專利名稱：一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及提取蛋白質的方法，尤其涉及一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法。具體涉及一種以紫花苜蓿葉為原料，提取苜蓿葉蛋白的技術，屬于植物蛋白技術領域。
背景技術：
葉蛋白是以新鮮的綠色植物莖葉為原料，經壓榨取汁、分離汁液中蛋白質和濃縮干燥而制備的蛋白質濃縮物(leaf protein concentration，簡稱LPC)。苜蓿中含有豐富的葉蛋白，其營養豐富，具有防病、治病、防衰抗老、強身健體等多種生理功能；同時，苜蓿葉蛋白的氨基酸組成齊全且配比合理，與聯合國糧農組織推薦的成人氨基酸模式基本相符， 可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑，被FAO認為是一種高質量的食品。但目前苜蓿葉蛋白提取方法大多為加熱絮凝法、酸法、堿法、有機溶劑法、酶法及發酵酸法等，加熱絮凝法易使蛋白質高溫發生變性，溶解度差，使其用途受到限制；酸法、堿法、有機溶劑法易使制得的葉蛋白產品存在大量的酸、堿和有機溶劑污染，給后續工作帶來很多麻煩；酶法提取條件較溫和，但提取率不高，提取速度較慢；發酵酸法提取是利用發酵產生的有機酸使蛋白質沉淀，條件溫和，但缺點是提取時間長且操作繁瑣。上述幾種方法的局限，使得葉蛋白的提取成本高，品質不夠穩定，需要進一步的精制。超聲波是一種彈性波，它能產生并傳遞強大的能量。超聲波技術可大大提高提取率和提取速度，是由于超聲波具有一系列的力學、熱學、電磁學和化學的超聲效應，如機械效應、空化效應、熱效應和化學效應等。其中超聲波的空化效應促使溶劑更大程度的滲入細胞中，在振動處于稀疏狀態時，超聲波在植物組織細胞里比電磁波穿透更深，停留時間也更長，提高物質傳遞速度；而且它的次級效應如機械振動、乳化、擴散、擊碎和化學效應等可使細胞壁破裂，而加速植物中有效成分的擴散和釋放。被浸提的有效成分在被破碎瞬間生物活性保持不變，同時提高破碎速度和提取率。超聲波能夠產生增溶作用而被廣泛應用于有效成分的強化提取，具有成本低、設備簡單、操作容易、提取率高等優點。酶法提取反應條件較溫和，且能更多地保留蛋白質的營養價值。因此，利用超聲波輔助酶法提取葉蛋白可以比較高效、節能和快速地從苜蓿葉中提取優質蛋白質。超聲波輔助提取工藝已應用于植物性蛋白的制備中，如CN 102002111A的發明專利提供了采用超聲波輔助稀堿液提取紫菜蛋白和多糖。但是到目前為止，還沒有應用超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的成熟規范化技術。

發明內容
為了解決我國植物蛋白資源匱乏，苜蓿等大量優質牧草僅用作飼料而造成資源浪費的問題，本發明實施方式提供一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法，即采用超聲輔助酶法提取苜蓿葉蛋白，優化提取工藝，達到以低耗能、無污染及低成本提取葉蛋白。實現上述目的技術方案為
本發明實施方式提供一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法，該方法包括(1)加工原料采用新鮮的初花期紫花苜蓿，取其植株葉片為加工原料；苜蓿刈割后應盡快加工處理，若需要短時間保存，應裝入保鮮袋封口，并置于5°C左右冷藏，以免由于葉子本身的呼吸作用和微生物的污染而使苜蓿葉蛋白產量和品質降低。

(2)清洗、粉碎用自來水清洗2 3次，清洗過程中去除苜蓿葉原料中枯萎、變黃、腐爛和有病蟲害的葉子。將清洗好的葉子切成Icm的小段；(3)打漿按重量比苜蓿葉水=1 2的比例加水，放入組織搗碎機中均勻打漿，打漿時間為3分鐘。采用140目尼龍濾布過濾，得苜蓿汁液；(4)超聲波輔助酶解提取葉蛋白的酶采用纖維素酶，將纖維素酶加入(3)得到的苜蓿汁液中，加酶量為每100毫升所述汁液用3 4克纖維素酶，用食品酸味劑調汁液PH 為4. 5 5. 5，充分攪拌混勻后放入超聲波提取器中超聲處理，得到提取液；(5)滅酶將(4)得到的提取液在85°C下滅酶IOmin ；(6)絮凝、葉蛋白凝聚物分離在滅酶后溶液中加入食品酸味劑調節其PH值為 4. 0，靜置5小時。然后在4000 5000r/min的離心作用下持續處理15 20min，得到葉蛋白粗提物和上清液；(7)干燥將步驟(6)葉蛋白凝聚物干燥至恒重。即得到苜蓿葉蛋白產品。