專利名稱：一種腫瘤抑制蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的腫瘤抑制蛋白及編碼該蛋白的多核苷酸。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發明的多肽是一種抑制腫瘤惡性增殖的腫瘤抑制蛋白。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，成為造成人類死亡的第二大病因。據統計，我國死于惡性腫瘤的前五位癌癥依次為胃癌、肝癌、肺癌、食管癌和大腸癌。腫瘤是一種細胞的異常增生。癌細胞可以不受控制地生長繁殖，侵犯鄰近正常組織并轉移到遠處的組織器官。癌的發生是一個多因素，多階段的復雜漸進的過程。
正常細胞的癌變與其改變了的遺傳特性有關。通常細胞內有兩套基因。一類是參與細胞的生長代謝，促進與調節細胞繁殖和分化的，如原癌基因。另一類是正常細胞內能抑制細胞轉化和腫瘤發生的，如腫瘤抑制基因或抑癌基因。兩類基因的突變紊亂，包括點突變，DNA片段的缺失或移位等會使細胞無限增殖，使機體發生癌變。
近年來外科手術，放療和化療構成腫瘤治療的三大模式。這些治療方法基于直接殺傷腫瘤細胞，常難徹底消滅腫瘤細胞，又易損傷正常組織，特別是傷害機體免疫系統，影響正常的細胞免疫。隨著現代分子生物學和基因工程技術的發展，生物治療已成為腫瘤治療的第四模式。在通常情況下，腫瘤與機體防御之間存在動態平衡，平衡的失調導致腫瘤的增殖與播散。腫瘤的生物治療指通過腫瘤宿主防御機制或生物制劑的作用以調節機體自身的生物學反應，從而抑制或消除腫瘤生長的治療方法。例如利用腫瘤的抑癌基因治療，通過借助于基因轉移法恢復或添加腫瘤細胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢復抑癌基因的功能，從而對腫瘤的惡性增殖或轉移產生一定的抑制和治療作用為了有效地治療和預防腫瘤，本領域迫切需要開發研究腫瘤抑制蛋白及其激動劑/抑制劑。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的腫瘤抑制蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種分離的腫瘤抑制蛋白，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有腫瘤抑制功能(如抑制肝癌細胞惡性增殖)的由(a)衍生的多肽。
較佳地，所述的腫瘤抑制蛋白的序列如SEQ ID NO2所示。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼本發明上述的腫瘤抑制蛋白。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO2。更佳地，該多核苷酸的序列選自下組(c)SEQ ID NO1的全長序列，或(d)SEQ ID NO1中第151-1341位序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備腫瘤抑制蛋白的制備方法，該方法包含(a)在表達條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出腫瘤抑制蛋白。
在本發明的第五方面，提供了與上述的腫瘤抑制蛋白特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續10個核苷酸至全長核苷酸，較佳地它含有連續的約15-1000個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的腫瘤抑制蛋白或編碼本發明腫瘤抑制蛋白的多核苷酸，以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌癥以及細胞異常增殖等病癥。本發明還提供了本發明蛋白和多核苷酸的用途，它們被用于制備治療腫瘤(尤其是肝癌)的藥物。
在本發明的第七方面，提供了一種檢測肝癌的方法，它包括步驟檢測肝細胞樣本中HCRP1轉錄本的數量，如果樣本中HCRP1轉錄本的數量低于正常對照，就表明樣本中存在肝癌細胞的幾率大于正常組織。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、Northern雜交檢測HCRP1的mRNA在人各組織中的表達。表明HCRP1基因在人正常肝組織中高量表達。
圖2、軟瓊脂克隆形成實驗檢測HCRP1抑制肝癌細胞的惡性增殖能力。圖中(a)，穩定轉染空載體pcDNA3的SMMC-7721細胞株作對照；(b)，穩定轉染HCRP1基因的SMMC-7721細胞株克隆形成受抑制；(c)，穩定轉染反義HCRP1 cDNA的SMMC-7721細胞株克隆形成能力明顯增強。
圖3、裸鼠成瘤性實驗檢測HCRP1抑制腫瘤生長的能力。圖中(a)，穩定轉染空載體pcDNA3的SMMC-7721細胞株作為對照；(b)，穩定轉染HCRP1基因的SMMC-7721細胞株成瘤性減弱；(c)，穩定轉染反義HCRP1 cDNA的SMMC-7721細胞株的成瘤性明顯增強。
具體實施例方式
本發明人利用定位候選克隆的方法分離到一個新的腫瘤抑制相關基因HCRP1。它位于人染色體8p22區域，這個區域在很多腫瘤中發生高頻的雜合性缺失，是克隆抑癌基因的熱點區域。全序列測定表明HCRP1cDNA全長為1917bp(SEQ ID NO1)，包含有一個完整的蛋白編碼框(第151-1341位)，編碼了一個由397個氨基酸組成的腫瘤抑制蛋白HCRP1(見SEQ ID NO2)。
