專利名稱：誘導對β淀粉狀蛋白和淀粉狀蛋白沉積物的免疫反應、與β淀粉狀蛋白同源的免疫源性但 ...的制作方法
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背景技術：
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的描述阿爾茨海默氏病(AD)是成年人中最常見的老年性癡呆形式(Soto等，1994)，該病在美國是導致死亡的第4大殺手。65歲以上的人群中大約有10％的人受到這種漸進性退化疾病的影響，這種疾病表現為記憶喪失、混亂以及各種各樣的認知障礙。從神經病理學的角度來說，AD的特征在于4種主要的損害a)神經原纖維纏結(NFT)在神經元內和胞質中的沉積；b)實質淀粉狀蛋白沉積，稱為神經炎斑；c)腦血管淀粉樣變性；和d)突觸和神經元損失。AD的一個主要事件是淀粉狀蛋白作為不溶的纖維物質的沉積(淀粉狀蛋白產生)，導致細胞外的神經炎斑和大腦血管壁周圍的沉積。神經炎斑和嗜剛果的(congophilic)血管病的主要構成是β淀粉狀蛋白(Aβ)，雖然這些沉積還含有其它的蛋白質，如糖胺聚糖和載脂蛋白。
Aβ是4.1-4.3kDa的疏水肽，它在第21號染色體上編碼，作為較長的淀粉狀蛋白前體蛋白APP的一部分(Muller-Hill等，1989)。APP以一條前導序列(信號肽)開始，接著是富含半胱氨酸的區域、富含酸性氨基酸的區域、蛋白酶抑制子基元、推定的N-糖基化區域、跨膜區域，最后是小的胞質區。Aβ序列從細胞外側接近膜的位置開始，結束于膜內。Aβ的2/3在細胞外空間，1/3被埋在膜中(Kang等，1987；Dyrks等，1988)。幾種證據表明，淀粉狀蛋白在AD的早期發病中可能起主要作用。
淀粉狀蛋白可能在AD的早期發病中起重要作用的證據主要來源于對受家族式AD(FAD)或唐氏綜合癥影響的個體的研究。唐氏綜合癥患者具有3個拷貝的APP基因，他們在小的時候發展了AD神經病理學(Wisniewski等，1985)。對家族的遺傳性AD進行的遺傳學分析揭示，除了在早老素1號和2號基因中有突變外，在第21號染色體上接近或在Aβ序列中也有突變(Forsell等，1995)。而且，據報道，表達高水平的人突變體APP的轉基因小鼠在大腦中逐漸地發展淀粉樣變性(Games等，1995)。這些發現似乎暗示在AD的病理生理學中的淀粉狀蛋白產生。此外，Aβ原纖維在神經元培養物中是毒性的(Yankner等，1989)，并且，在注射到動物大腦內時，在一定程度上也是有毒性的(Sigurdsson等，1996和1997)。
此外，幾個其它方面的證據也表明，Aβ的沉積是AD發病中的主要觸發事件，它接著導致了NFT形成和神經元損失。AD中的淀粉狀蛋白沉積與所有其它大腦淀粉樣變性(如朊病毒蛋白相關的淀粉樣變性)以及全身性淀粉樣變性具有許多特征。這些特征是1)相對不溶解；2)具有高的β-折疊次級結構，這與它們傾向于聚集或聚合相關；3)在超微結構上，這些沉積物主要是原纖維的；4)存在某些淀粉狀蛋白相關的蛋白質，如淀粉狀蛋白P成分、蛋白聚糖和載脂蛋白；5)在剛果紅染色后，在偏振光下觀察時，沉積物顯示出特征性的蘋果綠雙折射。
還發現AD大腦中形成淀粉狀蛋白沉積的相同肽的可溶形式(sAβ)，這種形式通常在人體液中環流(Seubert等，1992；Shoji等，1992)。Zlokovic等(1994)報道，血腦屏障(BBB)具有控制腦血管隔離和運輸環流的sAβ的能力，并且將sAβ與載脂蛋白J(apoJ)的復合物灌注給豚鼠時，sAβ跨BBB的運輸明顯增加了。在正常的腦脊髓液(CSF)中發現sAβ-apoJ復合物(Ghiso等，1994)，并且，體內研究表明，sAβ在正常的人血漿中與apoJ一起作為高密度脂蛋白(HDL)的成分而被運輸(Koudinov等，1994)。Zlokovic等(1996)還報道，當apoJ受體gp330被阻斷時，sAβ的跨BBB運輸幾乎被消除。可認為sAβ向不溶的原纖維的轉化是由2-3氨基酸較長可溶形式的構象改變引起的。已建議淀粉狀蛋白的形成是成核依賴性的現象，其中最初不溶的“晶種”使淀粉狀蛋白選擇性沉積(Jarret等，1993)。
含有Aβ的1-40或1-42序列和較短的衍生物的肽可在沒有其它蛋白質的情況下形成淀粉狀蛋白樣原纖維，這表明形成淀粉狀蛋白殘基的潛力主要在Aβ的結構中。通過改變該肽的序列，分析了Aβ的主要結構及其形成淀粉狀蛋白樣原纖維的能力之間的關系。在內部Aβ疏水區域(第17-21個氨基酸)中用親水的殘基取代疏水殘基，削弱了原纖維的形成(Hilbich等，1992)，表明Aβ的裝配部分是由疏水相互作用驅動的。實際上，含有兩個或三個額外的疏水C末端殘基的較大的Aβ肽(Aβ1-42/43)更易產生淀粉狀蛋白(Jarrett等，1993)。第二，Aβ肽采用的構象對于淀粉狀蛋白形成是關鍵性的。在不同的pH、濃度和溶劑中培育的Aβ肽可能具有主要的α-螺旋、隨機的螺旋，或者β-折疊次級結構(Barrow等，1992；Burdick等，1992；和Zagorski等，1992)。具有α-螺旋或隨機螺旋結構的Aβ肽緩慢地聚集；具有β-折疊構象的Aβ迅速地聚集(Zagorski等，1992；Soto等，1995；Soto等，1996)。通過比較其它淀粉狀蛋白源性蛋白的序列，也表明了疏水性和β-折疊次級結構對淀粉狀蛋白形成的重要性。
采用濁度測量對Aβ聚集的分析表明，Aβ的C末端區域長度通過加速核的形成影響Aβ裝配的速率(Jarrett等，1993)。因而，Aβ的C末端區域可調節原纖維生成。但是，Aβ淀粉狀蛋白形成的體外調節子，如金屬陽離子(Zn、Al)(Bush等，1994；和Exley等，1993)、硫酸肝素蛋白聚糖和載脂蛋白E(Strittmatter等，1993)與Aβ的12-28區域相互作用。而且，Aβ區域的N末端中APP基因的突變產生更易于產生原纖維的類似物(Soto等，1995；Wisniewski等，1991)。最后，當Aβ的C末端區域在水溶液中總是β-鏈結構時，環境參數決定了AβN末端區域中另一構象的存在(Barrow等，1992；Soto等，1995；Burdick等，1992)。因此，該N末端可以是抑制原始的隨機螺旋變為β-折疊構象的潛在的靶位點。
使用合成肽進行的研究獲得的圖表明，Aβ淀粉狀蛋白形成依賴于采用反平行β-折疊構象的Aβ肽的疏水性相互作用，以及N末端和C末端區域對于淀粉狀蛋白形成都是重要的。原纖維形成的基本單元似乎是采用反平行β-折疊的構象子，該構象子由包括該肽的10-24區域和29-40/42區域的鏈組成(Soto等，1994)。淀粉狀蛋白形成由幾種單體的β-鏈間的分子間相互作用進行，形成原纖維的β-交叉構象的寡聚的β-折疊結構前體。Wood等(1995)報道，將阻斷聚集的脯氨酸插入淀粉狀蛋白和肽中，以阻止這些蛋白質和肽的聚集。在這種方式中，這些作者建議，為避免聚集的問題，可設計新穎的蛋白質作為針對它們產生的屏障，而不影響天然蛋白質的結構或功能。從而，Wood等通過將阻斷聚集的脯氨酸插入這些新穎的肽中，尋求在重組蛋白質生產和純化期間產生不聚集的新穎的蛋白質。
目前，對減少患者的淀粉狀蛋白負荷或阻止AD中的淀粉狀蛋白沉積還沒有治愈或有效的治療，即使是AD的明確診斷，也僅僅是在大腦組織死后對標記神經質纖維纏結和神經炎斑的檢測中進行的。但是，有越來越多的出版物提出了治療阿爾茨海默氏病的策略。淀粉狀蛋白相關的治療策略包括使用影響淀粉狀蛋白-β前體蛋白(APP，Dovey等，2001)的加工的化合物，該化合物干擾原纖維的形成，或促進原纖維的分解(Soto等，1998；Sigurdsson等，2000；Findeis，2000)。
硫酸肝素(糖胺聚糖)或硫酸肝素蛋白聚糖——基底膜聚糖已被鑒別為所有淀粉狀蛋白的成分，并且和炎癥相關的淀粉狀蛋白誘導的最早期階段有牽連。Kisilevsky等(1995)描述了使用低分子量(135-1,000Da)的陰離子磺酸鹽或硫酸鹽化合物，這些化合物干擾硫酸肝素與炎癥相關的淀粉狀蛋白前體和AD的β-肽的相互作用。硫酸肝素特別影響可溶的淀粉狀蛋白前體(SAA2)采取增加了淀粉狀蛋白的蛋白質折疊模式的β-折疊結構特征。這些陰離子磺酸鹽或硫酸鹽化合物抑制肝素加速的阿爾茨海默氏病的Aβ原纖維的形成，并且使用電子顯微鏡可監測到它們能在體外分解預成形的原纖維。而且，當以相對高的濃度(20或50mM)口服時，在急性和慢性模型中，這些化合物基本上在體內阻止了鼠脾炎癥相關的淀粉狀蛋白進展。但是，最有效的化合物聚-(乙烯基磺酸酯)則是劇毒的。
已在臨床上觀察到蒽環類4′-碘-4′-脫氧-阿霉素(IDOX)能誘導免疫球蛋白輕鏈淀粉樣變性(AL)患者再吸收淀粉狀蛋白。Merlini等(1995)闡述了它的作用機制。已發現IDOX通過疏水相互作用強烈地與5種不同的測試淀粉狀蛋白原纖維中的兩種不同的結合位點(Scatchard分析)結合，抑制原纖維生成以及隨后的淀粉狀蛋白沉積的體外形成。預先培育IDOX與淀粉狀蛋白增強因子(AEF)也可減少淀粉狀蛋白沉積的形成。IDOX對體內淀粉狀蛋白沉積的特異性靶向在急性鼠模型中得到證實。這種結合與硫酸肝素結合不同，不同之處在于用肝素酶從抽提的淀粉狀蛋白原纖維中除去糖胺聚糖并沒有改變IDOX結合。所有的淀粉狀蛋白的共有結構性特征是β-折疊構象。但是，IDOX不與天然的淀粉狀蛋白前體輕鏈結合，這表明單獨的β-折疊骨架并不足以形成用于IDOX結合的最佳結構，要產生最大的IDOX結合，需要原纖維交聯-β-折疊四級結構。還已發現。從脾中抽提得到的IDOX的量與淀粉狀蛋白負荷相關，而與循環的血清前體淀粉狀蛋白水平不相關。但是，IDOX也是劇毒的。
在美國專利第5,385,915號和WO 9427603中也已研究了通過抑制或調節APP控制蛋白的磷酸化而對淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)進行的調節和加工。在AU9338358和EP 569777中也已經檢測了對APP進行蛋白水解加工，使其變成AD的成核形式。WO 95046477公開偶聯于載體的組合物X-X-N-X的合成肽(SEQ IDNO69)，其中X是陽離子性氨基酸，N是中性氨基酸，該肽抑制Aβ與糖胺聚糖的結合。在WO 9203474中公開了含有抑制α-1-抗胰凝乳蛋白酶與Aβ偶聯的阿爾茨海默氏的Aβ序列的肽。
從本發明者的實驗室中進行的實驗來看，WO 96/39834公開了參與淀粉狀蛋白樣沉積形成的、能與蛋白質或肽(如Aβ)上的疏水部分相互作用的肽，可用于抑制和從結構上阻斷這些蛋白質和肽異常折疊成淀粉狀蛋白或淀粉狀蛋白樣沉積物。阻斷Aβ異常折疊成淀粉狀蛋白沉積物的肽具有疏水部分，該部分含有β-折疊斷裂氨基酸殘基，如脯氨酸，這些殘基減少該肽采取β-折疊構象的傾向。本發明者的實驗室在后期的報道中已證明，與Aβ具有序列同源性的非淀粉狀蛋白源性肽LeuProPhePheAsp(SEQ ID NO14)阻斷原纖維的形成(Soto等，1998)，并在體內誘導原纖維Aβ沉積物的分解(Sigurdsson等，2000)。
