專利名稱：鐵氧還蛋白的簡易分離方法
技術領域：
本發明屬于一種植物蛋白的分離方法。
鐵氧還蛋白(Ferredoxin，簡稱Fd)是普遍存在于植物界的一種低分子量(Mr為11000)，具有氧化還原性質的蛋白，它參與碳同化和硝酸鹽還原等諸多生理活動，許多涉及光合作用和生物固氮等實驗都會用到這種生物化學試劑。雖然商品Fd試劑純度較高，但價格昂貴。而傳統的Fd的分離方法需耗用大量丙酮(植物生理學通訊1984(1):46-47)。該方法的主要流程為(一)用菠菜葉預先深凍(-20℃)，室溫下解凍，使細胞凍融破裂，加入0.01M Tris-HCI pH7.3緩沖液，搗碎凍融葉片，紗布過濾。(二)濾液中加入深冷(-20℃)丙酮，使之濃度到35％丙酮。經5000×g離心，把沉淀棄去。在離心后的上層液中繼續加入深冷丙酮，使之濃度達到75％，靜止后，使沉淀沉降，吸去部分上清液后，余留帶有沉淀的75％濃度丙酮溶液，經5000×g離心，收集沉淀，用冷風吹干殘留沉淀中的丙酮，并使懸浮于0.01M Tris-HCIpH7.3緩沖液，對同樣緩沖液透析，再經18000×g離心20分鐘，紅棕色的上層液為含Fd的粗制品。(三)在紅棕色的樣品中加入固體NaCl，使之成0.15M NaCl濃度，并把它吸附到預先經0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15M NaCl平衡過的DEAE-纖維素(D-52)分離柱上。以同樣的緩沖液洗柱，未被吸附的樣品流棄。深棕紅色的Fd吸附帶呈現在分離柱的上端。再分次提高洗脫緩沖液中的NaCl濃度以0.2M、0.25M、0.3M……。同時觀察分離柱的上端Fd移動的情況，直到提高NaCl濃度到棕紅色吸附帶開始下降移動，就不再提升NaCl濃度，繼續洗脫，并收集出棕紅色的Fd制劑。(四)將收集的Fd溶液，對不含NaCl的0.01M Tris-HCI pH7.3透析脫鹽，濃縮保存、備用。但用此方法如提取1Kg菠菜葉片，共需耗丙酮6立升，大量用過的丙酮不僅對回收、處理帶來麻煩，而且由于高濃度的丙酮在操作過程中不能用塑料容器，這還對離心設備的使用帶來諸多不便，且成本高，又不安全。
本發明的目的是提供一種屏棄丙酮，省時、省錢、安全、簡便的Fd分離方法，此方法雖在得率和純度上不及丙酮提取方法，但在光合電子傳遞的離體實驗中，由于某些成分(Fd-NADP-還原酶、銅蘭素等)未被分離掉，反而有利生化反應的進行。同時也解決了由于使用大量高濃度的丙酮，對離心操作帶來不便，及對廢丙酮回收處理帶來的麻煩。
本發明提出的鐵氧還蛋白的分離方法，是目前最簡單的方法，本發明是這樣實現的(一)菠菜或豌豆葉片的深凍、搗碎、過濾、離心的提取步驟與已有技術相同，緩沖液用0.02M Tris-HCl pH7.6得到第一步提取液后，關鍵在省略了第二步，不再用35％～75％的丙酮分級沉淀，而是直接用DEAE-纖維素(D-52)吸附蛋白。(二)吸附蛋白把DEAE-纖維素(D-52)原裝干粉，直接投到提取液中，使其充分吸附提取液中的蛋白。緩慢攪拌使DEAE-纖維素分散吸脹。(三)裝柱把吸附蛋白后，呈深色的DEAE-纖維素裝到層析柱直徑4cm、長25-30cm)上，為了使DEAE均勻地在柱內沉降，可先在柱內裝滿緩沖液，一邊在柱上端加入吸脹的DEAE-纖維素，一邊在柱下端放出柱內溶液，使其均勻地沉降下來，緩慢操作，連續灌注，直至完成。(四)洗脫雜蛋白用含0.15M NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液洗柱，需連續洗脫不能中斷，使之洗脫過夜，大量不被吸附的蛋白被洗脫掉。流出液由起始的呈深黃色逐漸變淡呈微黃色。(五)收集Fd當洗脫液中的NaCl濃度由0.15M提高到0.3M，繼續洗脫時，DEAE-纖維素柱的上端可以看到有一棕色環帶析出，并隨洗脫而下移，此為含Fd成份的部分，控制流速，使其盡可能集中在體積較小的洗脫液中。