專利名稱：由附著于纖維素珠表面的配體顯示的蛋白質a的模擬活性的制作方法
相關申請根據35U.S.C§119(e)，本申請要求享有與2000年4月28日申請的臨時申請US60/200591相同的申請日，并且該文件作為參考文件被引入本文。
背景技術：
目前所有的蛋白質純化體系都存在缺陷，尤其是對于大規模的純化而言。特別是，就純度和產量而言，對于抗體的純化就更不充分了。因此，由于制備具有治療和診斷目的的純化的免疫球蛋白需要大量的溶劑和較長的生產時間，所以現有加工方法的費用很大。
在親和分離中，待純化的蛋白質選擇性和可逆地附著至互補結合物質或親和配體上，所述親和配體經常數倍于抗體分子。通常，與其它的分離技術相比，親和分離產生很低的非特異結合。這種很低的非特異結合使得從復合的生物混合物中純化給定的蛋白質、從天然分子中分離出不正確的折疊形式并回收所述的蛋白質成為可能。
已知的純化體系使用玻璃或金屬管，其中含有填滿分離介質如珠或顆粒的柱子。這些管子被稱為柱式盒。由于分離介質被緊壓進該柱式盒中，所以流速很慢且該柱式盒的容量也有限。因此，現有純化技術的焦點已經集中在提高分離介質的多孔率從而增加流速和柱式盒中的容量。這些已知體系的目的是在最短的時間內純化最大量的物質，同時產品中的污染物含量較低且產量較高。老的純化技術的一個問題是雖然提高分離介質的多孔性使得流速加快和容量增加，但是產量和純度卻降低了。
OrbicellTM纖維素珠購自伊利諾州的Accurate Polymers有限公司，并記載在1999年6月2日由Stipanovic等人申請的美國專利申請US09/324,527中，該申請的題目為使用非多孔纖維素珠的靜置分離方法，在此被引入作為參考。
一種典型的親和附著劑由固體載體、間隔臂和配體構成。間隔臂可以通過使配體更易接近而促使蛋白質結合。某些親和分離產品不具備足夠長度或合適特性的間隔臂而有助于目標化合物如抗體的附著。為了克服這種限制，需要有一種間隔臂，它對配體具有較好的取向、使目標化合物之間位阻降低、也使配體之間的位阻下降，由此能夠更好地使目標化合物附著。由于間隔臂和/或配體的幾何形狀使得目標化合物容易附著于配體，因此提高了目標化合物的產量。目前需要一種配體即對目標化合物如蛋白質例如抗體表現出特異和可逆的結合特性。
在固定的金黃色葡萄球菌蛋白質A(SpA)，蛋白質G和蛋白質M柱子上的親和色譜法是當今單克隆抗體和多克隆抗體生產的純化方法。這些來源于細菌的蛋白質不僅僅生產費用高，而且生物和化學穩定性差。對于被用來純化治療用途抗體的附著劑來說，具有清潔和殺菌的能力是常規管理(regulatory authority)絕對要求的。多克隆抗體以及最近開發的單克隆抗體都通過親和柱色譜法進行常規的純化。這些抗體已經廣泛用于診斷領域，但是近來類似的抗體被越來越多地發現它們在治療方面的用途。后者的應用很難耐受任何親和附著劑的不穩定性，當蒸發時這種情況變得尤其關鍵，或者常規機構將要求進行嚴格的化學殺菌處理。
當然，與在診斷領域的應用相比，最終在治療方面的應用將促進對更大量高純度抗體的需求。但是，就未來成比例增加的需求，目前的技術現狀所面對的第一個障礙是那些細菌來源的蛋白質非常昂貴。附著劑最大的費用在于常規管理即在需要殺菌操作過程中對該附著劑潛在不穩定性的全面檢查。因此，目前需要解決上述現有技術存在的這些問題和其它難題。
最近在分子模型中的進展已經使得研究小組能夠提供比細菌來源的蛋白質更小的分子，令人驚奇的是，對于很多免疫球蛋白來說，它們還能夠模擬相應細菌蛋白質的高親和性和選擇性。所述的模型合物到短至中等長度的肽。這些肽中的一部分是直線型的，而其它則具有大環結構。
發明概述本發明涉及新穎的配體、制備該配體的方法、使用該配體純化化合物的方法以及該新穎配體與纖維素珠的附著。
生物分子特別是免疫球蛋白的大規模純化是通過使用纖維素珠完成的，該纖維素珠附著于小的非肽化合物上，其對于待純化的生物分子來說具有高親和性和選擇性。另外，帶有式子I-IV附著配體的珠在嚴格的回收和殺菌操作中的化學穩定性也很高。純化化合物的方法包括，為含有待分離化合物的溶液提供具有式子I-IV配體的載體基質，使得該配體與待分離的化合物相互作用，清洗該載體基質，洗脫出待分離的化合物。在另一個實施方案中，所述載體基質包括間隔臂。