本發明還進行了HCRP1基因的組織表達分布實驗，通過與8種正常人組織mRNA的Northern雜交實驗，表明HCRP1在肝組織中表達量最高，在肺、脾、肌肉和睪丸中表達量中等，在腦、心、胃中微量表達或不表達。此外，軟瓊脂克隆形成實驗表明，HCRP1高表達會抑制SMMC-7721細胞在軟瓊脂上的克隆形成。而且利用反義cDNA減弱HCRP1的表達促進了SMMC-7721細胞在軟瓊脂上的克隆形成。這證明了HCRP1具有抑制肝癌細胞惡性增殖的能力。在裸鼠中進行的成瘤性實驗也表明，HCRP1具有的抑制腫瘤生長的作用。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的腫瘤抑制蛋白或多肽”或“分離的HCRP1”是指腫瘤抑制蛋白HCRP1基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化腫瘤抑制蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
如本文所用，“本發明多肽”指腫瘤抑制蛋白HCRP1或其具有抑制腫瘤功能的活性片段、衍生物和類似物。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括HCRP1的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然HCRP1相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO3所示的成熟多肽具有相同的生物學功能(以FP3361蛋白為例)和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼HCRP1的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的HCRP1核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明多核苷酸的載體，以及用本發明載體或HCRP1編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的HCRP1。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼HCRP1的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，HCRP1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含HCRP1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可包被于細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的HCRP1或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HCRP1功能低下或喪失所致的疾病(如肝癌)，和用于篩選促進或對抗HCRP1功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制HCRP1的功能。用表達的重組HCRP1篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激HCRP1功能的多肽分子。
本發明也提供了篩選藥物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)HCRP1的藥劑的方法。HCRP1的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。HCRP1的拮抗劑可以與HCRP1結合并消除其功能，或是抑制HCRP1的產生，或是與多肽的活性位點結合使多肽不能發揮生物學功能。
本發明的多肽可直接用于疾病治療，例如，各種惡性腫瘤、和細胞異常增殖等。
本發明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞可以用來作為抗原以生產抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。
可以將本發明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。HCRP1以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的HCRP1的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
HCRP1的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于HCRP1的無表達或異常/無活性的HCRP1的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體可用于治療HCRP1表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將HCRP1基因轉移至細胞內。構建攜帶HCRP1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組HCRP1基因可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明還提供了針對HCRP1抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。這些抗體可用常規方法制備。抗HCRP1的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的HCRP1。
