專利名稱：人促肝再生因子衍生物及其表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體涉及人促肝再生因子衍生物及其在大腸桿菌中的表達。
背景技術：
促肝再生因子(augment of liver regeneration，ALR)是一種熱穩定性的小分子促肝細胞增殖因子，早在1931年，Higgins和Anderson首先對大鼠70％肝切除后的肝再生進行了經典描述。此后不久，Muiunkin和Breuhans觀察到30％-40％肝切除兩天的大鼠肝臟組織勻漿物具有顯著的促有絲分裂反應活性。二十年后，Teir和Ravanti以及Teir的研究生Blonquist指出肝臟再生增強活動與初斷乳大鼠肝臟或肝切除后的再生肝臟組織勻漿的促有絲分裂作用相關聯，即意味著腹腔注入的組織勻漿能招致大鼠肝臟的有絲分裂。隨后，LaBrecque和Pesch指出促進肝細胞再生增強的先決條件是以含有“肝臟刺激物(hepatic stimulator substans，HSS)的胞液提取物作為增生肝源。1994年，Hagiya等首先從含肝臟刺激物(HSS)的胞液中分離純化并克隆得到了大鼠ALR cDNA，并通過犬的Eck fistula模型即門腔靜脈吻合分流術證實了ALR的促肝細胞增殖作用。楊曉明等通過建立CCl4誘導的體內、外肝損傷模型，選擇細胞存活率、LDH釋放率為體外實驗觀察指標；選擇肝衰竭動物存活率、中毒性肝炎動物外周血清ALT、LDH水平、DNA合成及組織病理學檢查等指標為體內實驗觀察指標，對重組人ALR抗肝損傷的作用進行了綜合評價，結果體外實驗發現重組人ALR能提高受損肝細胞的存活率，降低CCl4誘導損傷肝細胞LDH的釋放。體內實驗發現重組人ALR能提高CCl4誘導肝功能衰竭動物的存活率，促進肝細胞增殖，降低動物外周血ALT、LDH水平，表明ALR不僅是一種重要的肝再生刺激因子，而且在肝損傷修復過程中有重要促進作用。
目前，國內廣泛應用從新生小牛肝、乳豬肝提取的促肝細胞增殖因子治療重型病毒性肝炎，并取得較好療效，但這些制劑受其來源、種源差異及其純度的限制，應用推廣受到較大的限制，而重組人ALR則彌補了以上不足。國內楊曉明等曾采用真核細胞cos-7細胞表達ALR并對其在體外促進HTC肝癌細胞增殖的作用進行了研究，但采用此方法表達的ALR非常微量，根本無法進行大規模制備。隨后，國內楊曉明等及易學瑞等分別采用原核細胞大腸桿菌成功表達了ALR，使得其大規模制備得以實現，但是在他們的方法中，ALR在大腸桿菌中是以包涵體形式表達的，其失去了生物活性，需要經過復雜的變復性及純化工藝，使其恢復生物活性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是通過原核細胞大腸桿菌融合表達系統，獲得具有天然活性，可大規模表達的人促肝再生因子衍生物，該衍生物與天然人促肝再生因子具有相同的活性。
本發明公開的重組人促肝再生因子具有sequence 1的氨基酸序列和sequence 2的DNA序列。經DNA序列測定，與文獻報道的hALR序列相比本發明重組人促肝再生因子在N端多了兩個氨基酸。
本發明所要解決的另一技術問題是公開上述重組人促肝再生因子的制備方法。
本發明人促肝再生因子衍生物通過大腸桿菌表達的步驟包括提取胎肝總RNA↓RT-PCR擴增目的片段hALR cDNA↓純化PCR產物↓克隆目的片段至載體pGEM-T↓重組質粒的篩選和鑒定↓PCR定點突變修復
↓質粒DNA pGEM-T/hALR cDNA的雙酶切↓凝膠回收hALR cDNA片段↓hALR cDNA克隆于原核融合表達載體pGEX-4T-3形成pGEX-4T-3/hALRcDNA↓轉化大腸桿菌進行誘導表達↓離心收集菌體↓超聲破碎，離心，收集上清液↓親和層析柱純化↓收集目的峰，加入凝血酶酶切 酶切液65℃加熱，離心，收集上清酶切液經陰離子交換柱純化↓ ↓陰離子交換柱純化 凝膠過濾柱純化↓ ↓凝膠過濾柱交換緩沖液 分裝、凍干 體外、體內活性測定本發明實施例1中詳細提供了人促肝再生因子在大腸桿菌中的表達，該方法通過TRIZOL試劑提取胎肝總RNA，RT-PCR擴增目的片段hALR cDNA，其中采用的引物分別為P1(sequence 3)、P2(sequence 4)。
PCR產物經純化后克隆至載體pGEM-T，獲取質粒PGEM-T/hALR，突變修復后的質粒進行BamHI、EcoR I雙酶切，得重組質粒pGEX-4T-3/hALR，轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)或DH5α，篩選重組子，誘導表達，離心收集菌體，超聲破碎、上清液經親和層析純化、酶切，精純化后獲得產物。
