本發明涉及一種基于適配體(ti)修(xiu)飾(shi)磁(ci)珠(zhu)和金納(na)米顆粒(li)模擬酶活(huo)性(xing)檢(jian)測卡(ka)那霉素(su)的比色分析方法，屬于分析化學技術領域。

背景技術：

卡那霉素是一種廣譜型氨基糖苷類抗生素，分子式c18h38n4o15s，分子量582.58。卡那霉素主要由灰色鏈霉菌或小單胞菌發酵液中提取或以天然品為原料半合成提取。卡那霉素硫酸鹽作為一種水溶性的抗生素，對許多革蘭氏陰性細菌包括沙門氏菌、肺結核桿菌和某些革蘭氏陽性菌有療效，因其價格低廉，用藥方便，抗菌譜廣，被廣泛用作人畜共用藥，效果優良。在農業，畜牧業，水產業中卡那霉素不僅可以治療各種感染類疾病，同時還可以促進畜禽生長，提高經濟效益。但是不合理使用卡那霉素會導致動物源性食品中卡那霉素的殘留，通過生物循環系統進入人體，引起人體不同程度的損害，伴隨而來的是對公眾健康和環境的潛在危害。各國政府機構根據其經濟發展水平對動物源性食品中抗生素殘留的最大允許殘留限量（mrl）做了明確規定，目前我國規定牛乳中卡那霉素的mrl≤200μg?kg^-1。

傳統的(de)卡那(nei)霉(mei)素殘留(liu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)有微生物(wu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)和(he)儀器檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)，后者包括氣相(xiang)色譜法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（gc）、高(gao)(gao)效液相(xiang)色譜法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（hplc）、液-質聯用(yong)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（hplc-ms）、液相(xiang)色譜-串(chuan)極質譜法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（hplc-ms/ms）、紫外分(fen)光光度計法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（uv）、酶聯免疫分(fen)析(xi)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（elisa）等。微生物(wu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)應(ying)用(yong)較(jiao)為(wei)廣(guang)泛，其(qi)優點是費用(yong)低，一般實驗室(shi)都能操(cao)作，但測(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)時(shi)間長，結果(guo)誤差較(jiao)大，操(cao)作復雜(za)，不能適應(ying)特異性(xing)、定(ding)(ding)量檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)的(de)需求。儀器檢(jian)(jian)驗方法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)是利用(yong)卡那(nei)霉(mei)素結構和(he)理(li)化性(xing)質來進行分(fen)離和(he)定(ding)(ding)性(xing)定(ding)(ding)量測(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)，其(qi)準確性(xing)好(hao)，但往往設(she)備(bei)昂貴，對實驗人員(yuan)也有較(jiao)高(gao)(gao)的(de)要求，對樣品的(de)預處理(li)要求較(jiao)高(gao)(gao)，分(fen)析(xi)費時(shi)而(er)(er)不易推廣(guang)。因而(er)(er)，建立操(cao)作簡單便(bian)攜，特異性(xing)好(hao)，靈敏度高(gao)(gao)的(de)卡那(nei)霉(mei)素檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)，對加強(qiang)動物(wu)源食(shi)品中卡那(nei)霉(mei)素殘留(liu)的(de)監控，保障食(shi)品安全具(ju)有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是(shi)將納米生物催化(hua)、核酸適配體及磁珠(zhu)捕獲等諸(zhu)多(duo)技術的優勢聯合起來，建立一種簡便快速而又具有可視化(hua)特征(zheng)的卡那霉素殘留分析方法。

