專利名稱：：穩定儲藏的葡糖氧化酶的制作方法
技術領域：
：本發明提供方法和包含至少一種葡糖氧化酶的組合物，其中葡糖氧化酶具有改善的儲存穩定性。在一些優選的實施方案中，葡糖氧化酶在暴露于高溫后仍是穩定的。在一些備擇的優選實施方案中，葡糖氧化酶在液體制劑中具有改善的儲存穩定性。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供方法和包含從曲霉屬物種(/^/wg/"附w)獲得的葡糖氧化酶的組合物。在一些更特別優選的實施方案中，從黑曲霉(A"/gw)獲得葡糖氧化酶。發現本發明可用于涉及清潔的應用中。在一些特別優選的實施方案中，發現本發明可用于個人護理產品和應用中。
背景技術：
：葡糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)是用氧催化葡萄糖氧化的酶，由此形成D-葡糖酸和過氧化氫。這些酶具有大量的工業用途，包括但不限于卵的脫糖及從飲料以及濕食品、調味品和密封食品包裝中去除氧。也將這些酶用于檢測和消除工業溶液和體液(如血和尿)中的葡萄糖。然而，已發現這些酶在多種條件下不穩定。因此，盡管這些酶已經用于各種工業和大量產品中，本領域仍然需要在這些工業中的通常條件下穩定的葡糖氧化酶。實際上，用于穩定該酶的方法的大多數^l道均涉及在生物傳感器中使用固定化的葡糖氧化酶。因此，仍然需要用于其他工業用途的能穩定儲存的葡糖氧化酶。發明概述本發明提供方法和包含至少一種葡糖氧化酶的組合物，其中葡糖氧化酶具有改善的儲存穩定性。在一些優選的實施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高溫后仍是穩定的。在一些備擇的優選實施方案中，葡糖氧化酶在液體制劑中具有改善的儲存穩定性。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供方法和包含從曲霉屬物種獲得的葡糖氧化酶的組合物。在一些更特別優選的實施方案中，從黑曲霉獲得葡糖氧化酶。發現本發明可用于涉及清潔的應用中。本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的纟且合物。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、抗壞血酸、葡萄糖或焦磷酸四鉀。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該增強儲存穩定性的化合物包含含18.5%氯化鈉、1.3。/。磷酸二氫鈉二7jC合物及2.5%檸檬酸三鈉二水合物的溶液以及至少一種另外的增強儲存穩定性的化合物，其選自焦磷酸四鉀、硫酸銨、酒石酸銨或焦砩酸四鈉。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中在大約4ox:儲存大約io周后該組合物保留至少大約15%的初始活性。在另外的實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中在大約40'C儲存大約10周后該組合物保留至少大約30%的初始活性。在另外的實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中在大約40'C儲存大約10周后該組合物保留至少大約50%的初始活性。6在另外其它的實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中在大約40"C儲存大約10周后該組合物保留至少大約70%的初始活性。本發明進一步提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該組合物是個人護理組合物。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該組合物儲存在pH范圍為大約5.0至大約7之后是穩定的。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該組合物儲存在大約pH7之后是穩定的。在另外其它的實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該組合物儲存在溫度范圍為大約4'C至大約50"C之后是穩定的。