采用大腸桿菌原核融合表達系統獲得的人促肝再生因子為可溶形式，保持天然活性，同時采用親和層析純化，使操作簡單成本降低，提高回收率。


圖1 實施例1PCR定點突變技術路線圖2 實施例1重組質粒pGEX-4T-3/hALR cDNA的構建圖
具體實施例方式實施例1、人促肝再生因子在大腸桿菌中的表達一、人促肝再生因子cDNA的克隆菌種DH5α，質粒pGEM-T主要技術路線提取胎肝總RNA↓RT-PCR擴增目的片段hALR cDNA↓純化PCR產物↓克隆目的片段至載體pGEM-T↓重組質粒的篩選和鑒定1、TRIZOL試劑提取胎肝總RNA稱取新鮮胎肝組織50mg，充分剪碎，轉至勻漿管中加入1.2mlTRIZOL試劑↓電動勻漿約2min，勻漿液轉移至1.5ml離心管↓25℃孵育5min加入0.2ml氯仿，振搖15秒↓25℃孵育2-3min
2-8℃離心15min，轉速11000rpm↓小心吸取上層水相↓取200μl加入200μl異丙醇↓15-30℃孵育10min12000g離心15min↓棄上清加0.6ml75％乙醇洗滌↓7500g離心5min↓棄上清37℃保溫30min揮發殘留乙醇后，100μl DEPC水溶解↓RNA甲醛瓊脂糖電泳及紫外分光光度定量2.RT-PCR擴增目的片段hALR cDNA取2μg總RNA和0.5μg Oligo(dT)12-18溶于12μl焦碳酸二乙酯處理的水中，70℃溫育10min后置于冰浴，加入10×PCR緩沖液2μl，25mmol/L MgCl22μl，10mmol/L dNTP混合物1μl，0.1mol/L DTT2μl，短暫離心后42℃溫育5min。加入1μl SuperScrit RT(200U)，42℃溫育50min，70℃15min滅活酶活性，最后加入1μl(2U)RNaseH，37℃溫育20min，以降解未轉錄的RNA。取上述制備的逆轉錄反應液2μl，加入引物P1、P2(序列見sequence number 3、4)各2μl，10×PCR緩沖液10μl，25mM MgCl26μl，10mM dNTP混合液2μl，ddH2O 75μl，94℃變性后加入taq酶1μl，，然后進行PCR擴增94℃45秒，56℃1min，72℃1min，共35個循環。最后一次循環72℃延伸10min。
3.PCR產物的克隆及重組轉化子的鑒定PCR產物經瓊脂糖電泳、割膠純化后，取PCR產物6μl(約1μg)，加入10×PCR緩沖液2μl，載體pGEM-T 3μl(約0.5μg)，T4DNA連接酶2μl(10U)，ddH2O 7μl，混勻，短暫離心，14℃水浴放置9hr。按氯化鈣常規方法制備感受態大腸桿菌DH5α，取上述連接混合液10μl轉化感受態大腸桿菌DH5α100μl，均勻涂布于表面含有IPTG和X-gal的LB瓊脂培養平板(含Amp 100μg/μl)，恒溫37℃孵育16-20hr。從平板上挑取白色單克隆，接種于5ml LB培養基(含Amp 100μg/μl)培養過夜。部分菌液用于測序，部分菌液用質粒提取試劑盒提取質粒pGEM-T/hALR，并用BamH I、EcoR I進行雙酶切初步鑒定。酶切條件為質粒25μl(約2μg)，加入10×緩沖液3μl，BamHI 1μl(10U)，EcoRI 1μl(10U)，混勻，短暫離心后37℃孵育2小時，酶切反應液經瓊脂糖電泳鑒定，可見大小約380bp的片段，符合hALR cDNA編碼序列的大小。DNA序列測定后分析發現，與文獻報道的hALR序列相比存在兩處差異。第一是該cDNA起始密碼后第96位堿基發生了C→T點突變，經ORF的密碼子對應氨基酸序列檢查，該突變屬無義突變，即突變前后密碼子編譯的都是蘇氨酸。第二是該cDNA起始密碼后第191位堿基發生了A→G點突變，經ORF的密碼子對應氨基酸序列檢查，該突變屬于有義突變，導致編譯的氨基酸由谷氨酸變為甘氨酸，因此需要進行突變修復。PCR定點突變技術路線見圖1。
采用PCR突變的主要操作步驟如下1)針對第191位堿基的A→G突變設計突變引物M(sequence5)。
2)以含突變的pGEM-T/hALR質粒DNA為模板，選用初始引物P1與突變引物M進行第一輪PCR擴增94℃40秒，56℃1min，72℃1min，共30個循環。最后一次循環72℃，延伸10min。
3)用DNA清潔試劑盒純化上述第一輪PCR擴增產物，PCR擴增條帶約200bp，符合引物P1(sequence 3)與M(sequence 5)之間片段大小。
4)以含突變的pGEM-T/hALR質粒為模板，選用初始引物P2與上述純化第一輪PCR擴增產物做引物進行第二輪PCR擴增94℃40秒，65℃5min，72℃1min，共30個循環。最后一次循環72℃，延伸10min。PCR擴增條帶約380bp，片段大小正確。
