綠膿桿菌的AhpF蛋白質的新活性及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明設及一種來源于綠脈桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的AhpF蛋白質及其 應用，所述AhpF蛋白質具有硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase;TR)、硫氧還蛋白 (thioredxo in; Trx )、過氧化物酶（peroxidase; Prx)及分子伴侶（chaperone)活性。更具體 地，本發明設及一種具有環境脅迫耐性的生物體及其制備方法。所述具有環境脅迫耐性的 生物體是通過重新確認了綠脈桿菌的AhpF蛋白質除了具有已知的硫氧還蛋白還原酶功能 W外，還具有過氧化物酶及分子伴侶活性的基礎上，并利用該新的活性將編碼所述AhpF蛋 白質的基因導入到生物體中而制備的。
【背景技術】
[0002] 在有氧代謝過程或生物個體暴露在多種脅迫條件下產生活性氧（ROS) (Finkel T .，Curr. Opin. Cel 1 Biol. 15:247-254，2003)。運種活性氧會對生物性巨分子（蛋白質、月旨 質、核酸等)帶來阻礙氧化功能或結構變化等的嚴重危害，并成為諸多疾病的原因 (Neumann et al .，化ture，424:561-565，2003)。所有的有氧生物體為了使自身免受因氧化脅迫或活 性氧而引起的蛋白質的變性(denaturation)，W及為了使自身免受由上述變性誘導的蛋白 質的聚集(aggregation)的影響而具有多種抗氧化蛋白質和熱沖擊蛋白質等多種形態的分 子性分子伴侶。其中，具代表性的是革蘭陰性菌，然而通過院內感染（nosocomial infections)被發現的、作為人類的伺機性致病菌（opportunistic human pathogen)的綠 脈桿菌對活性氧具有強力的防御機制。作為具體的防御機制，可W舉例如，具有2個超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)、3個過氧化氨酶（catalase，CAT)及4個Ahp還原酶 (reductase)。
[0003] 另外，據報道，所述Ahp還原酶系統在除了綠脈桿菌的多種微生物中起到對氧化脅 迫的防御系統的作用。Ahp還原酶系統通過催化有機過氧化物或氨過氧化物的NAD(P化的依 賴性還原而在生物體中起到去除有害的活性氧的功能。據報道，Ahp還原酶系統通常由 AhpF-AhpC構成，其中，AhpF(烷基過氧化氨還原酶亞基F，a化yl hy化operoxide reductase subunit巧由1566bp的多核巧酸、521個氨基酸組成，其分子量為56kDa。
[0004] 如下圖所示，已知在現有的大腸桿菌化.CO 1 i )或鼠傷寒沙口氏菌（Salmone 1 Ia typh imur i皿)等中被報道過的Ahp還原酶系統中的Ahp C和AhpF分別起到了分離的作用。
[0006]旨P，大腸桿菌或鼠傷寒沙口氏菌等的一般的AhpF起到從NAD(P)H接受電子并向 AhpC傳遞電子的還原酶的作用，AhpC起到去除過氧化氨的過氧化物酶的作用。因此，一直認 為為了有效地去除活性氧，AhpF和AhpC都是必需的。
[0007] 然而，本發明人第一次確認了綠脈桿菌的AhpF不僅具有已知為現有微生物的一般 AhpF功能-還原酶活性，而且還同時具有已知為AhpC的活性的過氧化物酶活性及分子伴侶 活性等，即，最先確認了一個AhpF蛋白質具有多種功能，并且確認了運種AhpF蛋白質的活性 依賴于結構，從而完成了本發明。

【發明內容】

[0008] 要解決的技術問題
[0009] 本發明的一個目的在于，提供一種具有硫氧還蛋白還原酶、過氧化物酶及分子伴 侶活性的AhpF蛋白質。
[0010] 本發明的另一目的在于，提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質的硫氧還蛋白還原酶活 性得到增加的變異體、分子伴侶活性得到增加的所述AhpF的高分子性結合體、W及過氧化 物酶活性得到增加的AhpF的低分子性結合體。
[0011] 本發明的又一目的在于，提供一種包含編碼所述綠脈桿菌的AhpF蛋白質的多核巧 酸的用于增強生物體環境脅迫抵抗性的組合物及轉化了所述多核巧酸的具有環境脅迫抵 抗性的植物體。
[0012]技術方案