參照下面詳細描述的優選的實施例以及結合附圖
將會更好地理解本發明。以下的描述是描述性的、闡述和舉例性的，并不是對所附權利要求保護范圍的限制。
發明詳述在一個實施方案中，式子I表示模擬蛋白質A對免疫球蛋白的親和性的非肽小化合物。模擬蛋白質A親和性的化合物還可以叫做蛋白質A模擬物(PAM)。如反應1所示，可以制備式子I的配體并固定在OrbicellTM珠上，其具有間隔臂表面化學，終端為分子量范圍在64和2000道爾頓之間的直線聚乙二醇分子上的氨基。肼可以與終端酯反應，產生以酰肼官能團為終端的分子超結構。在另一個實施方案中，該分子超結構所具有的終端官能團選自由以下基團組成的組琥珀酰亞胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基(cynomethyl)、氯甲酰基和對-硝基苯(phynel)酯。該纖維素珠的大小范圍在約0.1微米至20微米。該分子超結構改善了所得的附著配體的幾何形狀。該分子超結構的兩個終端肼基團使大量的配體能夠附著。
在一個優選的實施方案中，待分離的免疫球蛋白是IgG。在IgG分子和附著于載體基質如OrbicellTM珠上的模擬SpA配體之間發生疏水性作用。因此，從添加具有附著模擬SpA配體的非多孔纖維素珠的溶液中能夠分離出IgG。IgG附著到珠上的模擬SpA上。從具有配體-lgG復合物的珠上清洗出雜質，繼續洗脫得到lgG，以及可重復使用的珠，該珠具有再生的配體用于重復結合IgG。該配體更容易附著于載體基質，并且與IgG的反應性較大。
如反應1所示，一旦以酰肼官能團為終端，s-三嗪基部分(b)就可以附著。在二氯-s-三嗪階段產生與肼的反應，因為第二個氯化物比第三個氯化物的反應性要大。由于氯化物沒有全部反應，所以該化合物的反應性高且這種高反應性提高了產量。一旦附著在珠表面，所得的單氯三嗪衍生物(c)在比該反應其它階段的所用溫度要高的反應溫度下被迫與過量的氨基化合物(d)反應。
本發明式子I的配體在較好的空間控制條件下附著到固體狀態的復合物上(載體基質，或例如OrbicellTM珠)，并且與IgG(或其它待純化的目標化合物)具有更高的反應性。至少這些因素增加了純化IgG的總產量。纖維素表面上的肼部分容易與二氯三嗪分子的易反應氯化物反應。所需的兩個相鄰配體基團的分子幾何形狀產生IgG與配體的多個附著點。肼表示最短的雙官能NH2基團連接，其使得空間排列最佳并且配體最接近。因此，在表面上添加空間排列得到改善的改進的配體并結合使用改進的非多孔OrbicellTM珠能夠提高所述基質和IgG(即其它抗體或目標化合物)之間的相互作用。 式I反應1獲得了很高水平的單氯三嗪衍生物的取代。為檢驗抗體的親和性分離而測試式I的配體。該附著劑表現出很高的活性(抗體產量是44mg/g珠)和選擇性(經HPLC分析的純抗體沒有發現存在雜質峰(shoulders))。
在另一個實施方案中，對免疫球蛋白的模擬蛋白質A活性的另一個配體來自鄰苯二甲酸衍生物。如反應2所示，過量摩爾的二甲基-5-硝基間苯二甲酸鹽與甲醇中的三胺反應，分離出單酰胺并結晶(a)。間苯二甲酸酯的5-硝基單酰胺進一步與過量的苯胺反應，提供混合的5-硝基二酰胺(b)。在氫氣壓力下經Pd催化劑進行氫化反應得到混合的5-氨基二酰胺化合物(c)，SA-B。 反應2現在化合物SA-B能夠被接枝到纖維素珠表面上，該纖維素珠具有間隔臂，其是通過N-琥珀酰亞胺酯被官能活化的羧基，如圖所示，產生通式II的配體。
在另一個實施方案中，制備式子II配體的方法包括使(4’羥基)乙氧苯基酰氨基(phenetyalmido)-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺與終端活化的酯官能團反應。