抗體也可用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如HCRP1高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。
多克隆抗體的生產可用HCRP1或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
HCRP1單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產抗HCRP1的單鏈抗體。
本發明還涉及定量和定位檢測HCRP1水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的HCRP1水平，可以用作解釋HCRP1在各種疾病中的重要性和用于診斷HCRP1起作用的疾病。
HCRP1的多聚核苷酸可用于HCRP1相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HCRP1的多聚核苷酸可用于檢測HCRP1的表達與否或在疾病狀態下HCRP1的異常表達。如HCRP1DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷HCRP1的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HCRP1特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HCRP1的轉錄產物。
檢測HCRP1基因的突變也可用于診斷HCRP1相關的疾病。HCRP1突變的形式包括與正常野生型HCRP1 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的主要優點在于1、提供了一個全新的腫瘤抑制蛋白HCRP1，該蛋白對于加深了解腫瘤發生、發展的分子機制具有重要的意義。
2、本發明發現HCRP1可以抑制肝癌細胞株在軟瓊脂上的克隆形成和減弱裸鼠的成瘤性，表明HCRP1參與細胞生長的負凋控，可以作為藥物或作為藥物的靶序列等應用臨床，包括腫瘤相關疾病的早期診斷和治療。
3、HCRP1在正常人組織中的表達有特異性，在肝中高量表達，在肺、脾、肌肉和睪丸中中量表達，在腦、心、胃中微量表達或不表達，顯示該基因在肝組織中具有特別重要的功能。可應用于作為肝、肺、脾和睪丸相關疾病的診斷和治療制劑。
4、由于本發明的HCRP1具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1、HCRP1全長基因克隆根據定位候選克隆的方法與人類基因組的核酸序列數據庫，設計多聚酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物P1(SEQ ID NO3)，引物P2(SEQ ID NO4)。以肝臟的cDNA文庫質粒(GIBCO BRL公司產品)為模板，PCR擴增獲得HCRP1基因cDNA，PCR反應條件為94℃2分鐘預變性，循環反應為94℃30秒，50℃30秒，72℃2分鐘，共進行35個循環。PCR產物用低熔點瓊脂糖凝膠回收純化，方法參照《分子克隆.實驗指南》(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniais，T.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。全序列測序(由博亞公司測定)。
獲得的cDNA全長為1917bp(SEQ ID NO1)，包含了一個完整的蛋白編碼區(第151-1341位)，編碼了一個由397個氨基酸組成的蛋白質(SEQ ID NO2)。
實施例2、HCRP1在人正常組織中的表達分析將固定有正常人的8種不同組織的poly(A)+RNA雜交膜放入雜交管中，加入5mL雜交液(君軒公司提供)，65℃預雜交30分鐘，加入變性的32P隨機標記的HCRP1片段的探針(Random Primer DNA標記試劑盒，TaKaRa公司)，65℃雜交過夜。雜交膜用洗滌緩沖液I(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉(PH7.0)，0.05％十二烷基磺酸鈉)于室溫30分鐘；然后用洗滌緩沖液II(15mM NaCl，1.5mM檸檬酸鈉(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS))于50℃洗兩次，每次20分鐘。然后，壓X光片，-70℃放射自顯影。
實驗結果如圖1所示。表明HCRP1基因在肝中高量表達，在肺、脾、睪丸和肌肉中中量表達，在腦、心、胃中微量表達，表達產物大小約為2Kb。
實施例3、HCRP1真核表達載體的構建與蛋白產物的表達與檢測。