在一些實施方案中，本發明提供包含葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物，其中該組合物儲存在溫度范圍為低于大約4'C至大約4(TC之后是穩定的。本發明也提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物。在一些實施方案中，本發明提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物，其中該至少一種增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞石危酸氫鹽、抗壞血酸和葡萄糖。在另外的實施方案中，本發明提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物，其中該組合物包含至少兩種增強儲存穩定性的化合物，且其中至少一種所述增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞疏酸氫鹽、抗壞血酸、葡萄糖和焦磷酸四鉀。在一些實施方案中，本發明提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物，其中該組合物包含含18.5%氯化鈉、1.3%磷酸二氬鈉二水合物及2.5%檸檬酸三鈉二水合物的溶液以及至少一種另外的增強儲存穩定性的化合物，其選自焦磷酸四鉀、硫酸銨、酒石酸銨和焦磷酸四鈉。在一些實施方案中，本發明提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物，其中該組合物在大約40r儲存大約10周是穩定的。在一些實施方案中，本發明提供用于穩定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物，其中該組合物是個人護理組合物。圖1:提供了顯示相對于儲存于4。C的OXYGOHPL5000的活性，當儲存于40。C時在20mM檸檬酸鹽、20mM磷酸鹽pH6.0中的葡糖氧化酶樣品的活性的圖。實線代表由數據最佳擬合為等式1所確定的活性值。在第IO周時測定殘余活性值，以利于與其他樣品的穩定性的功能比較。圖2:提供了顯示相對于儲存于4匸的OXYGOHPL5000的活性，當儲存于40匸時以BaseA配制的葡糖氧化酶樣品的活性的圖。實線代表由數據最佳擬合為等式1所測定的活性值。在第10周時測定殘余活性值，以利于與其他樣品的穩定性的功能比較。圖3:提供了顯示相對于儲存于4匸的OXYGOHPL5000的活性，當儲存于40。C時用2.4%焦磷酸四鉀和BaseA配制的葡糖氧化酶樣品的活性的圖。實線代表由數據最佳擬合為等式l所測定的活性值。在第10周時測定殘余活性值，以利于與其他樣品的穩定性的功能比較。圖4:提供了顯示相對于儲存于4'C的OXYGOHPL5000的活性，當儲存于40。C時配制于33%葡萄糖酸鈉中的葡糖氧化酶樣品的活性的圖。實線代表從數據最佳擬合為等式1所測定的活性值。在第10周時測定殘余活性值，以利于與其他樣品的穩定性的功能比較。圖5A和圖5B:提供了顯示40'C儲存10周后殘余活性值的百分比的圖，該值計算自非線性最小二乘法回歸分析擬合的等式1所測定的速率常數k的值。發明詳述本發明提供方法和包含至少一種葡糖氧化酶的組合物，其中葡糖氧化酶具有改善的儲存穩定性。在一些優選的實施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高溫后是穩定的。在一些^^擇的優選實施方案中，葡糖氧化酶在液體制劑中具有改善的儲存穩定性。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供方法和包含從曲霉屬物種獲得的葡糖氧化酶的組合物。在一些更特別優選的實施方案中，從黑曲霉獲得葡糖氧化酶。本發明發現了在涉及清潔的應用中的用途。在一些特別優選的實施方案中，本發明發現了在個人護理產品和應用中的用途。除非另外指明，本發明的實施涉及分子生物學、微生物學、蛋白質純化、制劑開發等學科中通常使用的常規技術，其在本領域技術人員所掌握的技術之內。所有本文上下文中提及的專利、專利申請、文章和出版物在此通過明確地引用而合并于本申請。此外，本文提供的標題并不限制本發明的各個方面或實施方案，它們可以通過整體參考"i兌明書而獲得。