本發(fa)明的(de)(de)(de)(de)(de)技術方(fang)案，一種基于(yu)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)修(xiu)飾(shi)磁(ci)珠和金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)模擬(ni)酶活(huo)性檢測卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)(de)比色(se)分(fen)析(xi)方(fang)法，在該(gai)方(fang)法體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)系(xi)中(zhong)(zhong)，設計了(le)(le)生物素(su)(su)（biotin）修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序(xu)列和能夠與(yu)(yu)(yu)(yu)其(qi)一端互補(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)探針(zhen)(zhen)cdna序(xu)列。捕(bu)(bu)獲(huo)探針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)有兩個：一是(shi)能夠與(yu)(yu)(yu)(yu)卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序(xu)列通(tong)過(guo)堿基互補(bu)作用(yong)進行結(jie)(jie)合(he)；二是(shi)通(tong)過(guo)5’端修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)巰(qiu)基（-sh）與(yu)(yu)(yu)(yu)金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)結(jie)(jie)合(he)，實現對金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)。具(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)原(yuan)理如下，將巰(qiu)基修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)探針(zhen)(zhen)（cdna-sh）經(jing)過(guo)預處理后(hou)，與(yu)(yu)(yu)(yu)金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)溶液(ye)(ye)混合(he)孵育。因(yin)為金(jin)(jin)能夠與(yu)(yu)(yu)(yu)巰(qiu)基形成(cheng)牢固的(de)(de)(de)(de)(de)au-s共價鍵(jian)，因(yin)此，孵育形成(cheng)了(le)(le)aunps-cdna結(jie)(jie)構(gou)。與(yu)(yu)(yu)(yu)此同時(shi)，將鏈霉親和素(su)(su)(sa)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)磁(ci)珠（mbs）與(yu)(yu)(yu)(yu)生物素(su)(su)化的(de)(de)(de)(de)(de)卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序(xu)列孵育，形成(cheng)mbs-aptamer結(jie)(jie)構(gou)。aunps-cdna與(yu)(yu)(yu)(yu)mbs-aptamer通(tong)過(guo)cdna與(yu)(yu)(yu)(yu)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)堿基互補(bu)作用(yong)而結(jie)(jie)合(he)在一起，形成(cheng)mbs-aptamer-cdna-aunps復(fu)(fu)合(he)結(jie)(jie)構(gou)，從而實現了(le)(le)磁(ci)珠對金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)。當有目(mu)標物卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)存在時(shi)，卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)序(xu)列會優先與(yu)(yu)(yu)(yu)卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)結(jie)(jie)合(he)，而使得適(shi)(shi)配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)與(yu)(yu)(yu)(yu)cdna的(de)(de)(de)(de)(de)互補(bu)雜交破壞，經(jing)過(guo)磁(ci)性分(fen)離后(hou)，金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)被分(fen)離置于(yu)上(shang)清(qing)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)，取上(shang)清(qing)加入相應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)(ying)緩沖(chong)液(ye)(ye)和底(di)物tmb及(ji)(ji)h2o2，在金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)催化下發(fa)生反應(ying)(ying)，溶液(ye)(ye)顏色(se)為藍(lan)色(se)，最(zui)后(hou)用(yong)濃硫酸終(zhong)止(zhi)反應(ying)(ying)后(hou)溶液(ye)(ye)呈現黃(huang)色(se)。當不存在目(mu)標物卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)時(shi)，復(fu)(fu)合(he)結(jie)(jie)構(gou)mbs-aptamer-cdna-aunps仍(reng)然保持現有的(de)(de)(de)(de)(de)狀(zhuang)態，磁(ci)性分(fen)離后(hou)，金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)被保留(liu)在磁(ci)性沉積物中(zhong)(zhong)，即上(shang)清(qing)中(zhong)(zhong)不存在金(jin)(jin)納(na)(na)(na)米(mi)(mi)(mi)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)，加入相應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)(ying)緩沖(chong)液(ye)(ye)和反應(ying)(ying)底(di)物及(ji)(ji)濃硫酸終(zhong)止(zhi)后(hou)，反應(ying)(ying)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)系(xi)不發(fa)生變(bian)色(se)。將反應(ying)(ying)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)系(xi)在分(fen)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)度計上(shang)測定出(chu)450nm處的(de)(de)(de)(de)(de)吸(xi)光(guang)(guang)(guang)度數據對卡(ka)(ka)(ka)那(nei)霉素(su)(su)進行定量分(fen)析(xi)。具(ju)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)原(yuan)理如圖1所示(shi)。