根據HCRP1的cDNA序列設計引物P3(SEQ ID NO5)與引物P4(SEQ ID NO6)，引物的兩側分別有XbaI與EcoRI的酶切位點。以經過測序驗證的HCRP1序列為模板，進行PCR反應。PCR產物經過低熔點瓊脂糖凝膠回收純化，加入限制性內切酶XbaI與EcoRI(TaKaRa公司產品)。37℃消化一個小時后，回收純化。同時將載體pCMV-Tag2A(Stratagene公司產品))用相同的限制性內切酶XbaI與EcoRI酶切一個小時，低熔點瓊脂糖凝膠回收純化。將兩種回收產物用T4 DNA連接酶(TaKaRa公司產品)16℃連接過夜，轉化至DH5α菌株中。通過篩選，得到重組的HCRP1質粒，命名為pcDNA3-Flag-HCRP1。根據HCRP1的cDNA序列設計引物P5(SEQ ID NO7)與引物P6(SEQ ID NO8)，引物的兩側分別有HindIII與SalI的酶切位點。用與上述同樣的方法即PCR擴增HCRP1基因，克隆入載體pcDNA3，通過篩選，得到重組的含有反義HCRP1 cDNA的質粒，命名為pcDNA3-HCRP1(-)。
人肝癌細胞SMMC-7721用RPMI 1640培養液(GIBCOL BRL公司產品)加入10％小牛血清(GIBCOL BRL公司產品)，37℃，5％CO2培養。細胞以200,000個的接種量接種入60mm的細胞培養皿，37℃培養。24小時后用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司產品)轉染SMMC-7721細胞。分別加入1.5μg的pcDNA3、pcDNA3-Flag-HCRP1、pcDNA3-HCRP1(-)質粒。轉染24小時后，換新鮮培基并加入G418(GIBCOL BRL公司產品)至700μg/mL。繼續培養三周，中間經常換加有G418的培養基。挑取單克隆并擴大培養，篩選穩定表達HCRP1的細胞株稱為SMMC-7721/HCRP1(+)，穩定轉染反義HCRP1質粒的細胞株稱為SMMC-7721/HCRP1(-)，穩定轉染對照質粒pcDNA3的細胞株稱為SMMC-7721/con。
實施例4、HCRP1抑制SMMC-7721肝癌細胞在軟瓊脂上的克隆形成將SMMC-7721/con、SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)細胞分別加入含有10％胎牛血清和700μg/mLG418的RPMI1640培養液的培養瓶中，37℃，5％CO2培養。將對數期的生長細胞消化后與含0.35％瓊脂的完全培基混勻，加入已鋪有0.6％瓊脂的六孔板中，每孔細胞的濃度為2×104。在37℃，5％CO2的條件下培養三周后，將含有多于50個細胞數的克隆計數并拍照。
結果表明，SMMC-7721/HCRP1(+)細胞株形成克隆的能力低于SMMC-7721/con對照細胞，而SMMC-7721/HCRP1(-)在軟瓊脂上的克隆形成能力(包括克隆的大小和數量)高于對照細胞株(圖2)。這說明HCRP1可以抑制腫瘤細胞在軟瓊脂上的惡性增殖。
實施例5、HCRP1抑制肝癌細胞在裸鼠中的成瘤性將對數期生長的SMMC-7721/con、SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)細胞消化后，用無血清的培基洗兩次，懸浮于PBS中。注射于裸鼠(BALB/C，雄性，六周齡)背部兩側的皮下，每一點注射細胞數為2×106/100μL。注射11周后，處死裸鼠，拍照并取瘤稱重。
實驗結果如圖3所示。SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)在裸鼠中形成的瘤子分別小于和大于SMMC-7721/con對照組，這與軟瓊脂克隆形成實驗的結果一致，說明HCRP1能抑制腫瘤的形成。
實施例6 HCRP1蛋白重組表達和純化將HCRP1基因通過NheI和XhoI酶切位點裝入pET24a((Novagen公司)融合表達載體中，然后轉化大腸桿菌BL21-DE3，擴增，抽取質粒并以相應的限制性內切酶鑒定，通過DNA測序確證。
經鑒定的轉化細胞株，按照1∶20比例接種于LB培養基(每升培養基含有10gPolypepton，5g yeast extract，10g NaCl)中，37℃培養三小時左右至OD600為0.6-0.8時，加入IPTG至終濃度0.5mM，誘導表達3～4小時。
菌體收獲后，6000rpm，10分鐘離心收集菌體；用溶液TEG(含100mMNaCl)(10mL/g菌體)重懸菌體，超聲波破細胞，每次30秒，間隔1分鐘，共超生波12次；加入10％脫氧膽酸鈉至2％，攪拌10分鐘，13000rpm離心10分鐘；沉淀重懸于TEG(含50mM NaCl)，加入10％脫氧膽酸鈉至2％，攪拌10分鐘，13000rpm離心10分鐘，重復此步驟兩次；最后得到的沉淀為HCRP1包涵體蛋白，4℃保存。取包涵體蛋白走電泳，染色后將His-HCRP1蛋白條帶從膠中割下，用Electro-Eluter(BioRad公司產品)回收HCRP1蛋白。
實施例7抗HCRP1蛋白抗體的制備取300μg實施例6中純化的HCRP1融合蛋白，溶解于0.5mL PBS中，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分混勻，皮內多點注射于2.0kg雄性新西蘭大白兔背部。第三天，再次以同樣蛋白量用弗氏完全佐劑充分混勻后，皮內多點注射于背部。第28天，以同樣蛋白量用弗氏不完全佐劑混勻后，背部皮內注射以加強免疫。在此一周后，頸動脈放血收集血液，37℃放置3小時，4℃放置過夜以使血清完全析出，離心收集血清，分裝，-70℃保存。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種腫瘤抑制蛋白及其應用<130>030713<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1916<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(151)..(1341)<223>