因此，通過整體參考說明書而更全面地限定下面緊接著的術語。然而，為了利于理解本發明，下文定義了許多術語。定義除非本文另外定義，本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的意思相同的意思。例如，SingletonandSaiiisbury，Z)/",V""ry6>/M/m6/o/ogvflficfMo/ec"/"r5/0/6^v，第二版，JohnWileyandSons,NY(1994)和HaleandMarham，7TieHar戸Co///wsZ)/"/ow，必/o/柳，HarperPerennial,NY(1991)為本領域技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般性詞典。盡管發現了類似于或等同于本文公開的方法和材料的任何方法和材料可用于實施本發明，但是本文公開了優選的方法和材料。因此，通過整體參考說明書而更全面地限定下面緊接著的術語。同樣，除非上下文清楚地另外指明，如本文所用的單數形式的術語"一"和"該"涵蓋復數形式。除非另外指明，核酸以5，到3，的方向從左到右書寫，M酸序列以氛基到氛基的方向從左到右書寫。應理解，本發明不限于公開的具體方法學、操作方案和試劑，本領域技術人員可根據它們所用的上下文而改變它們。本說明書中給出的每一個最大數值限定均旨在包括每一個較小的數值限定，就如同本文明確書寫了該較小的數值限定一樣。本說明書中給出的每一個最小數值限定均包括每一個較大的數值限定，就如同本文明確書寫了該較大的數值限定一樣。本說明書中給出的每個數值范圍將包括落入該較寬數值范圍內的每個較窄的數值范圍，就如同本文明確書寫了該較窄的數值范圍一樣。在相關部分引用的所有文檔均通過引用整合于本文；引用的任何文檔并不被解釋為認可其為關于本發明的現有技術。如本文所用，"OXYGO"和"OXYGOHPL5000"指可以名稱"OXYGOHPL5000"從Genencor商業購買的包含純化的葡糖氧化酶的產品。該酶是高度純化的黑曲霉葡糖氧化酶，其源自經遺傳修飾的黑曲霉菌林。如本文所用，術語"葡糖氧化酶活性單位"指以每ml的滴定單位("Titr.U"或"U")表達的葡糖氧化酶活性。一個滴定單位將在15分鐘內將3.0mg葡萄糖氧化為葡糖酸，測定條件為pH5.1，35"C。將獲得的OXYGOHPL5000的值用作下面提供的測定的校準標準。如本文所用，術語"增強穩定性的化合物"指賦予組合物中的葡糖氧化酶穩定性和/或改善的穩定性的化合物。在特別優選的實施方案中，該術語用于指在大約40。C儲存大約10周時提供改善的穩定性的化合物。然而，這并非指本發明將限于這些條件，因為該術語旨在包括與缺少該化合物時的葡糖氧化酶相比提供給葡糖氧化酶改善的穩定性的化合物。如本文所用，"化妝品組合物"指可用于化妝品中的組合物。本文使用"食品、藥品和化妝品法案(TheFoodDrugandcosmeticAct(FD&CAct))"的定義。因此，按化妝品預期的用途將其定義為經擦涂、傾倒、噴灑或噴射、導入或其它施用到人體的方式而用于清潔、美化、提高魅力或改變外表的物品。這些組合物提供非治療性益處并且不作為藥物進行管理。然而，在一些情況下，將化妝品組合物合并入藥物組合物中以提供化妝的益處(如治療皮膚或毛發疾病的產品，但其也包含用于提供其色彩或其他益處的化妝品組合物)。并且，本發明旨在包括在除人外的動物上使用的化妝品。如本文所用，術語"個人護理組合物"和"個人護理產品"指應用到皮膚、毛發、指甲、口腔及相關的膜上而用于改善、清潔、美化、處理和/或護理這些表面和膜的目的的組合物和/或產品。在一些特別優選的實施方案中，在人上4吏用這些產品，而在其他實施方案中，這些產品在非人動物上使用(如在獸醫應用中)。除非另外指明，如本文所用的"清潔組合物"和"清潔制劑"指用于從待清潔的物項如織物、盤皿、隱形眼鏡、其他固體襯底上去除不希望有的化合物的組合物。該術語包括為目標清潔組合物的特定類型及該產品的形式(如液體、凝膠、顆粒或噴霧組合物)選擇的任何物質/化合物，只要該組合物與該組合物中使用的葡糖氧化酶和其他酶相容。如本文所用，術語"相容，，指清潔組合物物質不降低葡糖氧化酶的酶ii活性到在正常使用情況過程中所期望的無效的程度。在下文詳細列舉了特定的清潔組合物物質。如本文所用，"有效量的酶"指獲得在特定應用(如個人護理產品、清潔組合物等)中所需的酶活性所必需的酶量。