一種基于適配(pei)(pei)體(ti)修(xiu)飾(shi)磁(ci)(ci)(ci)珠(zhu)和(he)金(jin)(jin)納米(mi)顆(ke)粒(li)模(mo)擬酶(mei)(mei)活性檢測(ce)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)(de)比色(se)(se)分(fen)析方(fang)法，包括以下(xia)步(bu)(bu)驟：利(li)(li)用(yong)酪氨酸作為還原(yuan)劑和(he)捕獲劑制(zhi)備具有(you)類(lei)過(guo)氧化(hua)物(wu)(wu)(wu)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)金(jin)(jin)納米(mi)顆(ke)粒(li)模(mo)擬酶(mei)(mei)aunps；采用(yong)與(yu)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)特異(yi)性適配(pei)(pei)體(ti)互(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)捕獲探(tan)針cdna修(xiu)飾(shi)金(jin)(jin)納米(mi)顆(ke)粒(li)獲得(de)功能化(hua)金(jin)(jin)納米(mi)顆(ke)粒(li)aunps-cdna；利(li)(li)用(yong)鏈(lian)霉(mei)親(qin)和(he)素(su)(su)(su)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)磁(ci)(ci)(ci)珠(zhu)和(he)生物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)(su)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)適配(pei)(pei)體(ti)制(zhi)備適配(pei)(pei)體(ti)修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)磁(ci)(ci)(ci)珠(zhu)mbs-aptamer；通過(guo)適配(pei)(pei)體(ti)和(he)cdna的(de)(de)(de)(de)互(hu)補(bu)(bu)雜交制(zhi)備出mbs-aptamer-cdna-aunps復合(he)物(wu)(wu)(wu)；在優(you)化(hua)的(de)(de)(de)(de)反應條(tiao)件下(xia)，將(jiang)含不(bu)同濃度(du)的(de)(de)(de)(de)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)(de)樣品(pin)(pin)與(yu)復合(he)物(wu)(wu)(wu)混合(he)，卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)競爭結(jie)合(he)適配(pei)(pei)體(ti)并釋放(fang)出aunps-cdna；磁(ci)(ci)(ci)性分(fen)離去除磁(ci)(ci)(ci)珠(zhu)和(he)仍結(jie)合(he)在磁(ci)(ci)(ci)珠(zhu)上的(de)(de)(de)(de)aunps后(hou)，往上清液中加入顯色(se)(se)底物(wu)(wu)(wu)，通過(guo)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)測(ce)定繪制(zhi)得(de)到吸光(guang)(guang)度(du)與(yu)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)線性關(guan)系(xi)；以同樣的(de)(de)(de)(de)試(shi)劑和(he)步(bu)(bu)驟對蜂蜜(mi)樣品(pin)(pin)中的(de)(de)(de)(de)卡(ka)(ka)那(nei)(nei)霉(mei)素(su)(su)(su)進(jin)行檢測(ce)。具體(ti)步(bu)(bu)驟如下(xia)：

（1）金納(na)米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)(li)模擬(ni)(ni)酶aunps的制(zhi)備：利用(yong)酪氨(an)酸(suan)(suan)(suan)作為還(huan)原劑和捕獲劑制(zhi)備而(er)成金納(na)米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)(li)模擬(ni)(ni)酶：將含有(you)0.1~0.5mm酪氨(an)酸(suan)(suan)(suan)和0.1~0.5mmkoh的300ml超純(chun)水(shui)溶(rong)(rong)液(ye)煮沸3~5min，立即(ji)加入1.02ml質量體積(ji)(ji)比為1%~3%的氯金酸(suan)(suan)(suan)溶(rong)(rong)液(ye)并在沸水(shui)浴中保(bao)溫5~10min；繼續(xu)在沸水(shui)浴中持續(xu)沸騰至溶(rong)(rong)液(ye)體積(ji)(ji)減少至30ml，得到不同粒(li)(li)徑的金納(na)米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)(li)溶(rong)(rong)液(ye)；將上述金納(na)米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)(li)溶(rong)(rong)液(ye)提前在沸水(shui)中處理過(guo)的截留分子量為12kda的透析(xi)袋中透析(xi)除去多余的koh、金屬離子及(ji)酪氨(an)酸(suan)(suan)(suan)，得金納(na)米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)(li)模擬(ni)(ni)酶aunps，置于4℃冰(bing)箱中保(bao)存備用(yong)；