式II反應3在另一個實施方案中，制備式子III配體的方法包括在肽-偶聯劑存在的情況下，使(4’羥基)乙氧苯基酰氨基-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺與終端的叔二羧基-乙基胺反應。
另一個可選擇的移植方法是基于在使用常規的碳二亞胺試劑的條件下羧基官能化的珠與氨基SA-B的偶聯，如反應4所示，產生下面的通式III的配體。 反應4
附著劑的另一個實施方案包括具有分子量高達大約60至2000道爾頓的α，ω-二氨基聚乙二醇基團的固定(pegylated)在其表面上的直徑大約0.1-20μ的非多孔纖維素珠。伯胺與三環氧化物反應形成氨基-2-羥基加合物。剩余的環氧化物與硫醇(巰基)雜環化合物反應，其中R基團包括pi富電子體系，產生通式IV的配體。巰基雜環化合物可以選自巰基-N-甲基咪唑(imidiazol)、2-巰基吡啶、巰基吡啶-N氧化物、2-巰基咪唑、2-巰基苯并咪唑、2-巰基-5-苯并咪唑磺酸鈉、2-巰基-苯并噻唑、2-巰基苯并噁唑、2-巰基-5-甲基苯并咪唑、2-巰基-1-甲基咪唑、2-巰基-4-甲基嘧啶、2-巰基-5-硝基苯并咪唑、2-巰基吡啶、2-巰基吡啶N-氧化物、2-巰基-嘧啶、2-巰基-4(3H)-奎寧-鋅(quinalo-zine)、2-巰基噻唑啉、2-巰基-噻唑、2-巰基噻二唑(thiadiazol)和5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-硫醇以及本領域技術人員已知的其它巰基雜環化合物。接枝的巰基雜環化合物選擇與生物分子結合，其除整個IgG分子之外包括IgM、IgY(雞蛋)、Fab和Fc抗體片段。 RsH＝巰基雜環體系反應5本領域的技術人員能夠用硫醇、酰胺或其它等同物完成式I-IV的苯酚基團的取代。而且，還包括式I-IV的鹽。
在一個實施方案中，純化方法包括提供能夠結合免疫球蛋白的模擬蛋白質A(SpA)。該模擬蛋白A與載體基質結合。在一個優選的實施方案中，所述載體基質是纖維素珠。在一個優選的實施方案中，待分離的免疫球蛋白是IgG。IgG分子和模擬SpA配體之間發生相互反應。從帶有配體-IgG復合物的珠上清洗出雜質，使得以后的洗脫液產生純的IgG和可再利用的具有能夠與IgG重復結合的再生配體的珠。
實施例1在實施例1的蛋白質純化方法中，200g的氨基官能化的OrbicellTM珠在真空和溫和加熱的條件下放置于2升的丙醇中。絕大部分水通過大約200ml的共沸物的蒸餾作用去除。向丙醇中的懸浮液添加大約100g的丙烯酸甲酯，所得的懸浮液在旋轉或攪拌的情況下在約68℃的水浴中進行加熱長達約36小時，使之進行反應。該反應完成后(根據對在該OrbicellTM珠上的氨基的陰性試驗所表明)，該懸浮液進行攪拌直到冷卻至約35℃。冷卻后，該反應混合物進行旋轉蒸發，蒸餾出約1000至1200ml的共沸物(5％丙烯酸甲酯-95％正-丙醇)。在蒸餾過程，另一部分1L正-丙醇添加進該蒸餾液中，并持續蒸餾直至共沸蒸餾液的總體積達到2.1-2.2升。此時剩下的懸浮液只是具有微弱氣味的丙烯酸甲酯。
實施例2用正-丙醇調節由實施例1獲得的懸浮液的總體積，使總體積范圍在1100至1200ml。在劇烈混合下，添加70g的無水肼，在約45℃下攪拌該懸浮液約14-16小時。所得的反應產物被離心，并用丙醇清洗該酰肼珠三次。丙醇清洗后，用水徹底清洗珠直到過濾物對肼的試驗是陰性為至。
實施例3將含有約100g干珠的來自實施例2的濕潤的酰肼官能化的珠分布于400ml的0.1mol的二乙酸鈉中(5.7g的商購二乙酸鈉結晶，在395ml蒸餾水中)。向該水懸浮液中添加1000ml二甲氧乙烷和53g(0.22mol)的苯胺基-二氯-s-三嗪。在45℃下攪拌該懸浮液約6-8小時。對酰肼試驗為陰性后，經離心分離珠，并用二甲氧乙烷清洗一次。然后用乙醇清洗珠5次，接著用N-甲基吡咯烷酮清洗一次。