本領域普通技術人員可容易地確定這樣的有效量并且這樣的有效量基于許多因素，如使用的特定酶變種、清潔應用、清潔組合物的特定組成及是否需要液體的或干的(如顆粒、棒)組合物等。如本文所用，"非織品清潔組合物"包括硬表面清潔組合物、洗碗組合物、個人護理清潔組合物和適用于紙漿和造紙工業的組合物。如本文所用，術語"酶促轉化"指通過將底物或中間產物與酶接觸將底物修飾為中間產物或將中間產物修飾為終產物。在一些實施方案中，通過將底物或中間產物直接暴露到適當的酶完成接觸。在其他實施方案中，接觸包含將底物或中間產物暴露于生物體，所述生物體表達和/或分泌該酶，和/或分別代謝目標底物和/或中間產物為目標中間產物和/或最終產物。如本文所用，短語"對蛋白水解的穩定性"指蛋白質(如酶)抵抗蛋白水解的能力。該術語并不旨在局限于使用任何特定葡糖氧化酶以評價蛋白質的穩定性。如本文所用，"抗氧化性"指蛋白質在氧化性條件下孵育后仍起作用的能力。如本文所用，"pH穩定性，，指蛋白質在特定pH孵育后仍起作用的能力。在一些優選的實施方案中，本發明的葡糖氧化酶在暴露到大約5至大約7的pH范圍后仍能起作用。然而，本發明并不旨在局限于任何特定pH穩定性水平也不局限于pH范圍。如本文所用，"熱穩定性，，指蛋白質在特定溫度孵育后起作用的能力。在一些優選的實施方案中，本發明的葡糖氧化酶能在暴露到大約4'C至大約50匸的溫度范圍后仍能起作用。在一些特別優選的實施方案中，本發明的葡糖氧化酶能在暴露到從低于大約4'C至大約40。C的溫度范圍后仍起作用。然而，本發明并不旨在局限于任何溫度穩定性水平也不局限于溫度范圍。如本文所用，術語"化學穩定性"指蛋白質(如酶)在暴露到負性影響蛋白質活性的化學品后的穩定性。本發明并不旨在局限于任何特定化學穩定性水平也不局限于化學穩定性的范圍。如本文所用，"表面性質"用于指蛋白質表面所呈現的靜電荷以及如疏水性和/或親水性的性質。如本文所用，術語"純化，，和"分離"指從樣品去除污染物。例如，通過去除溶液或制備物中不是葡糖氧化酶的污染蛋白質和其他化合物而純化了葡糖氧化酶。在一些實施方案中，重組葡糖氧化酶在細菌或真菌宿主細胞中表達，通過去除其他宿主細胞成分純化這些重組葡糖氧化酶；借此增加了樣品中重組葡糖氧化酶多肽的百分比。在特別優選的實施方案中，如通過SDS-PAGE或其他本領域公知的標準方法所測定的，將本發明的葡糖氧化酶基本上純化到蛋白質組分至少大約99%的水平。在一些備擇的優選實施方案中，本發明的葡糖氧化酶包含組合物至少大約99%的葡糖氧化酶組分。仍是在備擇的實施方案中，葡糖氧化酶以總蛋白的大約至少90-95%的范圍存在。然而，本發明并不旨在局限于特定純度水平的葡糖氧化酶。例如，在一些實施方案中，使用所需的純度水平處于大約75%至大約80。/。的范圍。因此，在一些實施方案中，本發明的葡糖氧化酶在非常低的純度水平有用。在一些備擇的實施方案中，由于組合物中的過氧化氫酶濃度足夠低到不破壞葡糖氧化酶反應的產物(即H202)，因此葡糖氧化酶是"純化"的。如本文所用，"目標蛋白質"指分析、鑒定和/或修飾的蛋白質(如酶或"目標酶")。天然發生的以及重組的蛋白質均可用于本發明。如本文所用，"蛋白質"指任何由氨基酸組成并被本領域技術人員認為是蛋白質的組合物。在本文中，可替換地^f吏用術語"蛋白質，，、"肽，，和"多肽"。其中肽是蛋白質的一部分，本領域技術人員將理解在上下文中使用的該術語。如本文所用，認為功能上和/或結構上相似的蛋白質是"相關蛋白質"。在一些實施方案中，這些蛋白質源自不同的屬和/或種，包括生物的綱之間的差異(如細菌蛋白質和真菌蛋白質)。在一些實施方案中，這些蛋白質源自不同的屬和/或種，包括生物的綱之間的差異(如細菌酶和真菌酶)。在其他實施方案中，^M目同種提供相關蛋白質。實際上，本發明并不旨在局限于來源于任何特定來源的相關蛋白質。此外，術語"相關蛋白質"包括三級結構同源物和一級序列同源物(如本發明的葡糖氧化酶)。在其他實施方案中，該術語包括具有免疫交叉活性的蛋白質。發明詳述本發明提供方法和包含至少一種葡糖氧化酶的組合物，其中葡糖氧化酶具有改善的儲存穩定性。在一些優選的實施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高溫后是穩定的。在一些備擇的優選實施方案中，葡糖氧化酶在液體制劑中具有改善的儲存穩定性。