（2）功(gong)能(neng)化金納米顆(ke)粒（aunps-cdna）的(de)制備(bei)：所有用到的(de)試劑瓶(ping)和ep管都需要用12mnaoh溶(rong)(rong)液(ye)(ye)浸泡(pao)10h以(yi)(yi)上，并用大量(liang)水沖洗。400μl1μmcdna-sh經(jing)過95℃10min，冰浴5min處(chu)理后，再與50μl10mmtcep在室溫下(xia)孵育(yu)1h；將上述混(hun)合(he)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)與5ml金納米顆(ke)粒模擬酶aunps溶(rong)(rong)液(ye)(ye)混(hun)合(he)，在搖床中以(yi)(yi)100rpm、10℃下(xia)震(zhen)蕩2h后，轉移至(zhi)4℃冰箱(xiang)，黑暗靜(jing)(jing)置(zhi)16h以(yi)(yi)上；加入(ru)500mmph8.2的(de)tris-hcl緩沖液(ye)(ye)，直(zhi)至(zhi)tris濃(nong)度為(wei)(wei)5mm；然(ran)后向上述溶(rong)(rong)液(ye)(ye)中逐(zhu)滴加入(ru)400μl1mnacl溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，靜(jing)(jing)置(zhi)5~10min。8000~12000rpm離(li)心8min，以(yi)(yi)除去未(wei)結合(he)的(de)cdna序列（離(li)心后上清若(ruo)為(wei)(wei)紅(hong)色(se)，繼續離(li)心處(chu)理5min），最后用5mmph7.5的(de)pbs緩沖液(ye)(ye)重懸得(de)到功(gong)能(neng)化的(de)金納米顆(ke)粒aunps-cdna，需放置(zhi)在4℃黑暗環境下(xia)，保(bao)存(cun)時(shi)間約為(wei)(wei)2周；

所述(shu)cdna序列為5’-hs-caaaagtcggcttag-3’；

（3）mbs-aptamer-cdna-aunps復合結(jie)構的(de)(de)(de)(de)構建：將磁(ci)(ci)珠瓶(ping)放到漩渦振(zhen)蕩器(qi)(qi)上(shang)振(zhen)蕩20s，重懸修飾有鏈霉親和素(su)的(de)(de)(de)(de)磁(ci)(ci)珠。用(yong)移(yi)液器(qi)(qi)吸取100μl1mg/ml的(de)(de)(de)(de)磁(ci)(ci)珠溶(rong)液轉移(yi)至(zhi)新的(de)(de)(de)(de)離(li)(li)心管中(zhong)。將離(li)(li)心管置于磁(ci)(ci)性(xing)分離(li)(li)器(qi)(qi)上(shang)，靜置1min（此操作(zuo)后(hou)續簡稱為磁(ci)(ci)性(xing)分離(li)(li)），用(yong)移(yi)液器(qi)(qi)吸去(qu)上(shang)清液，從(cong)磁(ci)(ci)性(xing)分離(li)(li)器(qi)(qi)上(shang)取下(xia)(xia)離(li)(li)心管。用(yong)bufferi將磁(ci)(ci)珠稀(xi)釋(shi)至(zhi)濃度為1mm。將50μl1mmsa-mbs與(yu)100μl500mmbiotin-aptamer混合充分振(zhen)蕩（輕微）室溫下(xia)(xia)孵育30min后(hou)，加(jia)入50μl2%（v/v）bsa到磁(ci)(ci)珠溶(rong)液中(zhong)室溫下(xia)(xia)孵育1h，以封閉磁(ci)(ci)珠暴露(lu)的(de)(de)(de)(de)表面防止非特異(yi)性(xing)吸附(fu)的(de)(de)(de)(de)發生(sheng)。磁(ci)(ci)性(xing)分離(li)(li)，去(qu)上(shang)清，用(yong)1×pbsbuffer沖洗(xi)磁(ci)(ci)珠三次，以除去(qu)未(wei)結(jie)合的(de)(de)(de)(de)卡(ka)那霉素(su)適配體aptamer。磁(ci)(ci)性(xing)分離(li)(li)后(hou)，用(yong)200μl1×pbsbuffer復溶(rong)待用(yong)，即為mbs-aptamer；

200μlmbs-aptamer與200μlaunps-cdna室溫(wen)下孵(fu)育30min，后(hou)(hou)經(jing)過磁性分離，用(yong)1×pbsbμffer沖洗磁珠三次(ci)，除去未能(neng)互補雜交的(de)aunps-cdna，最后(hou)(hou)用(yong)2mm、ph5.0的(de)醋(cu)酸(suan)-醋(cu)酸(suan)鈉緩沖液進(jin)行復溶(rong)，形成(cheng)mbs-aptamer-cdna-aunps復合結構，并對此復合結構進(jin)行表(biao)征；

卡那霉素適配體(ti)kanamycinaptamer，簡稱(cheng)aptamer，序列為5’-biotin-tgggggttgaggctaagccga-3’；

