專利名稱：高甘露糖蛋白質和產生高甘露糖蛋白質的方法
背景技術：
戈謝病(Gaucher病)是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCB)缺乏。GCB水解在白細胞和紅細胞膜中地鞘糖脂降解后形成的糖脂葡糖腦苷脂。該酶的缺乏導致葡糖腦苷脂在位于戈謝病患者的肝臟、脾臟和骨髓中的吞噬細胞溶酶體中大量積累。這些分子的積累引起多種臨床表現，包括脾腫大、肝腫大、骨骼疾病、血小板減少和貧血(Beutler等人，戈謝病；《遺傳性疾病的代謝和分子基礎》(McGraw-Hill，Inc.，紐約，1995)，第2625-2639頁)。
該病患者的治療包括施用止痛劑以緩解骨痛、血液和血小板輸注，以及某些情況下的脾切除術。對于骨腐爛的患者關節置換術有時也是必要的。
用GCB進行酶置換治療已經作為戈謝病的一種療法。當前對戈謝病患者的治療包括施用碳水化合物重建(remodel)的GCB，它來源于人胎盤或用GCB表達構件轉染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，分別被稱為阿糖苷酶(alglucerase)或imiglucerase。這種治療極其昂貴，部分是由于為了將該酶導向網狀內皮來源細胞上的甘露糖受體，從GCB中除去糖以暴露復合聚糖的三甘露糖基核心的成本。人胎盤組織的缺乏(在阿糖苷酶情況中)、復雜純化方案和需要的相對大量的碳水化合物重建的GCB全都計入治療成本。
發明概述
本發明部分基于以下發現，防止去除遠離蛋白質(如一種溶酶體貯積酶)前體寡糖鏈五糖核心的一個或多個甘露糖殘基，能獲得高甘露糖蛋白質，如高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)。這些高甘露糖蛋白質能用來將蛋白質導向表達甘露糖受體的細胞。這些細胞包括網狀內皮來源的細胞，包括巨噬細胞、枯否細胞和組織細胞。因此，這些高甘露糖蛋白質能用來例如將受體介導的胞吞輸送定向溶酶體，以治療多種溶酶體貯積病。
特別是，已經發現hmGCB可有效地定向甘露糖受體。甘露糖受體存在于巨噬細胞和其它細胞(如樹突細胞、心肌細胞和神經膠質細胞)上，有助于受體介導的胞吞。戈謝病患者中GCB的缺乏導致葡糖腦苷脂主要在網狀內皮來源的細胞(包括巨噬細胞、枯否細胞和組織細胞)中積累。由于這些細胞在其表面表達甘露糖受體，能用hmGCB通過受體介導的胞吞作用將校正酶的輸送有效地定向溶酶體，從而治療戈謝病。令人驚訝的是，發現巨噬細胞對hmGCB的攝取比細胞分泌的GCB的攝取增多。
因此，一方面，本發明表征一種生產高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)制劑的方法。該方法包括
提供一種能表達GCB的細胞；和
在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產含有前體寡糖的GCB，從而生產一種hmGCB制劑。
在一個優選實施方案中，GCB是人GCB。在一個優選實施方案中，細胞是人細胞。
在一個優選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基；遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法包括使細胞接觸一種物質，該物質可防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，例如防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基，遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基和/或遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法包括使細胞接觸一種物質，該物質可防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，其中該物質是一種甘露糖苷酶抑制劑。該甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或此兩者。1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制劑中的一種或多種。優選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。有用的2類加工甘露糖苷酶抑制劑可包括苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-1，4-雙脫氧-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇(6-脫氧-DIM)和6-脫氧-6-氟-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇(6-脫氧-6-氟-DIM)中的一種或多種。優選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
在一個優選實施方案中，甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在。
在一個優選實施方案中，該方法還包括使細胞接觸1類加工甘露糖苷酶抑制劑和2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為0.025-40.0μg/ml、0.05-20μg/ml、0.05-10μg/ml，優選地約0.1-4.0μg/ml。
在一個優選實施方案中，細胞具有至少一種高爾基體加工甘露糖苷酶的突變，如敲除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質或活性水平，或改變甘露糖苷酶分布，或其它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基體加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優選實施方案中，該突變是敲除，例如甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結構(和蛋白質活性)，例如可以是一種溫度敏感突變或截短。在一個優選實施方案中，細胞具有1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘露糖苷酶、1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的突變，例如敲除。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；或其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，細胞包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它能結合或滅活一種細胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質的表達。在一個優選實施方案中，該核酸序列是1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；及其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，細胞包含一種可結合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
在一個優選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優選地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
在一個優選實施方案中，產生的hmGCB(一種或多種hmGCB分子或整個制劑)中甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優選地，甘露糖與GlcNAc之比為4∶2、5∶2、6∶2、7∶2、8∶2、9∶2，更優選地，甘露糖與GlcNAc之比為5∶2、8∶2或9∶2。