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供方法和包含從曲霉屬物種獲得的葡糖氧化酶的組合物。在一些更特別優選的實施方案中，從黑曲霉獲得葡糖氧化酶。發現本發明可用于涉及清潔的應用中。在一些實施方案中，葡糖氧化酶在一些個人護理產品中作為活性成分的使用需要證明該酶在高溫(如大約4ox:)延長的時期內儲存是穩定的。食品和藥物管理局(FDA)基于如通過穩定性試趙參見例如21C.F.R.211)所測定的活性成分的穩定性設立了產品保質期的要求。因此，在一些特別優選的實施方案中，符合了FDA提出的活性成分穩定性的儲存穩定性要求。然而，這并非指本發明局限于任何特定儲存溫度。葡糖氧化酶活性的喪失能起因于多種酶的損傷。然而，在研發本發明時，據測定，還原性試劑(如偏亞硫酸氫鹽、P-巰基乙醇和抗壞血酸)的加入連同過氧化氫酶的加入改善了葡糖氧化酶的穩定性。在一些實施方案中，據認為，還原性試劑和過氧化氫酶的組合提供的協同益處提供了協同效果。也發現加入高濃度葡糖酸鹽穩定了葡糖氧化酶活性。此外，其他多元醇也具有穩定效應，包括但不限于聚乙二醇、山梨醇、甘油和過氧化氬酶的組合(參見例如下面的表l)。在優選的實施方案中，使用至少一種多元醇來穩定本發明的葡糖氧化酶。在本發明中發現有用的多元醇的例子包括但不限于聚環氧烷類(PAO)、聚(亞烷基)二醇類(PAG)、聚亞甲基二醇類、聚乙二醇類(PEG)、甲氧基聚乙二醇類(mPEG)、聚丙二醇類、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯-共-馬來酸酸酐、聚苯乙烯-共-蘋果酸酸酐、葡聚糖類(如羧甲基-葡聚糖類)、纖維素類(如曱基纖維素、羧曱基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素及羥丙纖維素)、殼聚糖水解物、淀粉類(如羥乙基淀粉類和羥丙級淀粉類)、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、出芽短梗霉聚糖、菊粉、黃原膠、角叉菜聚糖、果膠(pectinc)、藻酸水解物、生物聚合物類、山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、古洛糖、木糖、蘇糖、山梨糖、果糖、甘油、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、淀粉酶、支鏈淀粉和單丙烯乙二醇(mono-propyleneglycol);葡糖酸鹽(如葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉀)。在一些實施方案中，本發明的組合物包含至少一種聚合物和/或糖。合適的聚合物包括但不限于聚環氧烷(PA)、聚(亞烷基)二醇(PAG)和聚丙二醇。在一些其他實施方案中，本發明的組合物包含至少一種其他成分。在一些實施方案中，該其他成分選自抗微生物劑、pH調節劑、分散劑、粘度調節劑和抗氧化劑。如本文所用，"抗微生物劑"指殺死、抑制或阻止微生物生長的化合物，所述微生物包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲。在一些實施方案中，抗微生物劑包括化學制劑，其包括但不限于苯甲酸鈉、山梨酸鉀和對羥苯甲酸類。該術語也包括任何合適的抗生素(即微生物產生的抗菌劑及此類合適抗生素的合成類似物)。如本文所用，"M劑"是幫助預防或延遲經^*的固體物質的分離(如沉淀)的化合物。合適的*劑包括但不限于某些精細分開的粘土(如高嶺土、白陶土、皂粘土、漂白土等)以及"解絮凝聚合物，，和陰離子聚合物類型的兩性物質。如本文所用，"pH調節劑"指當將本發明的組合物與水性介質接觸時，幫助調整和/或維持(即緩沖)介質的pH以便提供與該組合物的對pH敏感的成分相容的pH值的化合物。合適的pH調節劑包括但不限于各種無水的無機和有機鹽(如磷酸二氫郜、碳酸氬鈉、乙酸鉀、乙酸鈉和檸檬酸二氫鉀)、甘氨酸緩沖劑和Tris-鈉緩沖劑。如本文所用，"抗氧化劑"指能保護本發明一些實施方案中組合物的對氧化敏感的成分抗氧化(例如通過大氣氧)的化合物。然而，在一些實施方案中，氧化也能通過制劑的其他成分由11202或由11202產生的氧自由基而發生。合適的抗氧化劑包括但不限于甲硫氨酸和卵鱗脂。在本發明研發的過程中，將低濃度的化學品加到BaseA中的葡糖氧化酶和BaseB中的葡糖氧化酶(參見下文)。