[0013] 為了解決本發明的一個目的，本發明提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質，所述蛋白 質同時具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴侶活性。
[0014] 本發明的綠脈桿菌的AhpF蛋白質優選具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列，但并不限 定于此。
[0015] 為了解決本發明的另一目的，本發明提供一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質的變異體， 所述綠脈桿菌的AhpF蛋白質的變異體是SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中的第342位的氨基酸 半脫氨酸(cysteine)被絲氨酸(serine)或丙氨酸(alanine)取代的變異體。
[0016] 另外，本發明提供一種所述AhpF蛋白質的高分子性結合體及低分子性結合體。所 述AhpF蛋白質的高分子性結合體的特征為，其分子伴侶活性得到增加，分子量至少為500-2000kDa。另外，所述AhpF蛋白質的低分子性結合體的特征為，其過氧化物酶活性得到增加， 分子量至少為l〇〇-250kDa。
[0017] 為了解決本發明的又一目的，本發明提供一種用于增強生物體的環境脅迫抵抗性 的組合物，所述組合物包含一種載體，所述載體導入有編碼綠脈桿菌的AhpF蛋白質的多核 巧酸。
[0018] 另外，本發明提供一種轉化了表達綠脈桿菌的AhpF蛋白質的重組載體的農桿菌屬 (Agrobacterium)微生物。本發明還提供一種轉化植物體，所述轉化植物體過量表達本發明 所述的AhpF蛋白質，從而具有環境脅迫抵抗性。
[0019] 另外，本發明提供一種制備具有環境脅迫抵抗性的植物體的方法，其特征為，所述 方法是將包含有編碼所述AhpF蛋白質的多核巧酸的重組載體轉化到植物體中。
[0020] 下面，將詳細說明本發明。本發明中所使用的術語、技術等在沒有被具體限定的情 況下，W本發明所屬技術領域中通常使用的意思來定義。另外，將對重復的說明進行省略。
[0021] 本發明的一個實施方式設及一種綠脈桿菌的AhpF蛋白質，所述綠脈桿菌的AhpF蛋 白質同時具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴侶活性。所述綠脈桿菌 的AhpF蛋白質優選具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列，但并不限定于此。即使所述AhpF蛋白質 的氨基酸的一部分發生變形或受到損失，如果如本發明一樣同時具有硫氧還蛋白還原酶、 過氧化物酶及分子伴侶活性，并且是普通的技術人員能夠容易地導出的、具有90% W上的 同源性的綠脈桿菌的AhpF蛋白質，則均包括在本發明的范圍內。
[0022] 已知現有的綠脈桿菌的AhpF蛋白質只具有硫氧還蛋白還原酶(TR)及硫氧還蛋白 (化X)活性，本發明第一次確認了綠脈桿菌的AhpF不僅具有TR及化X活性，還具有已知為作 為區別功能的AhpC的過氧化物酶及分子伴侶活性(參照圖1)。在本發明的一實施例中確認 了綠脈桿菌的AhpF蛋白質同時具有硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白、過氧化物酶及分子伴 侶的支持酶化oldase)及折疊酶(Foldase)功能(參照圖2~圖5)。
[0023] 過氧化物酶活性(Peroxidase activity)是指下述過程:還原型煙酷胺腺嚷嶺二 核巧酸憐酸(NADPH)轉化為NADP+的同時，將電子化+)傳遞給硫氧還蛋白還原酶，所述TR再次 將電子傳遞給硫氧還蛋白的同時被氧化，接受到TR傳遞的電子而被還原的Trx將電子傳遞 給Prx，而Trx被氧化，被還原的Prx將出化分解為化及出0。
[0024] 另外，分子伴侶是與蛋白質的折疊 (folding)有關的蛋白質，例如是指，當蛋白質 受到熱沖擊化eat shock)等脅迫時，蛋白質處于完整折疊狀態的3元結構會被打開，從而無 法正常起到自身的作用，運時被命名為分子伴侶的組群的蛋白質識別出上述被打開的蛋白 質并與其結合，從而起到防止蛋白質的變性，或者為其制造能夠重新再進行折疊的良好環 境的蛋白質。分子伴侶活性(molecular chaperone activity)分為支持酶(Holda