（4）卡(ka)那霉素的(de)檢測和(he)(he)標(biao)準(zhun)(zhun)曲線(xian)的(de)繪制:選擇不同(tong)濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)卡(ka)那霉素溶(rong)液，加入到mbs-aptamer-cdna-aunps復合物體(ti)(ti)系中(zhong)，通過(guo)50min置(zhi)換反(fan)(fan)應(ying)(ying)，將(jiang)cdna-aunps從復合結(jie)(jie)構(gou)置(zhi)換下來，其(qi)自身與(yu)aptamer序列形成(cheng)特(te)異結(jie)(jie)構(gou)。通過(guo)磁性分離(li)(li)后，將(jiang)上清(qing)液（含(han)游(you)離(li)(li)的(de)cdna-aunps）取出(chu)轉移至(zhi)另外一支ep管內，加入20μl25~50mmtmb和(he)(he)20μl質量濃(nong)(nong)度(du)(du)3%~5%h2o2，在反(fan)(fan)應(ying)(ying)ph4~6，反(fan)(fan)應(ying)(ying)溫度(du)(du)30~50℃，反(fan)(fan)應(ying)(ying)時間8min下進行催化(hua)反(fan)(fan)應(ying)(ying)。為了避免(mian)實驗(yan)操作時間上的(de)誤差，用10~50μl2mh2so4作為終止(zhi)液來終止(zhi)反(fan)(fan)應(ying)(ying)。同(tong)時，為了避免(mian)磁珠對(dui)比色法測定數據(ju)產生影響，將(jiang)上述反(fan)(fan)應(ying)(ying)體(ti)(ti)系5000~8000rpm離(li)(li)心(xin)2~5min，對(dui)上清(qing)進行300~600nm波(bo)長掃描（圖2）。根據(ju)不同(tong)濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)卡(ka)那霉素溶(rong)液與(yu)450nm處的(de)吸光值(zhi)之間的(de)關(guan)系，繪制出(chu)相應(ying)(ying)的(de)檢測范(fan)圍和(he)(he)標(biao)準(zhun)(zhun)曲線(xian)（圖3）。

（5）實際(ji)(ji)樣品(pin)中卡那霉素的檢測(ce)：為(wei)了(le)驗證該檢測(ce)方法在實際(ji)(ji)樣品(pin)中的可(ke)行性，將不同(tong)濃度卡那霉素溶液(ye)人工(gong)添加至洋槐蜂蜜(mi)中，取其中1ml用2mm、ph5.0的醋(cu)酸(suan)-醋(cu)酸(suan)鈉緩(huan)沖液(ye)4ml混(hun)合，稀釋5倍后作為(wei)檢測(ce)基質，在與標準品(pin)檢測(ce)相同(tong)的條件下，進行催化反應(ying)。繪制(zhi)出其300~600nm波(bo)長下的吸收光譜圖(tu)(tu)（圖(tu)(tu)4）和線(xian)性關(guan)系圖(tu)(tu)（圖(tu)(tu)5）。通過與標準品(pin)檢測(ce)曲(qu)線(xian)比對，從而評判檢測(ce)體系的實際(ji)(ji)應(ying)用前景。

所(suo)述(shu)樣品(pin)為(wei)蜂(feng)蜜(mi)樣品(pin)。

本發(fa)明的(de)(de)(de)有益效果：①可視化(hua)、高特異性(xing)，對動物源性(xing)食品中卡(ka)那(nei)霉素殘留檢測(ce)具有重要意義；②通(tong)過合理的(de)(de)(de)設計，將(jiang)納米(mi)生(sheng)物催化(hua)、適配體技(ji)術和磁珠識(shi)別捕獲技(ji)術等(deng)多領域的(de)(de)(de)優(you)勢聯(lian)合起(qi)來，利(li)用(yong)納米(mi)顆粒易于制備、修飾，能起(qi)到很好的(de)(de)(de)信(xin)號放(fang)大(da)作用(yong)以及適配體的(de)(de)(de)構象變化(hua)等(deng)實現(xian)信(xin)號轉換和放(fang)大(da)；③檢測(ce)原(yuan)理的(de)(de)(de)通(tong)用(yong)性(xing)使(shi)該(gai)方法還適合基(ji)于不同的(de)(de)(de)適配體實現(xian)對不同目標物的(de)(de)(de)檢測(ce)。

附圖說明

圖1基于適配(pei)體修飾磁珠和金納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)模擬酶活性(xing)對卡那霉(mei)素的(de)比色分(fen)析(xi)法(fa)的(de)原理圖。