5)用DNA清潔試劑盒純化上述第二輪PCR擴增產物。
6)將上述PCR擴增產物克隆至載體pGEM-T形成pGEM-T/hALR。
7)DNA序列測定，突變修復后的ALR序列與文獻報道完全一致。DNA序列見sequence 2二、重組人促肝再生因子在大腸桿菌中的表達及表達產物的鑒定、純化菌種大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α 質粒pGEX-4T-3主要技術路線質粒DNA pGEM-T/hALR cDNA的雙酶切↓凝膠回收hALR cDNA片段↓hALR cDNA克隆于原核融合表達載體pGEX-4T-3形成pGEX-4T-3/hALR cDNA↓轉化大腸桿菌進行誘導表達↓離心收集菌體↓超聲破碎，離心，收集上清液↓親和層析柱純化↓收集目的峰，加入凝血酶酶切 酶切液65℃加熱，離心，收集上清酶切液經陰離子交換柱純化↓ ↓陰離子交換柱純化 凝膠過濾柱純化↓ ↓凝膠過濾柱交換緩沖液分裝、凍干↓分裝、凍干1、重組質粒pGEX-4T-3/hALR cDNA的構建重組質粒pGEX-4T-3/hALR cDNA的構建圖見圖2。
1)目的片段hALR cDNA的獲得用質粒抽提試劑盒提取pGEM-T/hALR cDNA及pGEX-4T-3質粒DNA，進行BamH I、EcoR I雙酶切，并用膠回收試劑盒回收酶切后的hALR cDNA片段。酶切后的pGEX-4T-3質粒DNA片段用DNA清潔試劑盒純化。酶切反應體系為pGEM-T/hALR cDNA 12μl(約2μg)，10×緩沖液3μl，BamH I 1μl(10U)，EcoR I 1μl(10U)，ddH2O13μl，總體積30μl，混勻，短暫離心后37℃孵育2hr。pGEX-4T-3質粒1μl(約2μg)，10×緩沖液2μl，BamH I 1μl(10U)，EcoR I 1μl(10U)，ddH2O 15μl，總共20μl，混勻，短暫離心后37℃孵育2hr。
2)連接連接反應體系為酶切后的pGEX-4T-3質粒DNA 4μl(約0.5μg)，膠回收的hALR片段13μl(約0.4μg)，10×緩沖液2μl，T4DNA ligase 1μl(5U)，總體積20μl，混勻，短暫離心后16℃孵育6hr。
2.重組質粒的篩選和鑒定按氯化鈣常規方法制備感受態大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α，取上述連接混合液10μl分別轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α，均勻涂布于LB瓊脂培養平板(含Amp 100μg/μl)，放置37℃恒溫培養約16小時。然后從平板上挑取單克隆，接種于5ml液體LB培養基(含Amp 100μg/μl)振搖培養過夜。部分菌液用于DNA序列測定，部分菌液用質粒抽提試劑盒抽提質粒pGEX-4T-3/hALReDNA，并用BamH I、EcoR I進行雙酶切鑒定，雙酶切后可見到約380bp的片段，說明hALR cDNA片段已插入到表達載體pGEX-4T-3中。
3、重組人促肝再生因子的表達從LB平板上挑取一個單菌落，接種到50ml液體LB培養基中，37℃，200rpm培養過夜，然后以5％的比例接種到250ml LB培養基中，培養約4hr，顯微鏡觀察無雜菌污染后，以4％的比例接種到5L發酵培養基中，溫度37℃，起始轉速200rpm，通氣量5L/min，pH7.0，培養過程中通過控制轉速、通氣量維持溶氧在30％以上，培養約3hr后，開始補加少量葡萄糖，至OD600達到10左右，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導，誘導3hr后，停止發酵。12000rpm，4℃離心20min收集菌體，棄上清。
4、超聲破菌稱取10g菌體，加入100ml 10mM的PBS緩沖液，700W超聲破菌20分鐘，顯微鏡觀察菌體95％以上破碎后，12000rpm，4℃離心20min，收集上清，棄去殘渣。
5、親和層析純化采用Glutathione Sepharose 4B柱，層析柱先用pH8.0 10mM PBS緩沖液平衡，然后取超聲破碎上清直接上柱，上樣完畢后，以PBS緩沖液淋洗至基線，以PBS+10mM Glutathione洗脫液洗脫，收集融合蛋白。電泳可見約41000Da的條帶，純度在85％以上。
6、酶切將收集的融合蛋白測定蛋白含量后，以融合蛋白∶凝血酶＝7∶1的比例加入凝血酶，20℃酶切20hr，電泳檢測可見融合蛋白切割率在95％以上，出現26000Da和15000Da兩條條帶，分別是GST和ALR。