最近，Pallitto等(1999)在設計抗-β折疊肽或Aβ原纖維生成抑制物時，提出將賴氨酸殘基連接到肽上，所述抑制物具有Aβ-結合識別序列和六聚體賴氨酸聚集中斷元件。
體外研究顯示，針對Aβ的N末端區域產生的單克隆抗體可解集Aβ原纖維，維持Aβ的可溶性，并阻止細胞培養物中的Aβ毒性(Solomon等，1996和1997)。
WO 96/25435公開了使用單克隆抗體的可能性，該抗體在阻止Aβ1-42的聚集中，對Aβ1-42肽而非Aβ1-43肽的游離C末端是端特異性的。給予這種Aβ端特異性單克隆抗體，其結果進一步揭示這種抗體與Aβ1-42的游離C末端殘基相互作用，從而干擾并中斷了可能導致AD發病的聚集。
WO 98/44955采取一種不同的方法來避免與重復給予藥劑相關的問題，公開了一種通過對淀粉狀β肽具有端特異性的重組抗體在大腦中的穩定的異位表達，阻止阿爾茨海默氏病的發病或抑制阿爾茨海默氏病發展的方法。
最近，Schenk等(1999)證明，用淀粉狀-β進行免疫減弱了PDAPP轉基因小鼠中的阿爾茨海默氏病樣病理學，這種小鼠用作淀粉狀蛋白-β沉積作用和阿爾茨海默氏病樣神經病理學的動物模型。他們報道，在年輕的動物發生阿爾茨海默氏病型神經病理前，先對其進行免疫，可基本上阻止β-淀粉狀蛋白斑形成的發展、神經炎性營養不良和星形膠質細胞生成(astrogliosis)，而對于年長動物，在其發生阿爾茨海默氏病型神經病理后才進行治療，結果觀察到這些神經病理的程度和進展得到減少。這種結果被認為是由抗體介導的，因為外周給予的針對Aβ的抗體已顯示出能減少大腦中的實質淀粉狀蛋白負荷(Bard等，2000)。此外，用新制的溶液化Aβ1-40鼻內免疫，可減少大腦的淀粉狀蛋白負荷(Weiner等，2000)。最近的兩項研究證明，疫苗誘導的大腦中淀粉狀蛋白沉積物的減少導致認知上的改善(Morgan等，2000；Janus等，2000)。
雖然Schenk等報道的結果提供了使用免疫調節作為治療阿爾茨海默氏病的一般方法的希望，但是根據他們的提法，用完整的淀粉狀蛋白-β進行免疫出現了使其不適用于人的問題。首先，Schenk等的試驗使用了表達突變的人蛋白質的轉基因小鼠，該蛋白質對于小鼠來說是外源的，但在小鼠中不產生生理學功能(小鼠和人的Aβ肽序列有很大差異)。但是，對于人，前體蛋白質(βAPP)是一種具有正常功能的外源蛋白質。因此，在具有人Aβ肽的人中采用這種方法，其結果很有可能會導致自身免疫疾病或者可能使問題變得更糟糕而非更好的疾病的發展。其次，B.Zlokovic(1997)和本發明者已得出證明Aβ肽、Aβ1-42和Aβ1-40可通過實驗動物的血腦屏障的結果。因此，對于人，可以預見Schenk等用來免疫的Aβ1-42可通過血腦屏障，并在任何已存在的淀粉狀蛋白斑上共沉積，從而導致毒性增加，并且可能事實上促進斑的形成。這在用于研究AD的PDAPP轉基因小鼠模型中并未產生，因為人Aβ1-42對于小鼠的毒性較小；即使在人Aβ1-42有大量的沉積，轉基因小鼠中也沒有一只顯示出有明顯的神經元損失。再次，Schenk等使用毒性佐劑來誘導免疫應答。
本文所引用的任何文獻都不能認為是本發明者承認這些文獻是相關的現有技術，或者認為它們對本申請的任何權利要求的專利性起實質性作用。關于內容的任何申明或者任何文獻的日期都是以申請人在提交時所獲得的信息為基礎，本發明者對這樣一種申明的正確性不負責任。
發明概要本發明提供一種合成的免疫源性的但非淀粉狀蛋白源性的肽，該肽與淀粉狀蛋白β同源，它可用于誘導針對淀粉狀蛋白β肽和淀粉狀蛋白沉積物的免疫應答，并可克服或避免現有技術中遇到的麻煩和問題。
與淀粉狀蛋白β同源的該合成的免疫源性而非淀粉狀蛋白源性的肽包括Aβ1-42(SEQ ID NO1)的前面30個氨基酸殘基，較佳還包括4-10個Lys或Asp殘基的N末端和/或C末端片段，其中，第17-21個殘基中有0、1或2個被Lys、Asp或Glu取代。
本發明還提供一種共軛物，其中，所述肽與免疫刺激聚合物分子交聯。
本發明的另一方面涉及免疫組合物/疫苗，該組合物/疫苗含有免疫有效量的合成性非淀粉狀蛋白源性但與淀粉狀蛋白β同源的免疫源性的肽，或者一種共軛物。
本發明的又一方面涉及一種免疫療法，該方法誘導針對淀粉狀蛋白β肽和淀粉狀蛋白沉積物的免疫應答。
本發明還有一方面涉及一類分子，這類分子包含針對本發明的合成性非淀粉狀蛋白源性但為免疫源性的肽產生的抗體的抗原結合部分。還提供含有這種結合肽的分子的藥物組合物，和減少淀粉狀蛋白原纖維和沉積物的形成的方法。
附圖的簡要說明

圖1顯示硫黃素T熒光試驗的結果。在37℃培育后，在體外測量Aβ1-42、Aβ1-30-NH2和K6Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO6)的原纖維形成。K6Aβ1-30-NH2是在任何時間點上都沒有形成原纖維的唯一的肽。
圖2A和2B顯示，由MTT試驗測得Aβ40和Aβ42對培養物中的人成神經細胞瘤細胞(SK-N-SH)有毒性，而2天內K6Aβ30-NH2則沒有影響(圖2A)，在第6天則是稍微地有營養(圖2B)。與VEH組(單一ANOVA)相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
圖3A-3D顯示Tg對照小鼠(圖3A)和K6Aβ1-30處理的Tg小鼠(圖3B)的海馬和皮層的經針對Aβ用6E10染色的冠狀部分(×50，原始倍數)。圖3C和3D是用識別小膠質細胞的白介素-1以及Aβ雙重染色的鄰近部分(×100)。注意到與對照小鼠相比(圖3A，3C)，免疫小鼠中淀粉狀蛋白負荷減少(圖3B)，相同小鼠中圍繞Aβ斑的分支小膠質細胞缺乏(圖3D)。圖3A和3C中的桿代表100μm。縮寫詞hip＝海馬；cx＝皮層；cc＝胼胝體。
圖4A-4C顯示在用K6Aβ-30-NH2治療7個月后，皮層(圖4A)和海馬(圖4B)中淀粉狀蛋白負荷(6E10)的減少。皮層中的淀粉狀蛋白負荷減少89％(*p＝0.0002，t＝測試；每組n＝4)，在海馬中的淀粉狀蛋白負荷減少81％(*p＜0.0001)。在接種小鼠的大腦內可溶的Aβ1-42的水平(圖4C)減少了57％(*p＝0.0019)。
圖5顯示硫黃素T熒光試驗的結果。在37℃培育后，在體外測量Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-30-NH2、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)的原纖維的形成。
圖6A和6B顯示MTT細胞毒性試驗的結果。在處理人成神經纖維瘤細胞(SK-N-SH)2天(圖6A)和6天(圖6B)后，測定Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-30-NH2、K6Aβ1-30-NH2、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)的神經毒性。與VEH(單一ANOVA)相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
本發明的詳細描述本發明已設計與淀粉狀蛋白β(Aβ)同源的合成性非淀粉狀蛋白源性肽，這些肽不僅具有減少其采取作為抗原來源的β-折疊構象的能力，而且對人產生任何毒性影響的風險還非常低。通過在免疫組合物中使用這些合成性非淀粉狀蛋白源性肽或其共軛物，本發明提供一種給予免疫系統Aβ肽和淀粉狀蛋白沉積物作為靶標的方法。因此，本發明的一種重要目標是提供一種免疫方法，該方法使與注射的Aβ肽相關的毒性減少到最小，而使針對Aβ肽和淀粉狀蛋白沉積物的免疫反應增加到最大。
本發明的與Aβ同源的合成性非淀粉狀蛋白源性但為免疫源性的肽被設計為具有減少原纖維產生的潛力，而維持Aβ肽的兩個主要免疫原性位點，這兩個位點是Aβ1-42上的第1-11個殘基和第22-28個殘基，這兩個位點是以Jameson等(1988)的抗原指數和本發明者在實驗室中獲得的結果/觀察為基礎。因此，本發明合成性非淀粉狀蛋白源性肽是以Aβ1-42的前面30個氨基酸殘基(SEQ ID NO1)為基礎而設計的，其中在SEQ ID NO1的第17-21位置上的一個或兩個疏水殘基被帶電的殘基Lys、Asp或Glu取代。Aβ的前面30個殘基缺乏Aβ1-42的疏水C末端，但保留了對應于SEQ ID NO1的第1-11個殘基和第22-28個殘基的兩個免疫原性位點。
使用其采取β-折疊構象的可能性低的疏水殘基Lys、Asp或Glu改變Aβ1-30(SEQ ID NO1)的位置17-21上的一個或兩個殘基，可大大地減少該肽的原纖維產生潛力。SEQ ID NO12和13是這種修改的Aβ1-30的兩個例子。此外，在本發明合成肽的N末端和/或C末端上存在一系列Lys或Asp殘基可進一步增強免疫原性(Werdelin，1981)，并減少該合成肽采取β-折疊構象以及形成淀粉狀蛋白原纖維/沉積物的傾向。最近，Pallitto等(1999)已提出，在抗-β-折疊肽或Aβ原纖維生成抑制物的設計中，使賴氨酸殘基與長4-8個殘基的Aβ肽連接，但是，它們并未提出使用這種肽作為免疫原。先前已使用多陽離子氨基酸來增強胞吞/吞噬過程中蛋白質向細胞中的運輸(Martinez-Fong等，1994；Wang等，1989；Shen等，1985；Peterson等，1984；Deierkauf等，1997；DiNicola等，2000)。Buschle等(1997)報道，多陽離子氨基酸增強了抗原呈遞細胞對肽的攝取，從而啟動免疫應答。他們還報道，雖然由多賴氨酸介導的肽攝取似乎是由于細胞膜的至少瞬時通透性的緣故，但是多精氨酸存在下的肽傳送可能依賴于胞吞過程。
本發明與Aβ同源的合成性免疫源性但非淀粉狀蛋白源性肽由下式表示，該肽并不是Aβ原纖維生成的肽抑制子(A)m-(N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C)n-(B)p式中，m是0、4、5、6、7、8、9或10；p是0、4、5、6、7、8、9或10；A是Lys或Asp；B是Lys或Asp；n是1或2；N是SEQ ID NO1的第1-16個殘基；C是SEQ ID NO1的第22-30個殘基；Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分別是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有0個、1個或2個被Lys、Asp或Glu替換；當有0個殘基被替換時，m或p之一或兩種不是0。
