根據權利要求3的方法，其中在約90。C的溫度下進行水解步驟。
22. 根據權利要求4的方法，其中在約30。C至約9(TC的溫度下進 行水解步驟。
23. 根據權利要求4的方法，其中在約37。C的溫度下進行水解步驟。
24. 根據權利要求4的方法，其中在約70。C的溫度下進行水解步驟。
25. 根據之前任一項權利要求的方法，其中使用緩沖劑。
26. 根據權利要求25的方法，其中緩沖劑是鈉磷酸鹽緩沖劑、碳 酸鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑或水。
27. 根據權利要求25的方法，其中緩沖劑具有約4至約8 pH范圍內的pL
28. 根據權利要求25至27任一項的方法，其中緩沖劑濃度為約 0. OIM至約1M。
29. 根據權利要求25至28任一項的方法，其中緩沖劑濃度為約 0. 1M。
30. 根據權利要求3的方法，其中將有機溶劑添加至水解步驟中。
31. 根據權利要求30的方法，其中有機溶劑是乙醇或丙酮。
32. 根據權利要求30或31的方法，其中有機溶劑的濃度為約10 至約50% ( v/v)。
33. 根據權利要求30至32任一項的方法，其中有機溶劑的濃度 為約30% ( v/v)。
34. 從蘆薈植物的汁液提取,薈苦素的方法，該方法包括步驟 將,薈植物中至少部分蘆薈色苷A水解成蘆薈苦素和對香豆酸；和從汁液提取天然存在的蘆薈苦素和從,薈色苷A轉化而來的蘆薈 苦素。
35. 根據權利要求34的方法，其中蘆薈植物是開普蘆薈種的蘆薈 植物。
36. 根據權利要求34或35任一項的方法，其中通過酸水解將蘆 薈色苷A水解成蘆薈苦素。
37. 根據權利要求34或35任一項的方法，其中通過酶水解將蘆 薈色苷A水解成,薈苦素。
全文摘要
本發明提供了通過以下反應將蘆薈色苷A水解轉化成蘆薈苦素的方法由此提高了可從蘆薈植物的汁液提取的蘆薈苦素的量并使得蘆薈苦素的提取和純化也更容易且成本更低。由于蘆薈苦素比蘆薈色苷A更具商業價值，該方法還提高了來自蘆薈植物的汁液或蘆薈苦味物質的商業價值。該方法任選還包括將蘆薈苦素與對香豆酸分離的步驟。該方法中所用的典型水解步驟是酸水解、堿水解和酶水解。在酸水解的情況中，酸是任何合適的有機或無機酸，如鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸。在酶水解的情況中，水解酶典型地是酯酶、脂酶或蛋白酶。
文檔編號C07D311/22GK101160299SQ200680012942
公開日2008年4月9日 申請日期2006年3月13日 優先權日2005年3月18日
發明者L·H·斯廷坎普, R·K·米特拉, S·J·赫吉, V·N·費哈恩 申請人:Csir公司