收集棕紅色的洗脫液部分。(六)脫鹽及濃縮一般用水溶液法提取得到的Fd制劑較稀，需經濃縮。可以用超濾膜方法來脫鹽濃縮，也可以先把樣品，對不含NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液，透析脫鹽，透析后的樣品連同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000～6000)中，將體積縮小3～5倍后取出。冷藏、儲用。(七)Fd制品的濃度和純度計算本制品為Fd粗制品，含量的近似值可按克分子消光系數ε420=9.4 L·mmol-1·cm-1，分子量11000計算。Fd的質量指標用O.D420/O.D276吸收比值指示，比值越大，相對Fd含量越高(一般在0.2以上)。
本發明的積極效果是明顯的，本發明的改進之處是省略了大量丙酮有機溶液，解決了安全操作及因離心容器不能使用丙酮的問題，而且DEAE-纖維素又可以再生利用，操作比原來容易得多。用本發明的方法制備得到的Fd是粗制品(尚未把其中的黃素蛋白、Fd-NADP還原酶、銅蘭素等分離開來)，但對于離體葉綠體的光合電子傳遞實驗來說，粗制品中所含這些未被分離的成分，反而有利于光合電子傳遞的進行。因此本發明是一種省時、省錢、安全、簡易的Fd分離方法。
以下的附圖和實施例將對本發明的技術特征作進一步的描述。


圖1Fd的氧化還原吸收光譜。
圖2依賴Fd的離體葉綠體NADP光還原。
實施例1(一)取1公斤新鮮菠菜葉片洗凈→去中脈→甩干水份→紗布包緊→-20℃冷凍2-3天→取出后用木棒擊碎成粉狀→在室溫下解凍→使細胞凍融破碎→加入0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6緩沖液1500ml→分次用電動搗碎機搗碎成糊狀→4層紗布和尼龍網布過濾→擠出液體(呈深綠色)→3000×g離心5分鐘→取上層液(呈綠色)。(二)吸附蛋白將100g原裝DEAE-纖維素(D-52)直接分散加入上層液→緩慢攪拌使其分散，吸水膨脹，靜放于冰箱(過夜)→傾去部分上層液。(三)裝柱將吸脹后的DEAE轉移至層析柱上(直徑4cm長30cm)為使DEAE均勻地在柱內沉降，可先在柱內灌滿緩沖液，一邊灌入吸脹的DEAE，一邊緩慢放出柱內溶液，使其均勻沉降下來，應連續灌注，直至完成。(四)洗脫雜蛋白用含0.15 ML-1NaCl的0.02M·L-1Tris-HClpH7.6緩沖液洗柱，連續洗脫不能中斷，洗脫過夜，約需耗用5L洗脫液。流出液由起初的深黃色逐漸稀釋成微黃色，為保持柱內DEAE界面平整，可以在柱內洗脫液的界面上，浮一片塑料薄片，以便洗脫液下滴時，不直接沖擊DEAE-纖維素的界面。(五)收集Fd當洗脫緩沖液中的NaCl濃度由0.15M更換成0.3M后，柱的上部有一棕紅色的環帶析出，并洗脫液下移(此為含Fd的部分)，洗脫液流速控制在2ml·min-1，合并Fd較集中的部分，體積約50ml。(六)脫鹽及濃縮先把0.3M NaCl洗脫下來的含Fd樣品，用10倍體積的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液透析，更換3次透析液。隨后把透析脫鹽后的樣品，連同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000)，放于冰箱，待透析袋中樣品體積濃縮5～10倍后取出，低溫貯存。