上述式中表示的肽的氨基酸序列為SEQ ID NO2-5。
基本的30個氨基酸序列(Aβ1-30)其中被替換的第17-21個殘基中有0個、1個或2個由上述式子中的N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C表示。在本發明的合成肽中，這30個氨基酸殘基片段可以重復(n是2)。較佳的是，在該肽的N末端和/或C末端存在長4-10個殘基的多賴氨酸或多天冬氨酸片段。當在Aβ1-30的第17-21個殘基中沒有殘基被替換時，在該肽的N末端和/或C末端具有長4-10個殘基的多賴氨酸或多天冬氨酸片段。如果多賴氨酸或多天冬氨酸片段沒有出現在C末端，則較佳酰胺化該C末端，如優選實施例SEQ ID NO6。SEQ ID NO11是在其C末端具有長4-10個殘基的多賴氨酸或多天冬氨酸的未替換的Aβ1-30肽的實施例。
此外，當m是0，且在N末端缺乏長4-10個殘基的多賴氨酸或多天冬氨酸片段時，較佳的是，將該肽的C末端酰胺化，以減少該肽的C末端電荷降低Aβ的第22-28個殘基片段的免疫原性的可能性，或者使該C末端具有長4-10個殘基的多賴氨酸或多天冬氨酸片段。本發明肽的另一優選的實施例如下當m不是0時，p是0；當p不是0時，m是0；和Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分別是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有1個或2個被Lys、Asp或Glu替換(SEQ ID NO2-5。
本領域熟練的技術人員還將理解，也可使用本發明合成肽的肽擬態，其中肽鍵被非肽鍵取代。
本領域熟練的技術人員已周知，可采用常規的技術，如圓二色性光譜、FT-IR和電子顯微鏡測量肽的懸浮液，測量肽的β-折疊構象，從而可容易地測定本發明合成肽的減少的原纖維產生潛力。
還已周知的是，免疫原必須與主要組織相容性(MHC)抗原II結合，以激活有效的抗體應答。由抗原呈遞細胞(APC)產生的MHC-II抗體以序列特異性的方式與免疫原中的T細胞表位結合。這種MHC-II-免疫原復合物被CD4+淋巴細胞(Th細胞)識別，該淋巴細胞使能識別從呈遞的免疫原得到的B細胞表位的特異性B細胞的增殖，以及使這些B細胞生產B細胞表位特異的抗體。進一步增加本發明合成肽的免疫原性的另一方法是，與免疫刺激性聚合物分子形成共軛物，這些分子如甘露聚糖(甘露糖的聚合物)、葡聚糖(β1-2葡萄糖的聚合物)、三棕櫚酰基-S-甘油半胱氨酸，以及目前許可的在人中用于疫苗的肽。上述許可用在疫苗中的這些肽提供了由有力的免疫原產生強的T輔助細胞(Th)表位，所述免疫原如破傷風毒素、百日咳毒素、麻疹病毒蛋白F和B型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)。選擇用于與該合成肽結合的Th表位較佳能在表達不同MHC單元型的大量個體中引起T輔助細胞應答。這些表位在多樣種群的許多不同個體中起作用，并被認為是混雜的Th表位。混雜的Th表位提供遺傳學不同種群的大多數成員中引起有效的抗體應答的優點。
而且，不僅可根據本發明的合成肽結合/交聯的T輔助細胞表位在給定種群的大多數成員中引起免疫應答的能力，而且引起記憶/回憶反應的能力，而有利地選擇它們。當哺乳動物是人時，接受本發明的合成肽的免疫治療的大多數人受試者/患者很有可能已經兒科疫苗(即，麻疹+流行性腮腺炎+風疹以及白喉+百日咳+破傷風疫苗)免疫，也可能經B型肝炎病毒疫苗免疫。因此，這些患者以前已經暴露于兒科疫苗中存在的至少一種Th表位中。先前使用標準的疫苗免疫而暴露于Th表位應建立Th細胞克隆，這種克隆可在給予所述合成肽后立即增殖(即回憶反應)，從而刺激針對Aβ肽和淀粉狀蛋白沉積物的快速B細胞應答。
雖然可與本發明的合成肽一起使用的Th表位是混雜的，但它們并不包括所有的表位。這一特征說明，Th表位與表達不同MHC抗原的遠系交配種群的大部分(50-90％)反應，而非該種群的所有成員。為了給本發明的合成性非淀粉狀蛋白源性肽提供一種可理解的、方法通用的免疫反應性，可制備具有與合成肽交聯的不同Th表位的的共軛物的混合物。例如，具有從破傷風毒素和百日咳毒素、麻疹病毒蛋白F和HbaAg的混雜的Th表位的四種共軛物的組合可能會更有效。
與本發明合成性非淀粉狀蛋白源性肽交聯的免疫刺激性肽中的Th表位包括B型肝炎表面抗原T輔助細胞表位、百日咳毒素T輔助細胞表位、破傷風毒素T輔助細胞表位、麻疹病毒F蛋白T輔助細胞表位、沙眼衣原體(Chlamydia trachomitis)主要外膜蛋白T輔助細胞表位、白喉毒素T輔助細胞表位、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)環子孢子蛋白T輔助細胞表位、曼森氏裂體吸蟲(Schistosoma mansoni)丙糖磷酸異構酶T輔助細胞表位、大腸桿菌(Escherichia coli)TraT T輔助細胞表位，這些表位公開在美國專利第5,843,446號中，本文將該文的全部公開內容納入作為參考。
本領域熟練的技術人員將理解，用來修飾本發明肽的術語“合成的”指該肽是化學合成的，或者是僅在宿主生物體從其天然狀態被遺傳轉化成生產該肽時，在生物體中產生的。可采用化學合成的方法制得本發明的合成肽，這些方法對于本領域普通的技術人員來說是周知的。因此，可采用具有t-Boc或F-moc化學的固相合成的自動Merrifield技術，在肽合成儀(如，應用生物系統肽合成儀，AppliedBiosystems Peptide Synthesizer)上合成合成肽。
或者，可采用已知的重組DNA技術合成較長的肽。關于NDA技術的任何標準手冊都提供了詳細的生產本發明合成肽的方案。為了構建編碼本發明合成肽的核苷酸序列，將氨基酸序列反轉錄到核酸序列中，并且較佳是在表達該肽的生物體中使用最佳的密碼子用法。接著，制備合成基因，通常通過合成重疊寡核苷酸進行，該核苷酸編碼該肽，并且如果需要，該核苷酸還可編碼任何調節元件。將該合成基因插入合適的克隆載體中，獲得重組克隆，并將其表征。然后在適合于選擇的表達系統和宿主的合適條件下表達本發明的合成肽，采用標準方法純化所需的肽，并將其表征。
也可從耶爾森氏菌屬的侵染素蛋白獲得可與本發明的合成性非淀粉狀蛋白源性肽交聯的免疫刺激性肽。致病菌耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)的侵染素是介導該細菌進入哺乳動物細胞的外膜蛋白(Isberg等，1990)。已證明，該菌要侵入培育的哺乳動物細胞需要耶爾森氏菌屬侵染素分子和該培育細胞上存在的整聯蛋白β1族的幾個種類之間的相互作用(Tran Van Nhieu等，1991)。由于T淋巴細胞富含β1整聯蛋白(尤其是激活的免疫或記憶T細胞)，已對人T細胞上的侵染素的影響進行了研究(Brett等，1993)。據認為，整聯蛋白通過與細胞外的基質蛋白(包括纖連蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白)相互作用，促進免疫T細胞移出血管，通過結締組織到達抗原激發的位點。已發現，侵染素分子的羧基末端非特異性促分裂原——抗-CD3抗體存在的對天然的人CD4+是共刺激性的，引起了細胞因子的明顯增殖和表達。也已鑒別了與β1整聯蛋白相互作用以引起這種刺激的特異性侵染素區域(Brett等，1993)。因為證明與這個區域有關的T細胞共刺激特征的緣故，所以可將它與本發明的合成肽交聯，以增強免疫原性。
革蘭氏陰性菌的許多外膜蛋白是被脂質修飾的，并且是非常免疫原性的。因為共價脂質鍵與免疫原性之間有明顯的相關性，所以一種為細胞的膜蛋白所共有的脂質——三棕櫚酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)可與共軛物中的合成肽結合，這樣也可以增強免疫原性。
如果該合成肽與佐劑共給予，則免疫原性還可明顯得到改進。佐劑增強抗原的免疫原性，但它們自身不一定是免疫原性的。佐劑可使抗原局部滯留在接近給藥位點的地方，以對免疫系統的細胞產生促進緩慢的、持續釋放抗原的儲存效果(depot effect)，由此而起作用。佐劑還可吸引免疫系統中的細胞到抗原儲存中，刺激這些細胞引起免疫反應。
為改善針對如疫苗的宿主免疫系統應答，免疫刺激劑或佐劑已使用許多年了。內源性佐劑，如脂多糖，通常是滅活的或減弱的細菌(如疫苗)的成分已使用。外源性佐劑是免疫調節劑，它們通常共價連接于抗原，并被配制以增強宿主免疫反應。因此，已鑒定佐劑可增強針對腸道外傳送的抗體的免疫反應。但是，這些佐劑中有一些是毒性的，并可引起不良的副作用，使得它們不適用于人和許多動物。實際上，在人和脊椎動物疫苗中，僅有氫氧化鋁和磷酸鋁(通稱為明礬)常用作佐劑。已很好確定了明礬在增加抗體針對白喉類毒素和破傷風類毒素中的的功效，并且HbsAg疫苗也已經用明礬作佐劑。
各種各樣的外源性佐劑可引起針對抗原的有力的免疫反應。這些佐劑包括與膜蛋白抗原結合的皂苷(免疫刺激復合物)、具有礦物油的普朗尼克(pluronic)普朗尼克系聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物]聚合物、礦物油中的滅活的分枝桿菌、完全弗氏佐劑、細菌產物〔如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)〕，以及脂質A和脂質體。為了有效地誘導體液免疫應答(HIR)和細胞介導的免疫(CMI)，由佐劑將免疫原乳化。許多佐劑是毒性的，它們誘導肉芽瘤、急性和慢性炎癥(完全弗氏佐劑，FCA)、細胞裂解(皂苷和普朗尼克聚合物)以及致熱原性關節炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)。雖然FCA是優異的佐劑，并在研究中廣泛使用，但是它并未得到在人或脊椎動物中使用的許可，因為它具有毒性。
美國專利第4,855,283號描述了用糖脂類似物作為免疫調節劑或佐劑，這些類似物包括N-糖基酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，每種類似物在糖殘基中被氨基酸取代。美國專利第4,258,029號描述了鹽酸十八烷基酪氨酸(OTH)當與破傷風類毒素結合以及福爾馬林滅活的I、II和III型小兒麻痹癥病毒疫苗時，將其用作佐劑的功能。還有，Nixon-George等在1990年報道，與重組B型肝炎病毒表面抗原結合的芳族氨基酸的十八烷基酯增強了針對B型肝炎病毒的宿主免疫反應。