這些化學品包括表面活性劑、螯合劑、聚合物、離液鹽、緩沖劑、還原劑、慢底物(slowsubstrate)、最終產物、過氧化氫酶及這些試劑的組合。此外，將聚合物類、糖醇類、糖類和葡萄糖酸鈉用作葡糖氧化酶制劑中的賦形劑。發現這些方法的一些提供了葡糖氧化酶的穩定性益處。盡管在本發明研發過程中使用了OXYGO⑧中的葡糖氧化酶，這并非指本發明局限于該特定的葡糖氧化酶，因為發現本發明可用于任何葡糖氧化酶。此外，據認為將發現本發明可用于穩定其他結合葡萄糖的酶中，所述酶包括但不限于寡葡萄糖(glucooligosaccharide)氧化酶、己糖氧化酶、乳糖氧化酶和吡喃糖氧化酶。此外，據1^人為將發現本發明用于穩定山梨醇氧化酶。實際上，本發明將并不旨在局限于任何特定的酶。在一些特別優選的實施方案中，發現葡糖酸鹽在穩定多種酶的活性位點中有用，從而增加了在高溫中維持了延長時期的酶的穩定性。然而，本發明并不旨在局限于任何特定的反應機理。實施例為了證明并進一步舉例說明本發明的一些優選實施方案和方面提供了下述實施例，不應將其解釋為限制本發明的范圍。在下面實驗公開中使用了下述縮寫形式1C(攝氏度度)；rpm(每分鐘轉數)；H20(水)；HC1(鹽酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；jig和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；nl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；iim和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；nM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分鐘)；hr(小時)；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD28。(在280nm處的光密度)；OD卿(在600nm處的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸緩沖鹽溶液[150mMNaCl，lOmM磷酸鈉緩沖劑，pH7,2j);SDS(十二烷基磺酸鈉)；Tris(三(羥曱基)氛基甲烷)；Genencor(Genencor，PaloAIto，CA);MolecularDevices(MolecularDevices,Corp.,Sunnyvale,CA);Amersham(AmershamLifeScience,Inc.,ArlingtonHeights,IL);Corning(CorningInternational,Corning,NY);ICN(ICNPharmaceuticals,Inc.,CostaMesa,CA);Pierce(PierceBiotechnology,Rockford,IL);Amicon(Amicon,Inc.,Beverly,MA);ATCC(美國典型培養物中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas,VA);BectonDickinson(BectonDickinsonLabware，LincolnPark,NJ);Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA);Waters(Waters,Inc.,Milford，MA);PerseptiveBiosystems(PerseptiveBiosystems,Ramsey,MN);Difco(DifcoLaboratories,Detroit,MI);GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg，MD);Novagen(Novagen，Inc.,Madison,WI);Novex(Novex，SanDiego,CA);Sigma(Sigma-AldrichChemicalCo"St.Louis,MO);DuPontInstruments(Asheville,NY);GlobalMedicalInstrumentation或GMI(GlobalMedicalInstrumentation;Ramsey,MN);Agilent(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)。