<400>1ggcaggacag gcttagagaa gacgcggtcc ccagcgcttg ggccacggac gtcccacccc 60gctccttgtc gctggagaac cgccgggccg agccactggg agaagcaggc cagagccttc 120cagggcctcc ggcccgtgga cccgaggagg atg agc tgg ctt ttt ccc ctg acc 174Met Ser Trp Leu Phe Pro Leu Thr1 5aag agc gcc tcc tcc tcc gcg gct ggg tcc ccc ggt ggc ctc acc agc222Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Pro Gly Gly Leu Thr Ser10 15 20ctc cag cag cag aag cag cgc ctg atc gag tcc ctc cgg aac tca cac270Leu Gln Gln Gln Lys Gln Arg Leu Ile Glu Ser Leu Arg Asn Ser His25 30 35 40tcc agt ata gcc gaa ata cag aaa gat gtg gaa tac aga ttg cca ttc318Ser Ser Ile Ala Glu Ile Gln Lys Asp Val Glu Tyr Arg Leu Pro Phe45 50 55acc ata aac aac ctg aca att aac att aat ata ttg ctt cct cca cag366Thr Ile Asn Asn Leu Thr Ile Asn Ile Ash Ile Leu Leu Pro Pro Gln60 65 70ttt cct cag gaa aaa cca gtg atc agt gtt tat cca cca ata cga cat414Phe Pro Gln Glu Lys Pro Val Ile Ser Val Tyr Pro Pro Ile Arg His75 80 85cac tta atg gat aaa caa gga gtg tat gtt acc tct cca tta gta aac462His Leu Met Asp Lys Gln Gly Val Tyr Val Thr Ser Pro Leu Val Asn90 95 100
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>引物<400>7
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<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物<400>8cgcgtcgact tcctctcttg gcagttc 2權利要求
1.一種分離的腫瘤抑制蛋白，其特征在于，選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有腫瘤抑制功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的蛋白，其特征在于，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼權利要求1所述的多肽。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組(c)SEQ ID NO1的全長序列，或(d)SEQ ID NO1中第151-1341位序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權利要求6所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
8.一種腫瘤抑制蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出腫瘤抑制蛋白。
9.一種能與權利要求1所述的腫瘤抑制蛋白特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽或權利要求3所述的多核苷酸以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種新的腫瘤抑制蛋白HCRP1，編碼此多肽的多核苷酸和經重組技術產生該多肽的方法。該腫瘤抑制蛋白HCRP1是利用定位候選克隆的方法克隆到。它定位在人染色體8p22上，cDNA全長為1917個核苷酸，編碼397個氨基酸的蛋白質。將HCRP1導入肝癌細胞，能夠抑制肝癌細胞的惡性轉化能力。
文檔編號C07K14/435GK1548454SQ03116920
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月14日 優先權日2003年5月14日
發明者趙慕鈞, 徐振華, 梁亮, 李載平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院