在一個優選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，制劑中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部的hmGCB分子含有至少1條、優選地2條、3條或4條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優選地，除了五糖核心外，hmGCB中不到80％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的糖鏈含有相同數量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數量甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數量甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；50％∶50％；40％∶60％；30％∶70％；25％∶75％；20％∶80％；15％∶85％；10％∶90％；5％或更低∶95％或更高。
在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的糖鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶I的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；70％∶30％；75％∶25％；80％∶20％；85％∶15％；90％∶10％；95％∶5％；99％∶1％；或100％∶0％。
在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的糖鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；70％∶30％；75％∶25％；80％∶20％；85％∶15％；90％∶10％；95％∶5％；99％∶1％；或100％∶0％。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種含有GCB編碼區的外源核酸序列。在一個優選實施方案中，細胞還包含一種調節序列，一種內源或外源調節序列，其作用是調節外源GCB編碼區的表達。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種外源調節序列，其作用是調節內源GCB編碼序列的表達，例如，調節序列整合到細胞基因組中，使其調節內源GCB編碼序列的表達。
在一個優選實施方案中，調節序列包括下列之一種或多種啟動子、增強子、上游激活序列(UAS)、支架結構附著區或轉錄因子結合位點。在一個優選實施方案中，調節序列包括來自金屬硫蛋白-I基因(例如小鼠金屬硫蛋白-I基因)的調節序列、來自SV-40基因的調節序列、來自巨細胞病毒基因的調節序列、來自膠原蛋白基因的調節序列、來自肌動蛋白基因的調節序列、來自免疫球蛋白基因的調節序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調節序列，或來自EF-1α基因的調節序列。
在一個優選實施方案中，該細胞是一種真核細胞。在一個優選實施方案中，細胞是真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優選實施方案中，該細胞是一種哺乳動物細胞，例如初級或次級哺乳動物細胞，例如成纖維細胞、造血干細胞、成肌細胞、角化細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、含有血液有形成分的細胞、肌細胞和這些體細胞的前體；轉化的或無限增殖化細胞系。優選地，該細胞是人細胞。在本方法中有用的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細胞(ATCC保藏號CRL9607)、Daudi細胞(ATCC保藏號CCL213)、HeLa細胞和HeLa細胞衍生物(ATCC保藏號CCL2 CCL2.1和CCL2.2)、HL-60細胞(ATCC保藏號CCL240)、HT-1080細胞(ATCC保藏號CCL121)、Jurkat細胞(ATCC保藏號TIB152)、KB癌細胞(ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細胞(ATCC保藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC保藏號BTH22)、MOLT-4細胞(ATCC保藏號1582)、Namalwa細胞(ATCC保藏號CRL1432)、Raji細胞(ATCC保藏號CCL86)、RPMI8226細胞(ATCC保藏號CCL155)、U-937細胞(ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細胞(ATCC保藏號CCL155)、CCRF-CEM細胞(ATCC保藏號CCL119)和2780AD卵巢癌細胞(Van Der Blick等人，Cancer Res.485927-5932，1988)，以及人細胞與其它種的細胞融合產生的雜交瘤細胞。在另一個實施方案中，無限增殖化細胞系可以是人細胞系之外的細胞系，如CHO細胞系、COS細胞系。在另一個實施方案中，細胞可以來自克隆細胞株或克隆細胞系。
在一個優選實施方案中，提供能表達hmGCB的細胞群體，至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部細胞產生至少含有1條糖鏈、優選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數量的甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，細胞在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養。在一個優選實施方案中，該方法還包括從培養細胞的培養基中獲得hmGCB。
另一方面，本發明表征了一種生產hmGCB制劑的方法。該方法包括
提供一種能表達GCB的細胞；和
在抑制I類加工甘露糖苷酶活性和2類加工甘露糖苷酶活性以防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產含有前體寡糖的GCB，從而生產hmGCB制劑。
在一個優選實施方案中，GCB是人GCB。在一個優選實施方案中，細胞是人細胞。
在一個優選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基；防止去除遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法可包括使細胞接觸一種抑制1類加工甘露糖苷酶活性的物質和一種抑制2類加工甘露糖苷酶活性的物質，從而防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，這些物質防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法包括使細胞接觸一種抑制1類加工甘露糖苷酶活性的物質和一種抑制2類加工甘露糖苷酶活性的物質，其中這些物質是1類加工甘露糖苷酶抑制劑和2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制劑中的一種或多種。優選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM和6-脫氧-6-氟-DIM中的一種或多種。優選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為0.025-40.0μg/ml、0.05-20μg/ml、0.05-10μg/ml、優選地約0.1-4.0μg/ml。