將本發明鐵氧還蛋白的分離方法制取的Fd用以下實驗(1)Fd的氧化還原吸收光譜取0.3ml Fd用0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6緩沖液將樣品稀釋10倍，在島津UV-3000分光光度計上掃描吸收光譜。可在463nm處看到Fdox的特征吸收峰，此為氧化型Fd的吸收光譜。在Fd樣品比色杯中放入一小粒硼氫化鈉(強還原劑)，再掃描吸收光譜，此時463nm處吸收峰消失，此為還原型Fd的吸收光譜(圖1)。表明樣品具有Fd吸收光譜的典型特征。(2)需Fd的離體葉綠體NADP光還原將用菠菜葉片制備的離體葉綠體，放在含有0.05 mol·L-1Tris-HclpH7.6,5mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1NaCl,0.1mmol·L-1NADP的3ml反應液中，反應液中葉綠體含量為20μg葉綠素。分別置于兩個石英比色杯中，其中一個比色杯中加入20μlFd作為樣品，另一為對照。先在340nm處比色讀OD值。再把樣品杯置于光下定時照光，光源用白熾燈或鹵素燈，并用10cm厚的玻璃水缸隔熱。每照光半分鐘后立即測OD值變化。從圖2可以看到，含Fd的一組在340nm處的光密度值會隨著照光的進程而上升，表示有NADP還原，而不含Fd的一組，僅有微小上升，這可能是離體葉綠體制劑中殘留的內源Fd引起。根據光暗的OD差值即可算出NADP的光還原速率。見圖2。
從上述結果表明本發明分離方法制備的Fd為粗制品，其純度雖不能與商品Fd相比，但對測定離體葉綠體NADP還原實驗來說，反而比純化的Fd有利，因為在非循環光合電子傳遞鏈上，還原的Fd向NADP傳遞電子時，還需要Fd-NADP還原酶(FNR)的催化，如果Fd很純，則反應系統中還需要另加FNR，而本發明分離方法的Fd制劑中，恰好殘留有FNR等黃素蛋白，這對NADP光還原反應的進行是有利的，這進一步說明了本發明的積極效果。
權利要求
1．一種鐵氧還蛋白的簡易分離方法(一)用菠菜葉預先深凍(-20℃)，室溫下解凍，使細胞凍融破裂，加入Tris-HCI 0.01M pH7.3緩沖液，搗碎凍融葉片，紗布和尼龍布過濾，(二)濾液中加入深冷(-20℃)丙酮，使之濃度到35％丙酮。經5000×g離心，把沉淀棄去。在離心后的上層液中繼續加入深冷丙酮，使之濃度達到75％靜止后，使沉淀沉降，吸去部分上清液后，余留帶有沉淀的75％濃度丙酮溶液，經5000×g離心，收集沉淀，用冷風吹干殘留沉淀中的丙酮，并使懸浮于0.01 M Tris-HCI pH7.3緩沖液，對同樣緩沖液透析，再經18000×g離心20分鐘，紅棕色的上層液為含Fd的粗制品，(三)在紅棕色的樣品中加入固體NaCl，使之成0.15MNaCl濃度，并把它吸附到預先經0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15MNaCl平衡過的DEAE-纖維素(D-52)分離柱上，以同樣的緩沖液洗柱，未被吸附的樣品流棄，深棕紅色的Fd吸附帶呈現在分離柱的上端，再分次提高洗脫緩沖液中的NaCl濃度以0.2M、0.25M、0.3M……，同時觀察分離柱的上端Fd移動的情況，直到提高NaCl濃度到棕紅色吸附帶開始下降移動，就不再提升NaCl濃度，繼續洗脫，并收集出棕紅色的Fd制劑，(四)將收集的Fd溶液，對不含NaCl的0.01M Tris-HCI透析脫鹽，濃縮保存、備用，其特征在于省略了第二步，不再用35％～75％的丙酮分級沉淀，而直接用DEAE-纖維素吸附蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種植物鐵氧還蛋白的簡易分離方法。鐵氧還蛋白是普遍存在于植物體內的一種低分子量具有氧化還原性質的蛋白,它參與光合作用和生物固氮等生理活動。是一種重要的生物化學試劑。傳統的分離方法需耗用大量的丙酮,本發明提供一種省略丙酮的分離步驟,解決由于使用丙酮帶來工藝上的困難。產品適用于對鐵氧還蛋白純度要求不是很高的生化反應,對于光合電子傳遞的離體實驗,由于某些成分未被分離,反而有利反應進行。
文檔編號C07K1/22GK1323801SQ0111260
公開日2001年11月28日 申請日期2001年4月17日 優先權日2001年4月17日
發明者葉濟寧 申請人:中國科學院上海植物生理研究所