7、分離純化(1)加熱離心酶切過后，將酶切液放置于65℃水浴鍋中加熱10分鐘，因ALR在此溫度下不會變性，仍存在于上清中，而其余大部分雜蛋白變性沉淀。12000rpm，4℃離心20min，收集上清。
(2)陰離子交換柱純化將加熱離心后的上清通過Sephadex G-25柱將緩沖液轉換成10mM Tris-HCl(pH7.2)。然后上Q Sepharose High Performance柱，上樣完畢后，用10mM Tris-HCl pH7.2淋洗，然后進行梯度洗脫，A液10mM Tris-HCl pH7.2，B液500mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.2，梯度0-100％B，先后出現3個明顯的峰，分別在27％、38％、100％時出現，分別收集，經電泳檢測，第一個為目的峰。
(3)凝膠過濾交換緩沖液取目的峰洗脫液通過Sephadex G-25柱將緩沖液轉換成PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)。電泳檢測純度達95％以上。測定蛋白濃度后，加入終濃度為4％的甘露醇，分裝凍干。
或(1)DEAE柱層析純化酶切液通過Sephadex G-25將緩沖液轉換成50mM Tris-HCl(pH8.0)。采用DEAE-Sephrose FF陰離子交換柱，先用50mmol/L Tris·Cl，pH8.0緩沖液平衡，取換過緩沖液的酶切液上樣，上樣完成后用50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液洗脫未結合相，然后進行梯度洗脫，A液50mM Tris-HCl(pH8.0)緩沖液，B液50mM Tris-HCl，lM NaCl，pH8.0緩沖液，0-100％，梯度洗脫時間1h，收集目的峰，電泳檢測純度達90％以上。
(2)凝膠過濾柱純化采用Sephacryl S-100凝膠柱，用PBS緩沖液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2PO4，1.8mM KH2PO4)平衡后，經DEAE純化后的收集液直接上樣，然后用PBS緩沖液洗脫，收集目的峰，電泳檢測純度達95％以上。測定蛋白濃度后，加入終濃度為4％的甘露醇，分裝凍干。
三、活性測定1、四唑鹽(MTT)法檢測rhALR的體外促肝細胞增殖作用A、肝癌細胞的傳代培養細胞長成致密單層后，棄去培養液，加3ml D-Hank’s液洗滌瓶內細胞兩次，加入0.1％胰蛋白酶消化液2ml，37℃消化2-3min，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞收縮、細胞間隙變大時，棄去胰酶，加入含10％小牛血清的RPMI1640培養基終止消化。輕輕刮下細胞并吹打分散均勻，以1-2×104個細胞/ml的密度接種，5％CO2培養箱37℃培養。每2-3天換液一次，長成致密單層后再次傳代培養。
B、四唑鹽(MTT)比色實驗經消化獲得的傳代培養的肝癌細胞加入含10％小牛血清的RPMI1640培養基，調整細胞濃度為2.0×104個/ml，取100μl接種于96孔培養板，置5％CO2培養箱37℃培養12小時使細胞貼壁，棄掉培養基。實驗孔加入含rhALR的RPMI1640培養基，對照孔加入RPMI1640培養基，孵育12hr后，棄掉培養基，D-Hank’s液洗滌2次。每孔加入100μl RPMI1640培養基和10μl MTT(5mg/ml)，37℃孵育4hr，棄去液體，每孔加入100μl異丙醇(含0.1N鹽酸)，放置數分鐘，使MTT結晶溶解，酶標儀595nm處測定吸收值。結果發現，rhALR可刺激肝源性肝癌細胞系SMMC7721、Hep3B細胞增殖，并具有一定的劑量-效應關系。對SMMC7721細胞系，在rhALR濃度為7.3ng/ml時，其對細胞系增殖的刺激作用明顯高于對照組。對Hep3B細胞系，在rhALR濃度為21.9ng/ml時，其對細胞增殖的刺激作用與對照組相比具有顯著差異(P＜0.05)。
2、小鼠CCl4損傷模型檢測rhALR體內活性A、rhALR的抗CCl4致小鼠死亡作用取88只昆明種小鼠隨機分為3組，組I(n＝8)給予CCl4的溶媒豆油；組II(n＝8)單獨給予rhALR；組III(n＝36)單獨給予CCl4，組IV(n＝36)在給予CCl4的同時給予rhALR。觀察小鼠一周內的死亡情況。所用CCl4的濃度為20％(溶于豆油)，以20ml/kg.bw的劑量進行一次性腹腔注射。rhALR的濃度為7.3μg/ml，采用20ml/kg.bw的劑量進行尾靜脈注射。