在一個優選實施方案中，細胞具有1類甘露糖苷酶和2類甘露糖苷酶的突變，如敲除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或甘露糖苷酶的其它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低1類加工甘露糖苷酶和/或2類加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優選實施方案中，該突變是甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結構(和蛋白質活性)，例如可以是一種溫度敏感突變體。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；或其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，細胞包含1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種可結合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶活性和2類加工甘露糖苷酶活性能被不同機制抑制。例如，細胞接觸抑制1類加工甘露糖苷酶的物質(如I類甘露糖苷酶抑制劑)能抑制1類加工甘露糖苷酶的活性，使用一種2類甘露糖苷酶敲除和/或包含2類甘露糖苷酶反義分子的細胞能抑制2類加工甘露糖苷酶。在另一個優選實施方案中，細胞接觸抑制2類甘露糖苷酶的物質(如2類甘露糖苷酶抑制劑)能抑制2類加工甘露糖苷酶的活性，使用一種1類甘露糖苷酶敲除和/或包含1類甘露糖苷酶反義分子的細胞能抑制1類加工甘露糖苷酶。
在一個優選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優選地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
在一個優選實施方案中，產生的hmGCB(一種或多種hmGCB分子或整個制劑)中甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優選地，甘露糖與GlcNAc之比為4∶2、5∶2、6∶2、7∶2、8∶2、9∶2，更優選地，甘露糖與GlcNAc之比為8∶2或9∶2。
在一個優選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，制劑中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部的hmGCB分子含有至少1條、優選地2條、3條或4條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優選地，除了五糖核心外，hmGCB制劑中不到80％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的糖鏈含有相同數量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數量甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數量甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；50％∶50％；40％∶60％；30％∶70％；25％∶75％；20％∶80％；15％∶85％；10％∶90％；5％或更低∶95％或更高。
在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶IA和/或高爾基體甘露糖苷酶IB和/或高爾基體甘露糖苷酶IC的活性，2類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的糖鏈含有5個或5個以上的甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶IA和/或高爾基體甘露糖苷酶IB和/或高爾基體甘露糖苷酶IC的活性，2類加工甘露糖苷酶如高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比分別約為60％∶40％；70％∶30％；75％∶25％；80％∶20％；85％∶15％；90％∶10％；95％∶5％；99％∶1％；或100％∶0％。
在一個優選實施方案中，細胞包含一種含有GCB編碼區的外源核酸序列。在一個優選實施方案中，細胞還包含一種調節序列，一種內源或外源調節序列，其作用是調節外源GCB編碼區的表達。
在一個優選實施方案中，細胞包含一種外源調節序列，其作用是調節內源GCB編碼序列的表達，例如，調節序列整合到細胞基因組中，使其調節內源GCB編碼序列的表達。
在一個優選實施方案中，調節序列包括下列之一種或多種啟動子、增強子、上游激活序列(UAS)、支架結構附著區或轉錄因子結合位點。在一個優選實施方案中，調節序列包括來自金屬硫蛋白-I基因(例如小鼠金屬硫蛋白-I基因)的調節序列、來自SV-40基因的調節序列、來自巨細胞病毒基因的調節序列、來自膠原蛋白基因的調節序列、來自肌動蛋白基因的調節序列、來自免疫球蛋白基因的調節序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調節序列，或來自EF-1α基因的調節序列。
在一個優選實施方案中，細胞是一種真核細胞。在一個優選實施方案中，細胞是真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優選實施方案中，細胞是一種哺乳動物細胞，例如初級或次級哺乳動物細胞，例如成纖維細胞、造血干細胞、成肌細胞、角化細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、含有血液有形成分的細胞、肌細胞和這些體細胞的前體；轉化的或無限增殖化細胞系。優選地，該細胞是人細胞。在本方法中有用的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細胞(ATCC保藏號CRL9607)、Daudi細胞(ATCC保藏號CCL213)、HeLa細胞和HeLa細胞衍生物(ATCC保藏號CCL2、CCL2.1和CCL2.2)、HL-60細胞(ATCC保藏號CCL240)、HT-1080細胞(ATCC保藏號CCL121)、Jurkat細胞(ATCC保藏號TIB152)、KB癌細胞(ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細胞(ATCC保藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC保藏號BTH22)、MOLT-4細胞(ATCC保藏號1582)、Namalwa細胞(ATCC保藏號CRL1432)、Raji細胞(ATCC保藏號CCL86)、RPMI8226細胞(ATCC保藏號CCL155)、U-937細胞(ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細胞(ATCC保藏號CCL155)、CCRF-CEM細胞(ATCC保藏號CCL119)和2780AD卵巢癌細胞(Van Der Blick等人，Cancer Res.485927-5932，1988)，以及人細胞與其它種的細胞融合產生的雜交瘤細胞。在另一個實施方案中，無限增殖化細胞系可以是人細胞系之外的細胞系，如CHO細胞系、COS細胞系。在另一個實施方案中，細胞可以來自克隆細胞株或克隆細胞系。
在一個優選實施方案中，提供能表達hmGCB的細胞群體，至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部細胞產生含有至少一條糖鏈、優選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數量的甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，細胞在含有至少一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑和至少一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養。在一個優選實施方案中，該方法還包括從培養細胞的培養基中獲得hmGCB。
另一方面，本發明表征了一種生產hmGCB制劑的方法。該方法包括
提供一種細胞，該細胞中導入了一種含有外源調節序列的核酸序列，使得該調節序列可調節內源GCB編碼區的表達；和
在防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產含有前體寡糖的GCB，從而生產hmGCB制劑。