圖2不同濃(nong)度卡(ka)那霉素(su)存在(zai)時(shi)競(jing)爭置換和(he)催化反應后的uv-vis光譜(pu)圖。

圖(tu)3比色法檢測標準樣(yang)品時(shi)450nm處光(guang)吸(xi)收(shou)值與卡那(nei)霉素濃度的線性關(guan)系(xi)圖(tu)。

圖4蜂蜜樣品中存在不同濃(nong)度卡(ka)那霉素時競(jing)爭(zheng)置換和催化反應后的(de)uv-vis光譜(pu)圖。

圖(tu)5比色(se)法(fa)檢測蜂蜜樣品時450nm處光(guang)吸收(shou)值與卡那霉素濃度的線性關系圖(tu)。

具體實施方式

以下(xia)實施例中的(de)磁珠溶液購自海貍(li)納米科技(ji)蘇州有限公(gong)司。

實施例1

具體步驟如下：

（1）金(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)模擬(ni)酶(mei)(mei)aunps的制(zhi)備：利用酪(lao)氨(an)酸(suan)作為(wei)還原劑和捕獲劑制(zhi)備而成金(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)模擬(ni)酶(mei)(mei)：將含有0.1~0.5mm酪(lao)氨(an)酸(suan)和0.1~0.5mmkoh的300ml超(chao)純水溶(rong)液(ye)煮沸3~5min，立即加入1.02ml質(zhi)量體積(ji)比為(wei)1%~3%的氯金(jin)(jin)酸(suan)溶(rong)液(ye)并在(zai)沸水浴(yu)中保(bao)溫5~10min；繼續在(zai)沸水浴(yu)中持續沸騰(teng)至溶(rong)液(ye)體積(ji)減少至30ml，得到不同粒(li)(li)(li)(li)徑的金(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)溶(rong)液(ye)；將上述金(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)溶(rong)液(ye)提前在(zai)沸水中處理過的截(jie)留分子(zi)量為(wei)12kda的透析(xi)袋中透析(xi)除去多余的koh，金(jin)(jin)屬離子(zi)及酪(lao)氨(an)酸(suan)，得金(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)模擬(ni)酶(mei)(mei)aunps，置于4℃冰(bing)箱(xiang)中保(bao)存(cun)備用；

（2）功能(neng)化(hua)金納米顆(ke)粒(li)(li)（aunps-cdna）的(de)(de)制備：所(suo)有用到的(de)(de)試劑(ji)瓶和ep管都需要用12mnaoh溶(rong)液(ye)(ye)浸泡10h以(yi)上(shang)，并用大量水沖洗(xi)。400μl1μmcdna-sh經過95℃，10min，冰浴5min處理后(hou)(hou)，再與50μl10mmtcep在室溫下孵育1h。將上(shang)述(shu)混合(he)溶(rong)液(ye)(ye)與5ml金納米顆(ke)粒(li)(li)溶(rong)液(ye)(ye)混合(he)，在搖床中以(yi)100rpm，10℃下震蕩2h后(hou)(hou)，轉移至4℃冰箱，黑暗靜置16h以(yi)上(shang)。加(jia)入500mmph8.2的(de)(de)tris-hcl緩(huan)沖液(ye)(ye)，直至tris濃度為(wei)5mm。然后(hou)(hou)向上(shang)述(shu)溶(rong)液(ye)(ye)中逐滴加(jia)入400μl1mnacl溶(rong)液(ye)(ye)，靜置5~10min。8000~12000rpm離心8min，以(yi)除去未結合(he)的(de)(de)cdna序列（離心后(hou)(hou)上(shang)清(qing)若為(wei)紅色，繼續離心處理5min），最后(hou)(hou)用5mmph=7.5的(de)(de)pbs緩(huan)沖液(ye)(ye)重(zhong)懸得到功能(neng)化(hua)的(de)(de)金納米顆(ke)粒(li)(li)aunps-cdna，需放置在4℃黑暗環境下，保存(cun)時間約為(wei)2周(zhou)。