單獨給予溶媒豆油及rhALR的兩組動物(組I、II)在處理一周內均無死亡，說明豆油及rhALR對小鼠的死亡率無影響，組III有31只小鼠死亡，死亡率86.1％，表明所給CCl4可造成小鼠急性肝中毒；組IV有24只小鼠死亡，死亡率66.7％，與組III相比死亡率下降具有顯著性(P＜0.05)，表明rhALR具有抗CCl4致小鼠死亡的作用。
B、rhALR在CCl4致小鼠肝損傷中的作用取64只昆明種小鼠隨機分為四組。組I(n＝5)給予溶媒豆油的同時給予rhALR；組II(n＝5)單獨給予溶媒豆油；組III(n＝27)給予CCl4的同時給予rhALR；組IV(n＝27)單獨給予CCl4。組III在24hr時補加一次rhALR。所有動物在處理48hr后眼球取血，測血清GPT、AKP水平。所用CCl4濃度為20％(溶于豆油)，以20ml/kg.bw的劑量進行一次性腹腔注射。rhALR的濃度為7.3μg/ml，采用20ml/kg.bw的劑量進行尾靜脈注射。經檢查，組I和組II中小鼠的GPT和AKP水平都在正常范圍，而且兩者之間無明顯差異，說明溶媒豆油和rhALR對小鼠肝臟無明顯損傷作用。組IV動物的GPT和AKP水平極顯著的高于組I和組II(P＜0.01)，說明CCl4破壞肝細胞造成肝損傷，使肝細胞內酶GPT和AKP隨細胞損傷逸入血液。組III與組IV相比，其GPT和AKP水平下降非常顯著(分別為P＜0.05，P＜0.01)，說明rhALR有保護肝細胞或促進肝細胞修復作用。顯微鏡下觀察組IV中小鼠肝細胞廣泛腫脹、變性，中央靜脈周圍可見多處壞死，但組III中小鼠的肝細胞變性及壞死均較組IV明顯減輕。
序列表sequence 1 重組人促肝再生因子衍生物氨基酸序列Gly Ser Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp1 5 10 15Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu20 25 30His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln35 40 45Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys50 55 60Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Ash His Pro65 70 75 80Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His85 90 95Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys100 105 110Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp115 120 125sequence 2 重組人促肝再生因子衍生物DNA序列ggatccatgc ggacgcagca gaagcgggac accaagttta gggaggactg cccgccggat60cgcgaggaac tgggccgcca cagctgggct gtcctccaca ccctggccgc ctactacccc120gacctgccca ccccagaaca gcagcaagac atggcccagt tcatacattt attttctaag180ttttacccct gtgaggagtg tgctgaagac ctaagaaaaa ggctgtgcag gaaccaccca240gacacccgca cccgggcatg cttcacacag tggctgtgcc acctgcacaa tgaagtgaac300cgcaagctgg gcaagcctga cttcgactgc tcaaaagtgg atgagcgctg gcgcgacggc360tggaaggatg gctcctgtga c 381
sequence 3 RT-PCR擴增引物P15’GGGA TCCATG CGG ACG CAG CAG AAG CGG GAC AC 3’sequence 4 RT-PCR擴增引物P25’GGA ATT CTA GTC ACA GGA GCC ATC CTT CCA GCC GTC G 3’sequence 5 定點突變引物M5’C AGC ACA CTC CTC ACA GGG 3’
權利要求