實施例4將來自實施例3的珠分散于1升的N-甲基吡咯烷酮中，并添加25g(0.2mol)的三嗪。該反應混合物在攪拌下被加熱并維持在68℃大約36小時。冷卻到室溫后，在籃式離心機中，用N-甲基吡咯烷酮清洗珠三次，再用正-丙醇清洗三次。在切向流系統中用水徹底清洗得到式I的配體。
實施例5用98％的乙醇清洗約23.27g的3-7μOrbicallTM珠6次，該珠上含有伯氨或仲氨基團。將該懸浮液置于200ml的乙醇中，該乙醇添加了7.8g的三環氧化物，該混合物在約64℃下攪拌約18小時。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)試驗表明所述珠上的胺已完全反應。在臺架式離心機(benchtop centrifuge)上用乙醇清洗所述混合物，然后用水清洗，最后用pH9.7的0.15M碳酸鈉清洗，并懸浮在包括65ml乙醇和pH9.5的35ml的0.15M碳酸鈉緩沖液的100ml混合物中。向該懸浮液中添加約2.7g的硫代咪唑，在室溫下攪拌該懸浮液約18小時。然后用水清洗該懸浮液。無需進一步的清洗，所述具有式IV配體的珠能夠用于結合實驗中。
實施例6使用OrbicellTMSimul-M珠的蛋黃IgY的分離用pH8的150ml0.05M的磷酸鹽緩沖液提取商購的蛋黃，并用聚苯乙烯珠搖動脫脂。通過添加固體鹽調節該提取液至0.5M硫酸鈉。添加具有式IV配體的OrbicellTM珠，振動/攪拌該懸浮液1小時。將該懸浮液引入分離設備中(例如在臺架籃式離心機中的TAPS或交叉流動系統)，用0.5M的硫酸鈉清洗該珠。用0.01M pH7.5的磷酸鈉從清洗過的珠上洗脫出IgY。通過SDS/(聚丙烯酰胺凝膠電泳)PAGE和/或HPLC檢驗純化IgY的純度。
表1蛋黃IgY的純化步驟 每份蛋黃的IgY量％純度脫脂蛋黃 100mg 15硫酸銨沉淀 ＞70mg 70-80Simul-M親和性＞60mg ＞90實施例7從OrbicellTM親和珠上分離溶液的幾種方法的用途將2.00mg商購的人類免疫球蛋白G(所有類別)[hlgG]溶解在pH為7.5的1.5ml的150mM氯化鈉的10mM磷酸氫鈉(pBS)中。向該溶液添加0.125ml用式I接枝的濕潤的OricellTM珠(等于25mg的干珠)，經旋渦混合懸浮珠。在臺式搖擺機中緩慢地搖動該懸浮液。大約1小時后，使珠離心分離為小顆粒(在微離心機(microfuge)上中等速度下)，去除上清液，在分光光度計上280nm讀數。在280nm處的光密度的降低(OD280)表明85％以上的IgG結合到珠上。然后，用pBS通過在pBS離心分離的懸浮作用清洗該珠5次，傾析，再次懸浮在pBS中并再次離心。經第四次或第五次清洗，被清洗物的OD280降低至空白值，表明幾乎沒有或沒有未結合的IgG。將所述珠懸浮在0.2M甘氨酸HCL，pH2.5(1.5ml)，并離心分離。含有IgG的分離上清液用2M的Tris.Cl，pH8中和。重復該提取步驟兩次獲得多于90％的IgG(1.8mg)。
對于含有免疫球蛋白的其它溶液，該離心分離方法也能夠成功地使用。例如，將商購的IgA添加到玉米胚乳提取液中(對免疫球蛋白分泌的基因工程獲得的玉米進行原型純化，)。添加用式I型親和珠接枝的珠，然后進行培養(23±2℃)，離心分離，傾析，用pBS清洗5次，接著提取珠結合的IgA，產率以起始IgA計大約是97％。對分離IgA樣品的PAGE分析表明代表起始原料的三個帶都僅具有痕量的玉米提取蛋白質。
除了交叉流動和直接離心(以獲得小顆粒料)，其它從OrbicellTM珠分離溶液(或水)的方法包括籃式離心(液體通過珠原料和編織籃過濾器)，移動，多孔帶式分離(液體通過所述的帶)，連續的離心分離，濾器)，移動，多孔帶式分離(液體通過所述的帶)，連續的離心分離，液體穿過珠的移動物料的灌注方法和很多其它的方法。