（3）mbs-aptamer-cdna-aunps復合結構的(de)構建：將(jiang)磁(ci)(ci)(ci)珠瓶放到漩渦振蕩(dang)器(qi)上振蕩(dang)20s，重懸(xuan)磁(ci)(ci)(ci)珠。用(yong)(yong)移液器(qi)吸(xi)取(qu)100μl1mg/ml的(de)磁(ci)(ci)(ci)珠溶液轉移至(zhi)新的(de)離(li)心管中。將(jiang)離(li)心管置于磁(ci)(ci)(ci)性(xing)分(fen)離(li)器(qi)上，靜置1min（此操(cao)作(zuo)后(hou)(hou)續簡稱為磁(ci)(ci)(ci)性(xing)分(fen)離(li)），用(yong)(yong)移液器(qi)吸(xi)去上清液，從(cong)磁(ci)(ci)(ci)性(xing)分(fen)離(li)器(qi)上取(qu)下(xia)離(li)心管。用(yong)(yong)bufferi將(jiang)磁(ci)(ci)(ci)珠稀釋(shi)至(zhi)濃度為1mm。50μl1mmsa-mbs與100μl500mmbiotin-aptamer混合充分(fen)振蕩(dang)（輕(qing)微）室(shi)溫(wen)下(xia)孵(fu)育30min后(hou)(hou)，加入50μl2%（v/v）bsa到磁(ci)(ci)(ci)珠溶液中室(shi)溫(wen)下(xia)孵(fu)育1h，以封閉磁(ci)(ci)(ci)珠暴露的(de)表面防止非特異性(xing)吸(xi)附的(de)發生。磁(ci)(ci)(ci)性(xing)分(fen)離(li)，去上清，用(yong)(yong)1×pbsbuffer沖洗(xi)磁(ci)(ci)(ci)珠三次，以除(chu)去未結合的(de)卡那霉素適(shi)配(pei)體。磁(ci)(ci)(ci)性(xing)分(fen)離(li)后(hou)(hou)，用(yong)(yong)200μl1×pbsbuffer復溶待(dai)用(yong)(yong)，即為mbs-aptamer。

200μlmbs-aptamer與(yu)200μlaunps-cdna室溫下孵育(yu)30min，后經過磁性分(fen)離，用1×pbsbμffer沖洗磁珠三次，除(chu)去未能互補雜交的aunps-cdna，最后用2mm，ph5.0的反(fan)應緩(huan)沖液醋(cu)酸-醋(cu)酸鈉(na)進行(xing)復(fu)溶，形(xing)成mbs-aptamer-cdna-aunps復(fu)合(he)結構，并(bing)對此復(fu)合(he)結構進行(xing)表征(zheng)。

卡那霉(mei)素適配體kanamycinaptamer，簡稱aptamer，序(xu)列為5’-biotin-tgggggttgaggctaagccga-3’；

bufferi內含有1mmedta、1mnacl和質量濃度0.05%~0.1%tween-20的(de)10mmtris-hcl、ph7.5。

（4）卡那霉素的(de)檢(jian)測(ce)和(he)標準曲線(xian)的(de)繪(hui)制(zhi):選擇不同濃(nong)度的(de)卡那霉素溶液，加(jia)入到(dao)反(fan)應(ying)(ying)(ying)體系中，通過(guo)50min置(zhi)換(huan)反(fan)應(ying)(ying)(ying)，將cdna-aunps復合結構(gou)置(zhi)換(huan)下來，其自身與(yu)(yu)aptamer序列形(xing)成(cheng)特(te)異結構(gou)。通過(guo)磁(ci)性分離后(hou)，將上(shang)清液（含(han)游離的(de)cdna-aunps）取出轉移(yi)至另(ling)外一支ep管(guan)內(nei)，加(jia)入20μl25~50mmtmb和(he)20μl3%~5%h2o2，在(zai)反(fan)應(ying)(ying)(ying)ph4~6，反(fan)應(ying)(ying)(ying)溫度30~50℃，反(fan)應(ying)(ying)(ying)時(shi)間8min下進行催化反(fan)應(ying)(ying)(ying)。為了避免(mian)實驗操作時(shi)間上(shang)的(de)誤差，用(yong)10~50μl2mh2so4作為終止液來終止反(fan)應(ying)(ying)(ying)。同時(shi)，為了避免(mian)磁(ci)珠對(dui)比色(se)法(fa)測(ce)定數據產生影響(xiang)，將上(shang)述(shu)反(fan)應(ying)(ying)(ying)體系5000~8000rpm離心(xin)2~5min，對(dui)上(shang)清進行300~600nm波長掃描（圖2）。根據不同濃(nong)度的(de)卡那霉素溶液與(yu)(yu)450nm處(chu)的(de)吸光值(zhi)之(zhi)間的(de)關系，繪(hui)制(zhi)出相應(ying)(ying)(ying)的(de)檢(jian)測(ce)范(fan)圍和(he)標準曲線(xian)（圖3）。