步驟(1)所述初花期苜蓿包括刈割后第二茬或第三茬初花期新鮮苜蓿。步驟(4)所述的纖維素酶的活力為8000U/g，纖維素酶活力單位定義為在37°C，pH 值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。步驟(4)所述的超聲波提取條件為超聲功率100 250W，頻率為20 40kHz，溫度50 60°C，超聲持續作用，時間30 40min。步驟(6)所述的食品酸味劑為檸檬酸、蘋果酸和酒石酸中的一種。步驟(7)中的干燥方法為熱風干燥、真空干燥和冷凍干燥中的一種。本發明與現有技術相比，具有以下有益效果1、超聲波輔助酶法與加熱絮凝法相比，條件溫和，蛋白質提取率高，尤其是所得到的苜蓿葉蛋白產品質量高，不會發生蛋白質變性，溶解度高，適于作為食品添加劑應用在食品工業中。2、超聲波輔助酶法與酸法、堿法及有機溶劑法相比，不會使蛋白產品因加入大量酸、堿及有機溶劑造成污染，得到的蛋白產品適于作為食品添加劑應用在食品工業中。3、超聲波輔助酶法與酶法相比，可快速、高效、節能地從苜蓿葉中提取蛋白質，所得的蛋白質提取率高、色澤較淺、穩定性好。4、超聲波輔助酶法與發酵酸法相比，工藝過程簡單，周期短，提取速度快，提取率較高。5、本發明原料來源廣泛，且成本較低，采用超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白，為緩解國內植物蛋白資源的短缺和現有資源的有效利用提供了一條新的途徑。


圖1超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的工藝流程圖
具體實施例方式實施例 1(1)加工原料采用新鮮的初花期苜蓿，取其植株葉片為加工原料，所述初花期苜蓿包括刈割后第二茬或第三茬初花期新鮮苜蓿。苜蓿刈割后應盡快加工處理，若需要短時間保存，應裝入保鮮袋封口，并置于5°C左右冷藏，以免由于葉子本身的呼吸作用和微生物的污染而使苜蓿葉蛋白產量和品質降低。(2)清洗、粉碎用自來水清洗3次，清洗過程中去除苜蓿葉原料中枯萎、變黃、腐爛和有病蟲害的葉子。將清洗好的葉子切成Icm的小段；(3)打漿、榨汁按重量比苜蓿葉7jC= 1 2的比例加水，放入組織搗碎機中均勻打漿，打漿時間為3分鐘。采用140目尼龍濾布分離法過濾，得苜蓿汁液；(4)超聲波輔助酶解提取葉蛋白的酶采用纖維素酶，將纖維素酶加入(3)得到的苜蓿汁液中，加酶量為每100毫升所述汁液用4克纖維素酶，用檸檬酸調汁液PH為5，充分攪拌混勻后放入超聲波提取器中超聲提取，超聲波提取條件為超聲功率220W，頻率為 30kHz，溫度50°C，超聲持續作用，時間40min，得到提取液；上述提取液中含有酶活力為8000U/g的纖維素酶，纖維素酶活力單位定義為在 37°C，pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放 Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。(5)滅酶將(4)得到的提取液在85°C下滅酶IOmin ；(6)絮凝、葉蛋白凝聚物分離在滅酶后溶液中加入檸檬酸調節其PH值為4.0，靜置5小時。然后在4000r/min的離心作用下持續處理20min，得到葉蛋白粗提物和上清液；(7)干燥將步驟(6)葉蛋白凝聚物在50°C下的恒溫烘箱中干燥至恒重。即得到苜蓿葉蛋白產品。實施例2(1)加工原料同實施例1(2)清洗、粉碎同實施例1(3)打漿、榨汁同實施例1(4)超聲波輔助酶解提取葉蛋白的酶采用纖維素酶，將纖維素酶加入(3)得到的苜蓿汁液中，加酶量為每100毫升所述汁液用3克纖維素酶，用蘋果酸調汁液PH為4. 5，充分攪拌混勻后放入超聲波提取器中超聲提取，超聲波提取條件為超聲功率200W，頻率為 30kHz，溫度55°C，超聲持續作用，時間30min，得到提取液；上述提取液中含有酶活力為8000U/g的纖維素酶，纖維素酶活力單位定義為在 37°C，pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放 Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。(5)滅酶同實施例1(6)絮凝、葉蛋白凝聚物分離在滅酶后溶液中加入蘋果酸調節其PH值為4.0，靜置5小時。其它步驟同實施例1(7)干燥將步驟(6)葉蛋白凝聚物用真空干燥法干燥至恒重。即得到苜蓿葉蛋
白廣品。