實施例8在含有40μg/ml單克隆IgG抗體(MoAb)和約20μg污染物的400mlCHO細胞灌注液樣品中，添加600mg接枝式I配體的OrbicellTM干珠。在室溫下(大約28℃)溫和攪拌該懸浮液約1個半小時直到MoAb附著完成。在交叉流動微過濾系統中將該懸浮液濃縮至60ml(約1％的懸浮液)。然后，在pH7.5(微堿性)下用10體積(600ml)的50mol的磷酸鹽緩沖液與200mmol/L的氯化鈉清洗該珠的污染物。在pH大約2.5下用10體積(600ml)的0.2mol的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫附著的抗體，將該來自過濾器的滲透液引入到pH約8.5的摩爾tris-緩沖溶液中立即進行中和。中和的MoAb溶液經超濾濃縮(50,000分子量截斷膜)，用十二烷基硫酸鈉/巰基乙醇分離樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行表征。而且，高壓配體色譜(HPLC)(尺寸-排除類型)也可以用于一些樣品的表征和定量。經HPLC的MoAb純度約96％，產率約92％。
對在此引用或引入的任何專利或專利申請沒有表示或暗示認可。如上所述，上述的討論僅是闡述性的、說明性的和舉例性的，并不視為對本申請任何權利要求保護范圍的限制。
權利要求
1.一種純化化合物，包括載體基質；分子超結構；和附著到分子超結構上的式I配體。
2.權利要求1的純化化合物，其中所述載體基質是纖維素珠。
3.權利要求2所述的純化化合物，其中所述纖維素珠基本上是非多孔的。
4.權利要求1所述的純化化合物，還包括在接枝點與具有分子超結構的載體基質相連接的間隔臂。
5.權利要求4所述的純化化合物，其中所述的間隔臂具有終端酯基團。
6.權利要求4所述的純化化合物，其中所述間隔臂是線性聚乙二醇分子，其分子量范圍在約64和2000道爾頓之間。
7.權利要求1的純化化合物，其中所述的分子超結構具有終端酰肼基團。
8.權利要求1的純化化合物，其中所述的纖維素珠的尺寸范圍在約0.1微米至20微米之間。
9.權利要求1的純化化合物，其中所述分子超結構選自由通過C-C，C-O，C-N和C-S鍵相鏈接的線性或支鏈組成的基團。
10.權利要求1的純化化合物，其中所述分子超結構具有選自琥珀酰亞胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基、氯甲酰基和對-硝基苯酯的終端官能基團。
11.權利要求1的純化化合物，其中所述配體是式I的同類物。
12.權利要求1的純化化合物，其中所述配體以及與配體相附著的分子超結構形成亞氨基-雙-[2-(2’-丙酰基)酰肼-4-苯胺基-6-(4”-羥基)乙氧苯基胺-s-三嗪]。
13.權利要求12的純化化合物，其中s-三嗪部分至少被一個與另一個氮原子連接的氮原子取代。
14.制備式I產品的方法，包括使2-苯胺基-4，6-二氯-s-三嗪與具有終端酰肼官能團的分子超結構反應。
15.制備式I純化化合物的方法，包括使s-三嗪基部分與肼官能團反應。
16.一種純化化合物，包括載體基質；分子超結構，和式II配體。
17.權利要求16的純化化合物，其中所述載體基質是纖維素珠。
18.權利要求17的純化化合物，其中所述纖維素珠基本上是非多孔的。
19.權利要求16的純化化合物，還包括在接枝點與具有分子超結構的載體基質相連接的間隔臂。
20.權利要求19所述的純化化合物，其中所述間隔臂是線性聚乙二醇分子，其分子量范圍在約64和2000道爾頓之間。
21.權利要求17的純化化合物，其中所述的纖維素珠的尺寸范圍在約0.1微米至20微米之間。
22.一種制備式II配體的方法，包括使(4’羥基)乙氧苯基酰氨基-1羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺與終端活化的酯官能團反應。
23.權利要求22的方法，其中所述終端活化的酯官能基團選自琥珀酰亞胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基、氯甲酰基和羧酸的對-硝基苯酯的基團。
24.制備式II配體的方法，包括使5-氨基二酰胺與羰基反應。
25.一種純化化合物，包括載體基質；和式III配體。