（5）實(shi)際(ji)樣品(pin)(pin)中(zhong)卡(ka)(ka)那霉素(su)的(de)檢(jian)(jian)測：為了驗證該檢(jian)(jian)測方法在實(shi)際(ji)樣品(pin)(pin)中(zhong)的(de)可行性，將不同濃度(du)卡(ka)(ka)那霉素(su)溶液人工添(tian)加至洋(yang)槐蜂蜜中(zhong)，取其(qi)中(zhong)1ml用醋酸(suan)-醋酸(suan)鈉緩沖液4ml混合，稀釋5倍后(hou)作為檢(jian)(jian)測基質(zhi)，在與(yu)標準品(pin)(pin)檢(jian)(jian)測相同的(de)條件下，進行催化反(fan)應(ying)。繪制出其(qi)300~600nm波長下的(de)吸(xi)收(shou)光(guang)譜圖(tu)（圖(tu)4）和線性關(guan)系圖(tu)（圖(tu)5）。通過(guo)與(yu)標準品(pin)(pin)檢(jian)(jian)測曲線比對，從(cong)而評判(pan)檢(jian)(jian)測體系的(de)實(shi)際(ji)應(ying)用前(qian)景。

實施例(li)2卡那霉素標準溶液的檢測(ce)

選擇不同濃度的卡那霉素溶液，加入到反應體系中，通過置換反應與卡那霉素適配體序列形成特異結構，將aunps-cdna從磁珠上置換下來。通過磁性分離后，將游離的aunps吸取，轉移到另外的ep管中，加入催化反應底物tmb和h2o2反應一段時間后，2mh2so4終止反應，離心，在分光光度計中測試其uv-vis光譜曲線，并記錄在450nm處的吸光值，根據樣品溶液中卡那霉素的濃度與450nm處的吸光值之間的關系，繪制出相應的關系曲線和線性范圍曲線（圖2，圖3）。在卡那霉素標準液濃度為5-100nm區間內，450nm處光吸收值與卡那霉素標準液濃度存在良好的線性關系。線性回歸方程為y=0.0014x+0.0656，r²=0.9954，其中y代表催化(hua)體系(xi)在450nm處的光吸(xi)收值，x代表卡那霉素標準(zhun)液濃度（nm），該檢測(ce)體系(xi)的檢測(ce)限為5.37nm。

實(shi)施例3蜂蜜樣品(pin)中卡那霉素殘留的檢測

此處采用(yong)往蜂蜜中添加標(biao)準(zhun)濃(nong)度卡(ka)那霉素制備人工污染蜂蜜的方式，獲得含(han)0～1000nm卡(ka)那霉素殘(can)留的蜂蜜樣品(pin)。

按(an)照實施例(li)2中(zhong)標準品檢(jian)測的步驟對洋槐蜂蜜中(zhong)人工污染的卡那霉素進行(xing)檢(jian)測。

得到如圖(tu)4所示的不同卡(ka)那霉素濃度下的uv-vis光(guang)譜曲(qu)線(xian)，以及圖(tu)5所示光(guang)吸收值與(yu)蜂蜜樣品中卡(ka)那霉素濃度的線(xian)性關系曲(qu)線(xian)。

在2～1000nm區間內，光吸收值與卡那霉素濃度（nm）呈現正相關關系，并且在5-100nm間，表現出良好的線性關系，線性方程為y=0.0018x+0.1082，r²=0.9877，檢(jian)(jian)測限為18.3nm。式(shi)中(zhong)(zhong)字母的意義與實施例(li)1中(zhong)(zhong)相同。標(biao)準品溶液與實際樣(yang)(yang)品中(zhong)(zhong)卡那霉素(su)校準曲線(xian)相似，表明實際樣(yang)(yang)品基質(zhi)中(zhong)(zhong)的復雜組分對(dui)檢(jian)(jian)測沒有(you)太大影響，這種基于納米模擬酶(mei)和(he)適配體的生物傳(chuan)感(gan)器檢(jian)(jian)測技術在食品安全分析中(zhong)(zhong)具(ju)有(you)較大的應用前(qian)景。