在下述實施例中，使用了在OXYGOHPL5000(Genencor)中發現17的黑曲霉葡糖氧化酶。通過和20mM磷酸鹽、2mM檸檬酸鹽緩沖劑pH6.0的交換的充分透析(extensivedialysis)從酶中去除鹽。然后將該透析后物質濃縮到大約15000單位/ml。或者直接將穩定組分加到OXYGOHPL5000中至給定濃度以使OXYGOHPL5000的稀釋不超過15%,或者將其加到上述透析后的葡糖氧化酶濃縮物中以使最終的酶濃度為大約5000單位/ml。將這些新配制的樣品和最初的OXYGOHPL5000(在1.5ml微量離心管中的lml體積)置于40X:并孵育確定的時間。以大約一周、兩周、四周和八周的時間間隔獲取這些樣品的小的等份樣(17nl)。將這些等份樣連續稀釋14641倍到含0.05%TWEEN-20的100mM礴酸鹽緩沖劑pH7.0中并立即測量葡糖氧化酶的活性。葡糖氧化酶活性的方案每日制備試劑混合物，其含2.74mg/mlABTS(2，2，-連氮-雙-(3-乙基苯并噢唑啉-6-磺酸)，SigmaA1888-5g)、100mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)、50mM葡萄糖和2.5紅掊酚單位/ml的辣根過氧化物酶(Sigma)。通過用100mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)將OXYGOHPL5000從5000U/ml稀釋到0.4-0.5U/ml并包括緩沖劑空白制備了葡糖氧化酶標準品。將酶樣品稀釋到標準曲線范圍內的預期濃度。將SpectraMax250分光光度計(MolecularDevices)設置為動力學分析，在取樣前混合并在405nm處讀取。為了讀取，將95ul的反應混合物轉移到清潔的平底96孔微孔板(MTP)。然后，將5ul稀釋的酶樣品或葡糖氧化酶標準品加到MTP中的反應混合物中。然后將MTP置于分光光度計中并在室溫以30秒時間間隔讀取5分鐘。將吸光度數據歸納為作為時間函數的吸光度改變的斜率。利用4X:(即已經顯示保持100%殘余活性的條件)儲存的OXYGOHPL5000的線性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表l受試的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表l受試的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表l受試的組合物樣品編號組成40匸儲存10周保留的百分比561.9%偏亞石危酸氬鈉和BaseA4.85740%丙二醇、1%十二烷基磺酸鈉、2mM維生素E2.7582mM抗壞血酸和BaseB1.85934%丙二醇、20mM檸檬酸鹽、20mM磷酸鹽pH6.01.86010%葡糖酸鹽、2.4%焦磷酸四鉀1.76140%蔗泮唐1.762lOOmM山梨糖和BaseA1.56340%丙二醇、1%2(3)小丁基-4-羥基苯甲醚、2mMD-曱硫氨酸1.26440%甘油0.76540%麥芽糖0.66640%木糖0.46740%山梨糖醇0.26840%山梨糖醇、3%葡萄糖0.16944%聚乙二醇600、14mM褲酸氫二鈉、77mM磷酸二氫鉀0.170500mM檸檬酸銨和BaseA0.0471含400mM檸檬酸鹽的40%山梨糖醇0.00272BaseB0.07310。/。葡糖酸內酯和BaseA0.022"BaseA"含18.5%氯化鈉、1.3%磷酸二氬鈉二7片合物和2.5%檸檬酸三鈉二7jC合物。"BaseB，，含43%山梨糖醇、3%甘油、5g/1的氯化鈉和50mM磷酸二氫鉀，調節pH至5.4。于各個孵育時間儲存于40。C的每個樣品經測量的活性值除以各自相應孵育時間的儲存于4'C的所有OXYGOHPL5000樣品經測量的平均活性值。在該分析中，值'T，表明沒有活性損失(即100%殘余活性)，而低于'T，的值表明樣品具有活性損失。相對于儲存于4"C的樣品將儲存于40。C的樣品的活性值擬合為簡單的指數式衰減(等式l):A—。一htK")在等式1中，"A"代表在40X:儲存的樣品經測量的活性，"Ao"代表在4。