加入使針對Aβ肽和淀粉樣蛋白沉積物的免疫反應增加到最大的外源佐劑/乳液制劑是優選的。合適的佐劑和載體是(1)已被成功地用于人I期試驗的佐劑和載體；(2)基于其在臨床前安全研究中缺乏反應原性，而具有在人中許可使用的潛力的佐劑和載體；(3)已被許可用于食物和伴生動物的佐劑和載體。Aguado等(1999)報道了目前正在進行臨床試驗的一些佐劑。
非常需要在給予最少量的劑量(理想的是僅給予1劑量)后產生最大的免疫反應的免疫治療方案。這一結果可通過在微粒中俘獲免疫原而獲得。例如，可吸收的縫合材料聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物可被制作到含有免疫原的微粒中。在口服或腸道外給藥后，微粒在體內水解，產生無毒性副產物乳酸和羥基乙酸，并釋放出免疫原，該免疫原在俘獲過程中基本上未改變。被俘獲的免疫原的微粒降解和釋放速率可由幾個參數控制，包括(1)用于微粒形成的聚合物的速率(具有較高的共-乙交酯濃度等級的顆粒更快)；(2)顆粒大小(越小的顆粒降解越快)；(3)俘獲效率(具有較高濃度的俘獲抗原的顆粒比具有較低負載的顆粒降解快)。微粒制劑還可通過混合具有不同的釋放速率的俘獲免疫原的微粒，以一次給藥的方式提供主要的和隨后的免疫加強。可易于獲得在小于1周到大于6個月的時間內能釋放抗原的單劑量制劑。而且，當將微粒化的抗原與外源制劑/乳化制劑混合時，被俘獲在微粒中的本發明合成肽的傳送也可提供改進的功效。
使用在明礬中配制的合成肽注射動物，如小鼠或大鼠，然后接著對淀粉狀蛋白β肽進行免疫反應，可建立和分析合成肽的功效。
本發明的另一方面提供免疫組合物，它包括免疫有效量的一種或多種本發明的合成肽，或其共軛物，以及藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或助劑(包括佐劑)。因此，可使用佐劑、藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、助劑或通常在免疫組合物中提供的其它成分將合成肽或其共軛物配制成免疫組合物。本領域普通的技術人員易于測定這些制劑，它們包括即釋制劑和緩釋制劑，如微膠囊化。可以常規的途徑給予本發明的免疫組合物，包括皮下、口服、肌肉內或其它腸胃外或腸途徑。類似地，可以單劑量的方式給予疫苗，或將其分成多劑量再給予。本領域普通的技術人員易于確定免疫方案。例如，可用本發明中的佐劑或乳劑包括明礬、完全弗氏佐劑、靜脈脂肪乳劑、皂苷、鯊烯、L121、乳化原(emulsigen)和ISA720。在優選實施例中，佐劑/乳劑是明礬、不完全弗氏佐劑、靜脈脂肪乳劑和皂苷的組合、鯊烯與L121的組合，或者乳化原與皂苷的組合。
本發明的免疫組合物含有免疫有效量的一種或多種合成肽或其共軛物以及藥學上可接受的載體。劑量單位形式的這些組合物可含有每千克體重約0.5μg到約1mg的各肽或其共軛物。當以多劑量傳送時，通常將劑量單位形式分成每劑量適當的量。
含有兩種或多種本發明合成肽或其共軛物的混合物的免疫組合物在較寬范圍的人群中增強了免疫效力，從而提供針對淀粉狀蛋白β肽和淀粉狀蛋白沉積物的較好的免疫反應。通過對脂肽進行修改，以便給有力的疫苗提供嵌入式佐劑性，從而可獲得其它的免疫刺激性合成肽免疫原。使本發明合成肽免疫原俘獲在Hagan等(1991)所述類型的生物可降解微粒之內或之上，可改進針對它們的免疫反應。可在佐劑存在與不存在的情況下將免疫原包囊化，包括共價地連接于脂質部分如Pam3Cys，這些微粒可與免疫刺激性佐劑如弗氏不完全佐劑或明礬一起給予。對于口服以及局部給藥，這些微粒起到加強針對免疫原的免疫反應并提供時間控制型的持續或周期性釋放的作用(O′Hagan等，1991)。
本發明的另一方面是一種用本發明的合成肽或其共軛物進行免疫的方法。本發明方法涉及向需要的哺乳動物(優選是人)給予含有合成肽或其共軛物的免疫組合物。首先在AD的轉基因動物模型中測試功效，如Schenk等(1999)使用的小鼠模型，或其它公眾的或市售的AD轉基因小鼠模型。
本發明的又一方面提供針對本發明的免疫源性肽而產生的抗體和包括這些抗體的抗原結合部分的分子。
應理解，當術語“抗體”用在本發明的抗體實施例中時，它包括完整的抗體，如多克隆抗體或單克隆抗體(mAb)，以及其蛋白水解的片段，如Fab或F(ab′)2片段。此外，可將編碼抗體的可變區的DNA插入其它的抗體中，以產生嵌合抗體(例如，可參見美國專利第4,816,567號)，或者將其插入T細胞受體中，以產生具有一樣寬的特異性的T細胞(參見Eshhar等，1990；Gross等，1989)。也可產生和使用單鏈抗體。單鏈抗體可以是具有抗原結合能力的單鏈復合多肽，含有與免疫球蛋白的輕鏈或重鏈(連接的VH-VL或單一的FV鏈)同源的或類似的一對氨基酸序列。VH和VL都可模仿天然的單克隆抗體序列，或者一條或兩條鏈可含有美國專利第5,091,513號所述類型的CDR-FR構建物(本文將該專利的全部內容納入作為參考)。與輕鏈和重鏈的可變區類似的分離的多肽被多肽連接物維持在一起。根據如美國專利第4,946,778號和第5,091,513號和第5,096,815號中所述的方法，可生產這些單鏈抗體，尤其是其中編碼VH和VL鏈的多肽結構的DNA是已知的，本文將這些文獻的全部內容納入作為參考。
如果一種抗體能特異性地與分子反應，從而使該分子與該抗體結合，則我們認為該抗體“能結合”分子。術語“表位”指能被抗體結合也可被該抗體識別的任何分子的部分。表位或者“抗原決定簇”通常由分子的化學活性表面基團如氨基酸或糖側鏈組成，它們具有特殊的三維結構特征，以及特殊的電荷特征。
多克隆抗體是從用抗原免疫的動物血清中得到的抗體分子的異源種群。
單克隆抗體(mAb)是針對特殊抗原的一類基本上同源的抗體。可采用本領域熟練的技術人員已知的方法獲得mAb。例如，可參見Kohler等(1975)；美國專利第4,376,110號；Harlow等(1988)；Colligan等(1993)，本文將這些文獻的全部內容納入作為參考。這些抗體可以是任何免疫球蛋白種類，包括IgG、IgM、IgE、IgA及其任何亞類。可在體外或體內培育產生本發明的mAb的雜交瘤。通過體內生產可獲得高效價的mAb，生產方法如下在從單獨的雜交瘤得到的細胞被腹膜內注射到降植烷-灌注的Balb/c小鼠中，以產生含有高濃度的所需mAb的腹水。可采用本領域熟練的技術人員周知的柱色譜法技術，從腹水中或者從培養物上清液中純化同種型IgM或IgG的mAb。
嵌合抗體是分子，其不同部分從不同的動物種類獲得，如那些具有鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恒定區的抗體。嵌合抗體主要用于減少應用過程中的免疫原性，并增加產率，例如，鼠的mAb可從雜交瘤中以較高產率產生，但是它對人具有較高的免疫原性，這樣可使用人/鼠嵌合或人源化mAb。嵌合抗體和人源化抗體和它們的生產方法在本領域中是周知的，如Cabilly等，1984；Morrison等，1984；Boulianne等，1984；Cabilly等，1984；Neuberger等，1985；Taniguchi等，1985；Morrison等，1986；Neuberger等，1986；Kudo等，1986；Morrison等，1986；Sahagan等，1986；Robinson等，1987；Liu等，1987；Sun等，1987；Better等1988；以及Harlow等，1988。本文將這些文獻納入作為參考。
“包括抗體的抗原結合部分的分子”不僅包括任何同種型和任何動物細胞系或微生物產生的完整免疫球蛋白分子，而且還包括其結合抗原的反應性部分，包括但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、其重鏈和/或輕鏈的可變部分、加入這些反應性部分的嵌合抗體或單鏈抗體，以及這種抗體反應性部分已用物理方法插入其它任何類型的分子或細胞中，如嵌合T細胞受體或具有這種受體的T細胞，或者開發成借助于含這種反應性部分的分子部分傳送治療部分的分子。可采用任何已知的方法提供這種分子，包括但不限于酶裂解、肽合成或重組技術。
本發明還提供一種藥物組合物，該組合物含有一種分子和藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑，該分子包含針對本發明的肽產生的抗體的抗原結合部分。本領域熟練的技術人員僅采用常規的實驗即可開發藥物組合物的制劑，非常熟練的技術人員按常規使用這種制劑，并且其組合物適用于其所設想的用途，即用作減少淀粉狀蛋白原纖維和沉積物的形成的治療劑。
根據本發明，可將包含針對本發明的免疫原肽產生的抗體的抗原結合部分的分子給予需要的受試者，以減少淀粉狀蛋白原纖維和沉積物的形成。給藥的位點、劑量和給藥方案根據本領域熟練的技術人員采用的已很好確立的方法確定。
上面已經對本發明作了概述，參考下面的實施例將更易于理解這些內容，這些實施例僅僅是闡述性的，并不是對本發明作出限制。
實施例1本實施例的實驗證明，用非淀粉狀蛋白源性、無毒性Aβ同源肽免疫轉基因APP小鼠(Tg2576)7個月，可分別減少皮層和海馬中大腦淀粉狀蛋白負荷的89％(p＝0.0002)和81％(p＝0.0001)。同時，大腦中可溶的Aβ1-42的水平減少了57％(p＝0.0019)。表達與Aβ斑有關的白介素-1β的分枝的小膠質細胞在經免疫的小鼠中缺乏，這說明這些動物中炎癥減少了。在本實施例中使用的材料和方法以及試驗結果如下。材料和方法肽如先前所述(Sigurdsson等，2000)，在Keck Foundation(耶魯大學，New Haven，CT)上合成所使用的肽〔Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO1)和K6Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO6)〕。使用固相tBOC(N-叔丁氧羰基)合成本發明的非淀粉狀蛋白源性肽，采用HPLC純化，然后采用HPLC和激光吸附質譜法表征。
用于免疫的肽K6Aβ1-30-NH2保留了Aβ肽的兩個主要的免疫原性位點，即基于Jameson等(1998)的抗原性指數和本發明者在實驗室中獲得的初步結果的Aβ1-42的第1-11個殘基和第22-28個殘基。Aβ1-30-NH2和K6Aβ1-30-NH2肽的C末端被酰胺化，以進一步保護它們的抗原性。次級結構研究如先前所述(Soto等，1998；和Soto等，1996)，采用圓二色性(CD)評估這些肽的次級結構(α-螺旋、β-折疊和隨機螺旋)。結果以摩爾橢圓率表示，單位為度·cm2/dmol，采用Lincomb和CCA算法(Perczel等，1992)分析數據，以獲得不同類型的次級結構的百分比。