1.一種人促肝再生因子衍生物，其特征在于該人促肝再生因子衍生物具有下述氨基酸序列Gly Ser Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp1 5 10 15Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu20 25 30His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln35 40 45Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys50 55 60Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro65 70 75 80Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His85 90 95Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys100 105 110Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp115 120 125其具有下述DNA序列ggatccatgc ggacgcagca gaagcgggac accaagttta gggaggactg cccgccggat 60cgcgaggaac tgggccgcca cagctgggct gtcctccaca ccctggccgc ctactacccc 120gacctgccca ccccagaaca gcagcaagac atggcccagt tcatacattt attttctaag 180ttttacccct gtgaggagtg tgctgaagac ctaagaaaaa ggctgtgcag gaaccaccca 240gacacccgca cccgggcatg cttcacacag tggctgtgcc acctgcacaa tgaagtgaac 300cgcaagctgg gcaagcctga cttcgactgc tcaaaagtgg atgagcgctg gcgcgacggc 360tggaaggatg gctcctgtga c381
2.根據權利要求1所述的人促肝再生因子衍生物的制備方法，其特征在于該人促肝再生因子衍生物通過原核細胞大腸桿菌融合表達系統獲得。
3.根據權利要求2所述的重組人促肝再生因子的制備方法，其特征在于其中所述的原核細胞大腸桿菌融合表達包括下列步驟1)提取胎肝總RNA2)RT-PCR擴增目的片段hALR cDNA3)純化PCR產物4)克隆目的片段至載體pGEM-T5)重組質粒的篩選和鑒定6)PCR定點突變修復7)質粒DNA pGEM-T/hALR cDNA的BamH I、EcoR I雙酶切8)凝膠回收hALR cDNA片段9)hALR cDNA克隆于原核融合表達載體pGEX-4T-3形成pGEX-4T-3/hALR cDNA10)轉化大腸桿菌進行誘導表達11)離心收集菌體12)超聲破碎，離心，收集上清液13)親和層析柱純化14)收集目的峰，加入凝血酶酶切15)酶切液65℃加熱，離心，收集上清，陰離子交換柱純化，凝膠過濾柱交換緩沖液，分裝、凍干；或陰離子交換柱純化，凝膠過濾柱純化，分裝、凍干16)體外、體內活性測定
4.根據權利要求2或3所述的重組人促肝再生因子的制備方法，其特征在于其中所述的原核細胞大腸桿菌融合表達中人促肝再生因子cDNA克隆選用的質粒載體為pGEM-T。
5.根據權利要求2或3所述的重組人促肝再生因子的制備方法，其特征在于其中所述的原核細胞大腸桿菌融合表達中，原核融合表達載體為pGEX-4T-3。
6.根據權利要求2或3所述的重組人促肝再生因子的制備方法，其特征在于其中所述的原核細胞大腸桿菌融合表達中，選用的大腸桿菌為BL21(DE3)或DH5α。
7.根據權利要求2或3所述的重組人促肝再生因子的制備方法，其特征在于其中所述的原核細胞大腸桿菌融合表達中RT-PCR擴增采用的引物P1、P2序列分別為P15’GGGA TCCATG CGG ACG CAG CAG AAG CGG GAC AC 3’P25’GGA ATT CTA GTC ACA GGA GCC ATC CTT CCA GCC GTC G 3’
全文摘要
本發明涉及人促肝再生因子衍生物及其在大腸桿菌中的表達。本發明通過大腸桿菌原核融合表達系統，獲得具有天然活性，不含內毒素，可大規模生產的重組人促肝再生因子衍生物。
文檔編號C07K14/475GK1542018SQ0311666
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月29日 優先權日2003年4月29日
發明者蔡在龍, 毛積芳, 賀雪峰, 陳車生 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學, 上海唯科生物制藥有限公司