實施例3(1)加工原料同實施例1(2)清洗、粉碎同實施例1(3)打漿、榨汁同實施例1(4)超聲波輔助酶解提取葉蛋白的酶采用纖維素酶，將纖維素酶加入(3)得到的苜蓿汁液中，加酶量為每100毫升所述汁液用3. 5克纖維素酶，用酒石酸調汁液PH為5，充分攪拌混勻后放入超聲波提取器中超聲提取，超聲波提取條件為超聲功率250W，頻率為 30kHz，溫度50°C，超聲持續作用，時間40min，得到提取液；上述提取液中含有酶活力為8000U/g的纖維素酶，纖維素酶活力單位定義為在 37°C，pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放 Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。(5)滅酶同實施例1(6)絮凝、葉蛋白凝聚物分離在滅酶后溶液中加入酒石酸調節其PH值為4.0，靜置5小時。然后在5000r/min的離心作用下持續處理15min，得到葉蛋白粗提物和上清液；(7)干燥將步驟(6)葉蛋白凝聚物用冷凍干燥法干燥至恒重。即得到苜蓿葉蛋
白廣品。
權利要求
1.一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法，其特征在于包括列下步驟(1)加工原料采用新鮮的苜蓿，取其植株葉片為加工原料；(2)清洗、粉碎用自來水清洗2 3次，清洗過程中去除苜蓿葉原料中枯萎、變黃、腐爛和有病蟲害的葉子。將清洗好的葉子切成Icm的小段；(3)打漿按重量比苜蓿葉水=1 2的比例加水，放入組織搗碎機中均勻打漿，打漿時間為3分鐘。采用140目尼龍濾布過濾，得苜蓿汁液；(4)超聲波輔助酶解提取葉蛋白的酶采用纖維素酶，將纖維素酶加入(3)得到的苜蓿汁液中，加酶量為每100毫升所述汁液用3 4克纖維素酶，用食品酸味劑調汁液pH為 4. 5 5. 5，充分攪拌混勻后放入超聲波提取器中超聲處理，得到提取液；(5)滅酶將⑷得到的提取液在85°C下滅酶IOmin；(6)絮凝、葉蛋白凝聚物分離在滅酶后溶液中加入食品酸味劑調節其PH值為4.0，靜置5小時。然后在4000 5000r/min的離心作用下持續處理15 20min，得到葉蛋白粗提物和上清液；(7)干燥將步驟(6)葉蛋白凝聚物干燥至恒重。即得到苜蓿葉蛋白產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿包括刈割后第二茬或第三茬初花期新鮮苜蓿。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的纖維素酶的活力為 8000U/g，纖維素酶活力單位定義為在37°C，pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL 的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述超聲波提取條件為超聲功率100 250W，頻率為20 40kHz，溫度50 60°C，超聲持續作用，時間30 40min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)所述的食品酸味劑為檸檬酸、蘋果酸和酒石酸中的一種。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(7)中的干燥方法為熱風干燥、真空干燥和冷凍干燥中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種超聲波輔助酶法提取苜蓿葉蛋白的方法，屬于植物蛋白技術領域。該方法包括以初花期苜蓿的苜蓿葉為原料，清洗后進行打漿，過濾后得到汁液和漿渣；對汁液進行超聲波輔助酶法處理。在汁液中加入纖維素酶并同步超聲波提取得提取液。具體條件為加酶量為每100毫升所述汁液用3～4克纖維素酶，超聲功率100～250W，頻率20～40kHz，溫度50～55℃，超聲持續作用，時間30～40min，得到提取液；在滅酶后溶液絮凝。然后在4000～5000r/min的離心作用下持續處理15～20min，得到葉蛋白粗提物和上清液；將葉蛋白粗提物提取后進行干燥至恒重，即得到苜蓿葉蛋白產品。本發明工藝過程簡單，條件溫和，能耗低，提取時間短，提取率高，操作控制容易，便于大規模工業化生產。
文檔編號C07K1/14GK102351944SQ20111034361
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者吳紅艷, 江成英, 許英一 申請人:齊齊哈爾大學