雖然采用圓二色性(CD)對合成肽的次級結構進行評估，但是也可使用Aucouturier等(1999)已發表的方案，采用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)進行評估。雖然CD對骨架構象敏感，而FTIR對酰胺基的氫鍵(這是其結構的附屬)的程度和強度敏感，但這兩種技術最終都給出類似的信息不同次級結構基元(即α-螺旋、β-折疊、β-轉角和隨機螺旋)的百分比(Surewicz等，1993)。CD是一種已經很好建立的研究溶液中蛋白質和肽的次級結構的技術，它能對不同的結構基元含量作出相當準確的估計。研究結構特征的FTIR的主要優點是它不依賴于樣品的物理狀態。樣品可以水溶液或有機溶液、水合膜、不均勻分散液、聚集材料甚或固態蛋白質的形式進行檢測。因此，CD和FTIR對于研究肽的次級結構來說是互補的。
根據Golabek等(1996)和Soto等(1996和1998)所述進行圓二色性的實驗過程，其步驟如下在25℃，在Jasco J-720分光偏振計中，使用具有雙蒸餾去離子水和TFE(光譜學用等級)作為溶劑的0.1cm通徑長度的孔，記錄含有合成肽的溶液(1-5μM于300μl 10mM磷酸鈉，pH7.2)的CD光譜。用d-(+)-10-樟腦磺酸的水溶液校準儀器。在180-260nm的波長范圍內，以1nm的間隔記錄光譜，然后減去在相同條件下獲得的緩沖液光譜。
Aucouturier等(1999)的傅立葉變換紅外光譜法的試驗過程如下在中性pH的H2O和D2O緩沖液中制備含有可溶的或聚集的合成肽的溶液或懸浮液(5-10mg/ml)，然后將10μl加到具有CaF2板和6μm通徑長度間隔的紅外孔中。如先前所述(Aucuturier等，1999；Soto等，1995)，在25℃用Perkin Elmer 2000型FTIR分光光度計記錄光譜。對于每個光譜，使用2cm-1的分辨率，并在4000-1000cm-1的范圍內以1cm-1的間隔以單束模式收集1000次掃描。平滑和傅立葉自身去褶合(Fourier self-deconvolution)適用于增加酰胺I區域(1700-1600cm-1)中的光譜分辨率，然后進行Lorentzian線形的迭代擬合，以評估各次級結構元素的比例。淀粉狀蛋白原纖維體外形成的研究可采用從本發明者的實驗室獲得的已發表的方案(Castano等，1995；Wisniewski等，1991；Wisniewski等，1993和Wisniewski等，1994)進行淀粉狀蛋白原纖維體外形成的研究。將在0.1M Tris(pH7.4)中制備的濃度為25-250μM的合成肽的等分試樣培育不同的次數，然后將它們的原纖維形成與Aβ1-28、Aβ-1-40和Aβ1-42的相比。在這個實施例中，在0.1M Tris(pH7.4)中制備的肽的等分試樣培育不同的次數，然后將它們的原纖維形成與Aβ1-30-NH2和Aβ1-42的相比。如先前本發明者的實驗室所述(Soto等，1998，和Jameson等，1998)，采用熒光檢測，在硫黃素T產生的熒光發射的基礎上評估體外原纖維生成。硫黃素特異性地與淀粉狀蛋白結合，這種結合導致其發射光譜的轉移，使熒光增強與形成的淀粉狀蛋白的量成比例(LeVine等，1993)。
雖然在本實施例中未進行，但是，也可采用其它3種不同的方法評估體外原纖維生成(A)基于剛果紅與淀粉狀蛋白原纖維的特異性相互作用的分光光度計檢測。在培育期后，將2μl的剛果紅(1.5mg/ml)加到每份樣品中，在暗處培育1小時。然后以15,000rpm離心樣品10分鐘，在490nm測量上清液的吸光度。所形成的淀粉狀蛋白的量與上清液吸光度的減少直接成正比例(Castano等，1986)。
(B)如Soto等(1995)所述使用沉積檢測。簡言之，以15,000rpm離心樣品10分鐘，以分離可溶的和聚集的肽。使用反相Vydac C4柱和3-70％乙腈的線性梯度，采用微內徑HPLC分析溶液中的物質的量。通過比較對應于各培育樣品中的可溶肽的峰面積和非培育樣品的相同對照，評估聚集的肽的百分比。
(C)在陰性染色后采用剛果紅染色和電子顯微術檢測進行原纖維生成的額外表征(Castano等，1995；Wisniewsi等，1991；Wisniewsi等，1993和Wisniewsi等，1994)。對于電子顯微鏡術，將肽的培育樣品放在包涂了碳模型(formar)的300目鎳格柵上，然后在2％戊二醛的蒸氣下用2％乙酸雙氧鈾染色60秒鐘。將格柵放在Zeiss EM 10電子顯微鏡上，在80kV下進行目測。對于剛果紅染色，將培育的肽放到包涂明膠的玻璃顯微鏡載片上，并使其在37℃的空氣中干燥。然后在室溫將該薄片浸入溶解在80％乙醇的用NaCl使其飽和的0.2％剛果紅中60分鐘，用水洗滌3次，然后用偏振光顯微術進行目測。神經毒性使用制造商(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)所述的標準MTT檢測，在第2天和第6天評估K6Aβ1-30-NH2(1-100μM)在人成神經細胞瘤細胞系(SK-H-SH)中潛在的神經毒性。使用Aβ1-30-NH2、Aβ1-40和Aβ1-42作為對照肽。簡言之，以每孔10,000個細胞/100μl培養基將細胞放在96孔平板的平底上進行平板培養。使這些細胞在培養器中粘附在平板上過夜(37℃，5.0％CO2)，然后加入10μl新配制的肽溶液(在毫微級純度的水中)。Aβ1-42僅僅部分溶解在100μM范圍內，因此，在這個濃度作為一種懸浮液加入Aβ1-42。接下來的步驟如試驗方案中所述。動物如Karen Hsiao等(1996)所述，在Tg2576 APP小鼠模型中進行接種。這些小鼠在早在11-13月時就產生Aβ斑。選擇這種模型而不選擇雙Tg APP/PS1模型(Holcomb等，1998)的原因是，在單一Tg APP小鼠中Aβ沉積的開始和發展的年齡更類似于AD。將年齡匹配的載體處理的Tg小鼠和接受K6Aβ1-30-NH2的非Tg同窩初生仔作為對照，這些動物在長到11-13個月時接受第一次注射，此時應已經存在少數斑。每組有4只小鼠。使這些小鼠處于12小時的光-暗循環中，并能隨意獲得食物和水。動物的飼養根據制定的指南進行。
給予疫苗以三氟乙酸(TFA)鹽的形式提供K6Aβ1-30-NH2。如Schenk等(1999)先前所述進行免疫過程，但是肽在注射前不放在37℃培育過夜。簡言之，將肽以2mg/ml的濃度溶解在PBS中，然后將其以1∶1的體積比與佐劑或PBS混合。將完全弗氏佐劑用于第一次注射，接下來的3次注射用弗氏不完全佐劑，從第5次注射開始使用PBS。小鼠接受100μl混合物(即，100μg/100μl)的皮下注射，接著在2周后進行第二次注射，之后每月注射一次。
抗體效價如先前所述(Jimenez-Huete等，1998)，采用ELISA檢測通過血清的系列稀釋測定抗體的效價，其中Aβ或其衍生物被包涂在微滴定孔上。以四甲基聯苯胺(Pierce，Rockford，IL)為底物，使用連接于辣根過氧化物酶(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的山羊抗-小鼠IgG檢測效價，效價定義為產生50％的最大信號的稀釋度。
組織學用戊巴比妥鈉(150mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，經主動脈灌注磷酸鹽緩沖液，然后如先前所述處理大腦(Sigurdsson等，1996)。將右半球浸入高碘酸鹽-賴氨酸-低聚甲醛中，使其固定，而使左半球快速冷凍，以用于采用已建立的ELISA法測量Aβ水平(Metha等，1998和Metha等，2000)。切下連續的皮層切片(40μm)，將5片0.2mm間隔的切片保存用于1)6E10；2)剛果紅；3)白介素1β/OX42/番茄外源凝集素；4)GFAP和5)甲酚紫染色切片的組織學分析。6E10識別Aβ，并對前淀粉狀蛋白和Aβ斑都染色(Kim等，1990)。進行剛果紅染色，以鑒別這些動物中的淀粉狀蛋白病灶。GFAP是形成部分細胞骨架的神經膠質中間絲的成分，它在星形細胞中占優。小神經膠質細胞似乎是CNS中自介素-1(IL-1)的主要來源(Schobitz等，1994)，OX-42識別小神經膠質細胞上的CD11b，CD11b是大鼠等價于人C3bi受體的受體(Robinson等，1986)。番茄外源凝集素與聚-N乙酰基乳糖胺殘基結合，并對小神經膠質細胞具有神經組織特異性親和力(Acarin等，1994)。星形細胞和小神經膠質細胞都與Aβ的沉積有關。用甲酚紫染色，以測定免疫是否引起這些動物的神經元收縮和/或細胞損失。制成切片后，將這些切片放在乙二醇防凍劑中，并放在-20℃保存備用。
甲酚紫和剛果紅使固定的切片在二甲苯中脫脂，并在一系列梯度的乙二醇和水中水合。如先前所述(Sigurdsson等，1996和1997；Soto等，1998)染色。
6E10、GFAP、IL-1β和OX-42如先前所述染色(Sigurdsson等，1996和1997；Soto等，1998)。簡言之，將切片放在6E10中培育(有基礎研究機構Richard Kascsak提供)，6E10是以1∶1000的稀釋度與人的Aβ選擇性結合的主要抗體。使用小鼠免疫檢測盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中的小鼠，其中以1∶2000的稀釋度使用抗-小鼠IgG次級抗體。以與6E10染色相同的方式進行GFAP(1∶500，Dako，Denmark)、IL-1β(1∶250，Endogen，Rockford，IL)和OX-42(1∶250，BiosourseInt.，Camarillo，CA)染色，但次級抗體被稀釋為1∶1300。在有或沒有硫酸銨鎳(Ni)強化的情況下，使切片在3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)中反應。對于IL-1β和Aβ斑的雙重標記，首先將切片中的IL-1β染色(DAB/Ni，黑色)，其中過氧化物酶是酶。然后用Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I(Vector)將斑(6E10)染色。
番茄外源凝集素從防凍劑中取出切片，將其放在PBS、0.3％Triton-X-100在PBS(PBS-TX)中的溶液中洗滌，然后在0.3％過氧化氫在PBS中的溶液培育30分鐘，以中止內源的過氧化物酶活性。與番茄外源凝集素(10μg/ml PBS，Vector)培育2小時后，在PBS-Tx中洗滌切片，然后使其與抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(Vector)反應1小時。接下來的步驟與抗體染色中的相同。