C儲存的樣品經測量的活性，"k"代表描述活性損失的速率常數，及"t"代表儲存在40"C的樣品的孵育持續時間。圖1、圖2、圖3和圖4通過使用本領域公知的非線性最小二乘法回歸分析提供了擬合為等式1的數據。根據在測試期內收集的所有數據，通過使用等式1和非線性最小二乘法回歸分析測定了每個樣品的速率常數"k"的值。根據測定的速率常數的值計算了IO周時殘余活性的百分比。在圖5A和5B中提供了表l中描述的樣品在40'C儲存10周后殘余活性的百分比。這些結果清楚地表明葡萄糖酸鈉提供了所有受試組合物極好的儲存穩定性，盡管偏亞石危酸氫鹽和抗壞血酸、過氧化氫酶、葡萄糖和葡糖酸鹽的組合以及其他組合提供也提供了儲存穩定性益處。權利要求1、包含至少一種葡糖氧化酶和至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物的組合物。2、權利要求l的組合物，其中所述至少一種或兩種增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、抗壞血酸、葡萄糖和焦磷酸四鉀。3、權利要求1的組合物，其中所述增強儲存穩定性的化合物包含18.5%氯化鈉、1.3%磷酸二氫鈉二水合物及2.5%無水檸檬酸三鈉的溶液以及至少一種另外的增強儲存穩定性的化合物，其選自焦磷酸四鉀、硫酸銨、酒石酸銨和焦磷酸四鈉。4、權利要求1的組合物，其中所述組合物在大約40'C儲存大約10周后保留了其初始活性的至少大約15%。5、權利要求1的組合物，其中所述組合物在大約40"C儲存大約10周后保留了其初始活性的至少大約30%。6、權利要求1的組合物，其中所述組合物在大約40"C儲存大約10周后保留了其初始活性的至少大約50%。7、權利要求1的組合物，其中所述組合物在大約40X:儲存大約10周后保留了其初始活性的至少大約70%。8、權利要求l的組合物，其中所述組合物是個人護理組合物。9、權利要求1的組合物，其中所述組合物在大約5.0至大約7的pH范圍儲存后是穩定的。10、權利要求l的組合物，其中所述組合物在大約pH7儲存后是穩定的。11、權利要求l的組合物，其中所述組合物在大約4。C至大約50'C的溫度范圍儲存后是穩定的。12、權利要求l的組合物，其中所述組合物在低于大約4。C至大約40°C的溫度范圍儲存后是穩定的。13、穩定組合物中葡糖氧化酶的方法，其包含a)提供葡糖氧化酶和至少一種增強穩定性的化合物；及b)組合所述葡糖氧化酶和所述至少一種增強穩定性的化合物以產生穩定化的葡糖氧化酶組合物。14、權利要求13的方法，其中所述至少一種增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、抗壞血酸和葡萄糖。15、權利要求13的方法，其中所述組合物包含至少兩種增強儲存穩定性的化合物，其中至少一種所述增強儲存穩定性的化合物選自葡糖酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、抗壞血酸、葡萄糖和焦磷酸四鉀。16、權利要求13的方法，其中所述組合物包含18.5%氯化鈉、1.3%磷酸二氫鈉二水合物及2.5%檸檬酸三鈉二水合物的溶液以及至少一種另外的增強儲存穩定性的化合物，其選自焦磚酸四鉀、硫酸銨、酒石酸銨和焦磷酸四鈉。17、權利要求13的方法，其中所述組合物在大約40'C儲存大約10周是穩定的。18、權利要求13的方法，其中所述組合物是個人護理組合物。全文摘要本發明提供包含至少一種葡糖氧化酶的方法和組合物，其中葡糖氧化酶具有改善的儲存穩定性。在一些優選的實施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高溫后是穩定的。在一些備擇的優選實施方案中，葡糖氧化酶在液體制劑中具有改善的儲存穩定性。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供包含從曲霉屬獲得的葡糖氧化酶的方法和組合物。在一些更特別優選的實施方案中，從黑曲霉獲得葡糖氧化酶。發現本發明可用于涉及清潔，包括個人護理應用的應用中。文檔編號A61Q90/00GK101558153SQ200780046498公開日2009年10月14日申請日期2007年12月18日優先權日2006年12月20日發明者B·R·凱萊門,S·E·蘭茨申請人:丹尼斯科美國公司