26.權利要求25的純化化合物，其中所述載體基質是纖維素珠。
27.權利要求26的純化化合物，其中所述的纖維素珠基本上是非多孔的。
28.權利要求25的純化化合物，還包括與具有分子超結構的纖維素珠相連接的間隔臂。
29.權利要求28的純化化合物，其中所述間隔臂是線性聚乙二醇分子，其分子量范圍在約64和2000道爾頓之間。
30.權利要求26的純化化合物，其中所述的纖維素珠的尺寸范圍在約0.1微米至20微米之間。
31.制備式III配體的方法，包括使5-氨基二酰胺與羰基反應。
32.制備式III配體的方法，包括在肽偶聯劑存在下，使4’(羥基)乙氧苯基酰氨基-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺與終端叔二羧基-乙基胺反應。
33.權利要求32的方法，其中所述肽偶聯劑是二環己基碳二亞胺。
34.一種純化化合物，包括載體基質；和式IV配體。
35.權利要求34的純化化合物，其中所述的載體基質是纖維素珠。
36.權利要求35的純化化合物，其中所述的纖維素珠基本上是非多孔的。
37.權利要求34的純化化合物，還包括與具有分子超結構的纖維素珠相連接的間隔臂。
38.權利要求37的純化化合物，其中所述的間隔臂是線性聚乙二醇分子，其分子量范圍在約64和2000道爾頓之間。
39.權利要求36的純化化合物，其中所述的纖維素珠的尺寸范圍在約0.1微米至20微米之間。
40.權利要求34的純化化合物，還包括一種分子超結構，其中該分子超結構是與所述間隔臂相連的終端反應的環氧官能基團。
41.一種制備式IV配體的方法，包括使間隔臂上的伯氨基團與三環氧化合物反應形成終端的二環氧化合物；使該終端的二環氧化合物與巰基雜環化合物反應。
42.權利要求41的制備方法，其中所述巰基雜環化合物選自巰基-N-甲基咪唑、2-巰基吡啶、巰基吡啶-N-氧化物、2-巰基咪唑、2-巰基苯并咪唑、2-巰基-5-苯并咪唑磺酸鈉、2-巰基-苯并噻唑、2-巰基苯并噁唑、2-巰基-5-甲基苯并咪唑、2-巰基-1-甲基咪唑、2-巰基-4-甲基嘧啶、2-巰基-5-硝基苯并咪唑、2-巰基吡啶、2-巰基吡啶N-氧化物、2-巰基-嘧啶、2-巰基-4(3H)-奎寧-鋅、2-巰基噻唑啉、2-巰基-噻唑、2-巰基噻二唑和5-甲基1，3，4-噻二唑-2-硫醇以及它們的組合。
43.一種純化化合物，包括式I的配體。
44.一種純化化合物，包括式II的配體。
45.一種純化化合物，包括式III的配體。
46.一種純化化合物，包括式IV的配體。
47.一種純化化合物，包括載體基質和非肽配體。
48.權利要求47的純化化合物，其中所述載體基質是纖維素珠。
49.權利要求47的純化化合物，還包括間隔臂。
50.權利要求47的純化化合物，其中所述間隔臂具有終端肼基團。
51.權利要求47的純化化合物，其中所述非肽化合物選自式I、式II、式III、式IV的基團和它們的組合。
52.一種純化化合物，包括使用中間5-氨基二酰胺化合物而形成的配體。
53.一種純化方法，包括提供具有結合有非肽配體的載體基質；將上述結合有非肽配體的載體基質引入含有目標化合物的溶液中；使得在所述配體和目標化合物之間發生相互作用；清洗具有其上結合目標化合物的配體的珠，使得目標化合物從上述溶液中洗脫出，其中所述其上具有配體的載體基質可再利用。
全文摘要
一種純化蛋白質的方法和化合物，包括將非肽的小化合物(其模擬蛋白質A對免疫球蛋白的親和性)附著于載體基質上。一旦附著在載體基質上后，所得的一氯三嗪衍生物與過量的氨基化合物在較高的溫度下反應獲得高水平的取代。生成的具有配體的載體基質用于抗體的親和性分離。而且巰基雜環體系配體也可以附著于超級載體基質上，并用于抗體的親和性分離。
文檔編號C07K16/02GK1436095SQ01810048
公開日2003年8月13日 申請日期2001年4月30日 優先權日2000年4月28日
發明者B·斯蒂帕諾維克, M·格里芬, I·斯卡帕 申請人:準確聚合物公司