圖像分析使用Bioquant圖像分析系統量化組織切片的免疫組織化學，并使用無偏取樣的方法(West等，1999)。所有的操作都是由對研究的試驗條件一無所知的人進行。所分析的皮層區域是具帶皮層的背中線，并且沿著腹側延伸到右半球的嗅裂中。格柵的面積是800×800μm2，隨機地在每只小鼠10個框架中選擇測量淀粉狀蛋白負荷(各自為640×480μm2)。以與皮層分析類似的方式在整個海馬上進行海馬測量。Aβ負荷定義為反應產物占據測量領域的面積百分比。
可溶的Aβ水平的夾心型ELISA檢測在從大腦組織中抽提出Aβ之前，先在組織均漿緩沖液(20mM Tris pH7.4，250mM蔗糖，1mM EDTA，1mM EGTA)中制備10％(w/v)的勻漿液。在使用前，立即將1/100體積的100mM苯基甲基磺酰氟原液(在乙醇中)和1/1000體積的LAP(每ml的N-N-二甲基甲酰胺5mg的各亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶和胃酶抑制劑Aβ)加到該均漿緩沖液中。然后使上述勻漿液徹底地與等體積的0.4％二乙胺/100mM NaCl混合，然后在4℃以135,000×g旋轉1小時，接著用1/10體積的0.5M Tris(pH6.8)中和。然后將樣品等分，在干冰上使其迅速冷凍，放在-80℃保存，直到將其加到平板上為止。使用單克隆抗體6E10(對Aβ第1-16個氨基酸殘基上的表位特異)、兔抗血清R162(對Aβ40特異)和兔抗血清165(對Aβ42特異)，進行先前所述的雙抗體夾心ELISA(Mehta等，1998和2000)，測量左半球中可溶的Aβ水平。在微ELISA讀數器中讀取450nm的光密度(OD)。采用4種參數邏輯對數函數確定OD和Aβ40或Aβ42之間的關系。使用KlinetiCalc程序(Biotek Instruments，Inc.Winooski，VT)進行非線性曲線擬合，以將血漿的OD轉化成估計的濃度。給所有的樣品編號，研究者對于組排列是未知的，直到測量和記錄水平后。對于Aβ40和Aβ42試驗的檢測限度是10pg/ml。變化的百分比系數通常為8-14％(試驗之間)和10-18％(試驗之內)。
數據分析采用單路ANOVA分析細胞培養數據，接著進行Dunnett測試，以進行之后分析(GraphPad Prism 3.0)。使用無偏體視學圖像分析系統(Bioquant，R&M Biometrics Inc.，Nashville，TN)來測定6E10染色的大腦切片中淀粉狀蛋白負荷。采用雙尾“學生”t-檢驗分析淀粉狀蛋白負荷的數據和大腦中可溶的Aβ的水平。結果在進行接種研究前，有必要先確認原型肽KKKKKK-Aβ1-30-NH2與Aβ1-42相比，確實有較少的β-折疊結構、減少的原纖維形成，并且它對神經元培養物是無毒性的。采用圓二色性測定這些肽的次級結構，采用硫黃素-T熒光測定法檢測它們形成淀粉狀蛋白原纖維的能力。額外的對照肽是Aβ1-30-NH2。
CD檢測與β-折疊含量低的化合物相比，β-折疊含量高的化合物更具有毒性，更有可能形成原纖維(Pike等，1991)。在其N末端具有多賴氨酸的肽含β-折疊的量比酰胺化的Aβ1-30或Aβ1-42少得多(表1)。
(K)6-Aβ1-30-NH2肽在37℃培育至少15天后也不形成原纖維。這個數據清楚表明，在N末端加入多賴氨酸改變了該肽，使得其β-折疊含量比Aβ1-42或Aβ1-30少得多。此外，(K)6-Aβ1-30-NH2肽的β-折疊含量不隨著時間而增加。在96小時后，Aβ1-42的β-折疊含量增加到55％，而(K)6-Aβ1-30-NH2的β-折疊含量仍維持在16-18％。
表1

硫磺素T檢測在t＝0時Aβ1-42已經是原纖維的，而Aβ1-30-NH2則隨著時間逐漸形成原纖維(圖1)。Aβ1-30-NH2和Aβ1-42的較高程度的硫黃素T染色6天后的結果顯示了已知的Aβ肽原纖維形成的逐批易變性(Soto等，1995)，以及Aβ1-42在長時間培育中一定程度的球粒形成。K6Aβ1-30-NH2在37℃培育至少15天后沒有形成原纖維。
神經毒性為了進一步評價這種接種方法的安全性，測定了K6Aβ1-30-NH2的神經毒性。采用MTT檢測發現，與載體組相比，在第2天，K6Aβ1-30-NH2對細胞生存沒有影響，在第6天有輕微的營養性(p＜0.05)，而Aβ1-40和Aβ1-42則對人成神經細胞瘤細胞(SK-N-SH)有毒性(p＜0.05-0.001)(圖2A和2B)。在培育過程中，用顯微鏡觀察到僅在含有Aβ1-42(10-100μM)的培養物孔中有聚集物。
抗體效價給Tg2576及其非Tg同窩出生者接種K6Aβ1-30-NH2或載體。幾乎所有的小鼠發展了針對免疫原(K6Aβ1-30-NH2)的抗體，這些抗體與Aβ1-40和Aβ1-42交叉反應。其定義為產生50％的最大信號的稀釋度的效價范圍是幾百到幾千(未給數據)。用佐劑注射載體處理的動物，結果發現PBS沒有發展針對這些3種肽的抗體(未給數據)。非轉基因小鼠針對所有3種肽的效價普遍較高，并且與Aβ1-40和Aβ1-42相比，多克隆抗體對免疫原具有較高的抗體親抗原性。這些發現與預期的一樣，因為該免疫原是以人的Aβ序列為基礎，該序列與小鼠的Aβ有3個氨基酸不同(Johnstone等，1991)，且引起免疫反應的K6Aβ1-30-NH2與完整的Aβ肽相比，應對抗體具有更多的結合基元。
淀粉狀蛋白負荷和相關的組織病理學在治療7個月后，將18-20月大的小鼠處死，如先前所述(Sigurdsson等，1996)處理它們的大腦右半球用于組織學研究。用甲酚紫、剛果紅、番茄外源凝集素以及針對1)人Aβ(6E10)、小神經膠質細胞(OX-42，IL-1β)以及GFAP(抗-GFAP)的抗體染色大腦切片。用K6Aβ1-30-NH2接種后，采用體視學技術進行檢測，結果發現Tg小鼠大腦皮層和海馬中的淀粉狀蛋白負荷分別減少89％和81％(圖3A、3B；4A、4B)。經免疫的動物中剛果紅陽性淀粉狀蛋白沉積物的總量減少，但是，剛果紅陰性的Aβ-免疫反應性損害的百分比似乎仍與非免疫的Tg小鼠中的一樣。淀粉狀蛋白沉積物的清除率似乎與其它大腦區域類似。用從其抗體效價為0到3千的幾只免疫小鼠和對照小鼠獲得的血清給高淀粉狀蛋白負荷的對照小鼠和淀粉狀蛋白負荷減少的免疫小鼠的選擇的大腦切片染色。如預期的那樣，隨著效價的增加，更多的斑被染色，其模式在兩類小鼠中相似(未給數據)。在甲酚紫染色中Tg處理組之間沒有明顯的差異。觀察到與所有的淀粉狀蛋白斑相關的反應性星形細胞。由于載體處理的Tg小鼠具有較高的斑負荷，它們比免疫Tg小鼠有更多的星形細胞簇。主要觀察到分支的而非吞噬的(阿米巴)小神經膠質細胞的OX-42染色與斑相關。為了證實小神經膠質吞噬細胞的缺乏并不是由于OX-42的結合基元CD11b受體(Robinson等，1986)下調的緣故，用番茄外源凝集素給所有處理組的切片染色。這種具體的外源凝集素與聚-N-乙酰基乳糖胺殘基結合，該殘基除了在內皮細胞和室管膜細胞中發現外(Acarin等，1994)，還主要在分支和吞噬細胞的小神經膠質細胞中發現。后面這兩類細胞在所有的小鼠中被染色。小神經膠質細胞的外源凝集素染色與OX-42染色類似。換言之，在免疫Tg組和對照Tg組中，小神經膠質細胞并不具有吞噬細胞的形態學，并且免疫小鼠和未免疫小鼠之間的每個斑擁有的分支小神經膠質細胞的數量似乎類似(未給數據)。另一方面，在對照Tg小鼠中，分支小神經膠質細胞的IL-1β染色在Aβ斑周圍顯得很突出(圖3C)，而實際上在免疫小鼠中沒有觀察到IL-1β染色(圖3D)。值得注意的是，K6Aβ1-30-NH2處理的小鼠的蘇木精/曙紅染色的腎切片中沒有腎小球性腎炎的征兆，這表明小鼠沒有發展自身免疫疾病。
ELISA檢測可溶的Aβ在右半球用于組織學研究的小鼠的左半球上進行可溶的Aβ水平的測量。用K6Aβ1-30-NH2接種7個月后，與對照組相比，可溶的Aβ1-42減少了57％(p＝0.0019)(圖4C)。雖然在K6Aβ1-30處理組中存在可溶的總Aβ和Aβ1-40的水平減少的傾向，但是這些數值與載體組并沒有有明顯的不同。
總之，用非淀粉狀蛋白源性/無毒性(β-折疊含量低)的Aβ同源肽免疫Tg APP小鼠，結果得到與Schenk等(1999)觀察到的淀粉狀蛋白負荷的類似的減少，在Schenk等的觀察中，他們使用了原纖維/毒性(β-折疊含量高)的Aβ1-42。討論這些發現證明，Aβ聚集物/原纖維對于引起清除Aβ斑的足夠的免疫反應并不是必需的。非原纖維/無毒性Aβ同源肽，如K6Aβ1-30-NH2，是人用的安全接種方法。
并不完全理解接種引起大腦淀粉狀蛋白負荷減少的機制。但是，以Bard等(2000)的被動接種研究為基礎，抗體很有可能起了關鍵的作用。有趣的是，他們證明抗體效力與可溶的Aβ或和聚集的合成Aβ肽的結合的親和力無關。但是，有效的抗體能結合未固定的大腦切片中的斑。Janus等(2000)采用Schenk等(1999)的相同方案觀察到，Aβ免疫的小鼠的血清優先染色致密的核斑，而不是使Aβ沉積物擴散，這表明抗體可能對β折疊Aβ具有較高的親和力。在這些有些矛盾的發現的基礎上，需要對Aβ-抗體相互作用進行更多的研究，這才有可能對抗體介導的Aβ清除的機制有更深入的理解。這些抗體不太可能影響Aβ的產生，因為他們不識別APP(Weiner等，2000)。抗體通過抗體與Aβ斑結合后的小神經膠質細胞激活增強Aβ的清除更有可能(Schenk等，1999，Bard等，2000)。它們的影響也可能部分是由于與大腦中可溶的Aβ結合的緣故，這種結合改變了沉積的Aβ和可溶的Aβ之間的平衡。根據顯示Aβ可來回通過血腦屏障的大量報道(Zlokovic等，1993；Maness等，1994；Martel等，1996；Poduslo等，1997和1999；Mackic等，1998；Shibata等，2000和Ji等，2001)，接種效果可能部分由抗體與外周液體中的可溶Aβ結合所介導。隨后的外周Aβ水平的減少可改變CNS之內和之外中發現的Aβ的平衡，這可能導致Aβ從CNS流出。最近的報道顯示，在Tg2576小鼠中，Aβ的血漿水平隨著大腦斑負荷的增加而減少(Kawarabayashi等，2001)。這表明可操縱這兩個室之間的相互作用。
有趣的是，在Morgan等(2000)的行為接種研究中，他們觀察到，雖然由免疫組織化學測得的APP/PS1小鼠中大腦淀粉狀蛋白負荷并沒有明顯地減少，但是這些小鼠中出現認識缺乏的部分逆轉。如Morgan等(2000)指出，已提出可溶的Aβ引起APP Tg小鼠的突觸損失，因為一些Tg小鼠系在沒有Aβ沉積物的齒狀回中具有減少的突觸泡蛋白染色(Mucke等，2000)。因此，對于免疫小鼠在沒有減少斑負荷的情況下認識改善的可能解釋是可溶的Aβ的減少，雖然在他們的研究中并沒有估量這種潛在的聯系(Morgan等，2000)。本發明者的實驗室中獲得的結果顯示，在7個月的治療后，淀粉狀蛋白斑負荷減少81-89％與大腦中可溶的Aβ1-42減少57％有關，而在對照組中，可溶的總Aβ與Aβ1-40的減少并沒有明顯的差別。換言之，可溶的Aβ的減少少于斑狀Aβ。但是，必須進行詳細的時程研究，以進一步確定可溶的Aβ和斑狀Aβ之間的平衡變化。這些發現間接證明了Aβ1-42對斑維持的重要性。總之，有可能是幾種不同的機制導致大腦淀粉狀蛋白負荷減少，這取決于動物模型和用于免疫的肽的特性。
大量的研究表明，淀粉狀蛋白沉積可激活大腦中的炎癥級聯反應，如增加與神經元損傷和死亡相關的IL-1產生(Sigurdsson等，1996和Akiyama等，2000)。我們用Aβ同源肽免疫也有可能刺激這種負性的炎癥途徑，以及淀粉狀蛋白的減少。但是，從OX-42免疫反應性或番茄外源凝集素結合所鑒別得到的結果來看，在我們的免疫動物中觀察到少數的吞噬性小神經膠質細胞。這并不令人驚訝，因為在7個月治療后，大多數的斑已經被清除掉。此外，在免疫組小鼠中，實際上小神經膠質細胞的IL-1β染色并不存在，而大量的分支IL-1β陽性小神經膠質細胞則與對照Tg組中的斑相關。本發明者的實驗室先前已報道，大腦淀粉狀蛋白形成的大鼠模型在使用β-折疊斷裂肽治療后，存在類似的沒有IL-1β染色(Sigurdsson等，2000)。但是，在短時間的研究中(16天)，這種效果與吞噬細胞的OX-42染色的強度增加有關，這表明吞噬細胞不表達IL-1β。目前從本實施例試驗得到的觀察可表明，免疫的一個重要效果是減少了大腦中的炎癥。
實施例2材料和方法肽如先前所述(Sigurdsson等，2000)，在Keck Foundation(耶魯大學，New Haven，CT)上合成所使用的肽〔Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH2、K6Aβ1-30-NH2、Aβ1-30-K6(SEQ ID NO11)、Aβ1-30-NH2(EE18，19)(SEQ ID NO12)、Aβ1-30-NH2(DD18，19)(SEQ ID NO13)〕。Aβ同源肽保留了Aβ肽的兩個主要免疫源性位點〔根據Jameson等(1998)以及本發明者的實驗室中獲得的初步結果，這兩個位點為Aβ1-42的第1-11個殘基和第22-28個殘基)，而這些肽卻是非原纖維和無毒性的。淀粉狀蛋白原纖維體外形成和神經毒性的研究如實施例1所述進行試驗。數據分析數據分析采用單路ANOVA分析細胞培養物數據，接著進行Newman Keuls測試，以進行后此分析(GraphPad Prism 3.0)。結果硫黃素T檢測在t＝0時Aβ1-42已經是原纖維的，而Aβ1-30-NH2和Aβ1-40則隨著時間逐漸形成原纖維(圖5)。在37℃培育15天后，Aβ1-30K6稍微有些原纖維產生，但Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)沒有形成原纖維。
神經毒性為了進一步評估這種接種方法的安全性，測定肽的神經毒性(圖6A和6B)。在第2天和第6天觀察處理的效果(p＜0.0001)。采用MTT檢測，發現與載體組相比，對照肽Aβ1-40和Aβ1-42對人的成神經細胞瘤細胞(SK-N-SH)有毒性(p＜0.01-0.001)。K6Aβ-30-NH2在第2天對細胞存活沒有影響，在第6天稍有輕微的營養性(p＜0.001)，最高劑量(100μm)的Aβ1-30K6在兩天后有稍微的毒性，但在第6天沒有。在培育過程中，僅在含有Aβ1-42(10-100μM)的培養物孔中用顯微鏡觀察到聚集物。本發明這些Aβ同源肽不形成原纖維，并且在人神經元培養物中是無毒的。總之，與使用Aβ1-40/42相比，這種方法在人中產生毒性的風險較低。
在充分描述本發明之后，本領域熟練的技術人員將理解，在不偏離本發明的精神和范圍，并且無需進行過多試驗的情況下，在大范圍的等價參數、濃度和條件內可進行相同的試驗。
雖然本發明已結合具體的實施例進行了描述，但是應理解能對本發明作進一步改動。本申請涵蓋任何變動、使用或適用形式，只要它們遵循本發明的原理，并包括在本領域已知或常規的實踐范圍之內且可應用于下文所附的權利要求的范圍內提出的必要技術特征的那些偏離。
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之前對
具體實施例方式
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序列表<110>B.弗朗吉諾(FRANGIONE，Blas)T.維希涅夫斯基(WISNIEWSKI，Thomas)E.M.西于爾茲松(SIGURDSSON，Einar，M.)<120>誘導對β淀粉狀蛋白和淀粉狀蛋白沉積物的免疫反應、與β淀粉狀蛋白同源的免疫源性但非淀粉狀蛋白源性合成肽<130>FRANGIONE-2A PCT<140>未轉讓<141>2001-05-22<150>60/016，233<151>2000-05-22<160>14<170>Patentin version 3.0<210>1<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala20 25 30<210>2<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基7-10如果存在的話，要么一起都是Lys，或者都是Asp，或者都不存在。當殘基7-10存在時，殘基1-6的任一個或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基7-10結合形成長4-10個殘基的N末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>第27-31個氨基酸殘基是LeuValPhePheAla，其中，第27-31個殘基中的一個或兩個被Lys、Asp或Glu替換。C末端Ala殘基可以被酰胺化<400>2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala35 40<210>3<211>70<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基7-10全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。當殘基7-10存在時，氨基酸殘基1-6中的任一個或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基7-10結合形成長4-10個殘基的N末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基27-31和57-61相同，都是LeuValPhePheAla，其中，殘基27-31中的一個或兩個殘基以及殘基57-61中相同的一個或兩個殘基被Lys、Asp或Glu替換。C末端Ala殘基可被酰胺化<400>3Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser35 40 45Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val50 55 60Gly Ser Asn Lys Gly Ala65 70<210>4<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基31-34全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。當殘基31-34存在時，氨基酸殘基35-40中的任一個或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，以與殘基31-34結合形成長4-10個殘基的C末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>第17-21個氨基酸殘基是LeuValPhePheAla，其中，第17-21個殘基中的一個或兩個被Lys、Asp或Glu替換<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>5<211>70<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基61-64全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。當殘基61-64存在時，氨基酸殘基65-70中的任一個或者全部可以是Lys或Asp，與殘基61-64結合形成長4-10個殘基的C末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基17-21和47-51相同，都是LeuValPhePheAla，其中，殘基17-21中的一個或兩個殘基和殘基47-51中的相同的一個或兩個殘基被Lys、Asp或Glu替換<400>5Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala20 25 30Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa
35 40 45Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70<210>6<211>36<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>C末端殘基36可被酰胺化<400>6Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 10 15Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser20 25 30Asn Lys Gly Ala35<210>7<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基1-6可不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基7-10結合形成長4-10個殘基的N末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>C末端Ala殘基可被酰胺化<400>7Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala35 40<210>8<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基35-40可不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基31-34結合形成長4-10個殘基的C末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<400>8Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>9<211>50<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基7-10如果存在的話，要么一起都是Lys，或者都是Asp，或者都不存在。當殘基7-10存在時，殘基1-6的任一個或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，以與殘基7-10結合形成長4-10個殘基的N末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基27-31是LeuValPhePheAla，其中，第27-31個殘基中的一個或兩個被Lys、Asp或Glu替換<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基45-50可不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基41-44結合形成長4-10個殘基的C末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<400>9Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa50<210>10<211>80<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基7-10全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。當殘基7-10存在時，氨基酸殘基1-6中的任一個或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，與殘基7-10結合形成長4-10個殘基的N末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基75-80可不存在，或者以Lys或Asp存在，以與殘基71-74結合形成長4-10個殘基的C末端聚賴氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸殘基27-31和57-61相同，都是LeuValPhePheAla，其中，殘基27-31中的一個或兩個殘基和殘基57-61中相同的一個或兩個殘基被Lys、Asp或Glu替換<400>10Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser35 40 45Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val50 55 60Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80<210>11<211>36<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>11Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Lys Lys20 25 30Lys Lys Lys Lys35<210>12<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>12Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Glu Glu Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala20 25 30<210>13<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>13Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Asp Asp Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala20 25 30<210>14<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>14Leu Pro Phe Phe Asp1 權利要求
1.下式表示的分離的肽(A)m-(N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C)n-(B)p式中，m是0、4、5、6、7、8、9或10；p是0、4、5、6、7、8、9、10；A是Lys或Asp；B是Lys或Asp；n是1或2；N是SEQ ID NO1的第1-16個殘基；C是SEQ ID NO1的第22-30個殘基；Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分別是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有0個、1個或2個殘基被Lys、Asp或Glu替換；當有0個殘基被替換時，m或p之一或兩者不是0(SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)。
2.如權利要求1所述的肽，其特征在于，當m不是0時，p是0；當p不是0時，m是0；Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分別是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有1個或2個殘基被Lys、Asp或Glu替換(SEQ IDNO2-5)。
3.如權利要求2所述的肽，其特征在于，p是0。
4.如權利要求3所述的肽，其特征在于，所述肽的C末端被酰胺化。
5.如權利要求3所述的肽，其特征在于，所述A是Lys。
6.如權利要求3所述的肽，其特征在于，所述A是Asp。
7.如權利要求3所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO2。
8.如權利要求3所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO3。
9.如權利要求2所述的肽，其特征在于，m是0。
10.如權利要求9所述的肽，其特征在于，所述B是Lys。
11.如權利要求9所述的肽，其特征在于，所述B是Asp。
12.如權利要求9所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO4。
13.如權利要求9所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO5。
14.如權利要求1所述的肽，其特征在于，m不是0，p不是0。
15.如權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO7，所述C末端殘基可以被酰胺化。
16.如權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO6，所述C末端殘基可以被酰胺化。
17.如權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQ IDNO8。
18.如權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO9和SEQ ID NO10。
19.如權利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。
20.一種共軛物，它是權利要求1或2的肽與聚合物分子交聯而成。
21.如權利要求20所述的共軛物，其特征在于，所述聚合物分子是含有混雜的T輔助細胞表位的肽。
22.如權利要求21所述的共軛物，其特征在于，所述肽是含有混雜的T輔助細胞表位的肽，所述表位選自破傷風毒素、百日咳毒素、白喉毒素、麻疹病毒、B型肝炎表面抗原、沙眼衣原體主要外膜蛋白、惡性瘧原蟲環子孢子蛋白、曼森氏裂體吸蟲丙糖磷酸異構酶或大腸桿菌TraT。
23.如權利要求20所述的共軛物，其特征在于，所述聚合物選自甘露聚糖、葡聚糖、三棕櫚酰基-5-甘油半胱氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
24.一種免疫組合物，它含有免疫有效量的權利要求1或2所述的分離肽或其共軛物，和藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或助劑。
25.如權利要求24所述的免疫組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的助劑是一種佐劑。
26.如權利要求25所述的免疫組合物，其特征在于，所述佐劑是明礬。
27.一種誘導針對淀粉狀蛋白β肽和淀粉狀蛋白沉積物的免疫反應的方法，它包括向需要的受試者給予權利要求24所述的免疫組合物。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述受試者是人。
29.一種分子，它包含針對權利要求1或2所述的肽產生的抗體的抗原結合部分。
30.如權利要求29所述的分子，其特征在于，所述分子是單克隆抗體。
31.如權利要求29所述的分子，其特征在于，所述分子是嵌合的或人源化的抗體。
32.一種藥物組合物，它含有權利要求29所述的分子和藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑。
33.一種減少淀粉狀蛋白原纖維和沉積物形成的方法，它包括向需要的受試者給予權利要求29所述的分子。
全文摘要
本發明涉及與淀粉狀蛋白β同源的免疫源性但非淀粉狀蛋白源性合成肽，該肽可在用于誘導針對淀粉狀蛋白β肽和淀粉狀蛋白沉積物的免疫反應的免疫組合物中單獨使用，或者與免疫刺激性分子結合。
文檔編號C07K19/00GK1444598SQ01810005
公開日2003年9月24日 申請日期2001年5月22日 優先權日2000年5月22日
發明者B·弗朗吉諾, T·維希涅夫斯基, E·M·西于爾茲松 申請人:紐約大學