在一個優選實施方案中，GCB是人GCB。
在一個優選實施方案中，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基；防止去除遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法包括使細胞接觸一種物質，該物質可防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，例如防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基，遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基和/或遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，該方法包括使細胞接觸一種物質，該物質可防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基，而且該物質是一種甘露糖苷酶抑制劑。該甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或此兩者。1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或類似抑制劑中的一種或多種。優選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。有用的2類加工甘露糖苷酶抑制劑可包括苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM中的一種或多種。優選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
在一個優選實施方案中，甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在。
在一個優選實施方案中，該方法還包括使細胞接觸一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑和一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類加工和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度約為0.025-40.0μg/ml、0.05-20μg/ml、0.05-10μg/ml、優選地約0.1-4.0μg/ml。
在一個優選實施方案中，細胞具有至少一種甘露糖苷酶的突變，如敲除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或其它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優選實施方案中，該突變是敲除，例如甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結構(和蛋白質活性)，例如可以是一種溫度敏感突變或截短。在一個優選實施方案中，該細胞具有1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘露糖苷酶的突變，例如敲除，1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的突變，例如敲除。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；或其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它們能結合或滅活一種細胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質的表達。在一個優選實施方案中，該核酸序列是1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種可結合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
在一個優選實施方案中，hmGCB分子包含一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。例如，hmGCB分子具有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含6個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含8個甘露糖殘基的糖鏈，hmGCB分子具有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。優選地，hmGCB分子具有至少一條含5個、8個或9個甘露糖殘基的糖鏈。
在一個優選實施方案中，產生的hmGCB(一種或多種hmGCB分子或整個制劑)中甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優選地，甘露糖與GlcNAc之比為4∶2、5∶2、6∶2、7∶2、8∶2、9∶2，更優選地，甘露糖與GlcNAc之比為5∶2、8∶2或9∶2。
在一個優選實施方案中，在hmGCB分子的1、2、3或4條糖鏈上防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，制劑中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部的hmGCB分子含有至少1條、優選地2條、3條或4條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，hmGCB制劑是一種相對異源的制劑。優選地，除了五糖核心外，hmGCB中不到80％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的糖鏈含有相同數量的甘露糖殘基。例如，除五糖核心之外含有相同數量甘露糖殘基的糖鏈與含有不同數量甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；50％∶50％；40％∶60％；30％∶70％；25％∶75％；20％∶80％；15％∶85％；10％∶90％；5％或更低∶95％或更高。
在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的糖鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基，例如5、6、7、8和/或9個甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶I的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；70％∶30％；75％∶25％；80％∶20％；85％∶15％；90％∶10％；95％∶5％；99％∶1％；或100％∶0％。
在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，hmGCB制劑中至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的糖鏈含有5個或5個以上甘露糖殘基。在一個優選實施方案中，高爾基體甘露糖苷酶II的活性被抑制，含有5個或更多甘露糖殘基的糖鏈與含有4個或更少甘露糖殘基的糖鏈之比約為60％∶40％；70％∶30％；75％∶25％；80％∶20％；85％∶15％；90％∶10％；95％∶5％；99％∶1％；或100％∶0％。
在一個優選實施方案中，該調節序列包括下列之一種或多種啟動子、增強子、上游激活序列(UAS)、支架結構附著區或轉錄因子結合位點。在一個優選實施方案中，該調節序列包括來自金屬硫蛋白-I基因(例如小鼠金屬硫蛋白-I基因)的調節序列、來自SV-40基因的調節序列、來自巨細胞病毒基因的調節序列、來自膠原蛋白基因的調節序列、來自肌動蛋白基因的調節序列、來自免疫球蛋白基因的調節序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調節序列，或來自EF-1α基因的調節序列。
在一個優選實施方案中，該細胞是一種真核細胞。在一個優選實施方案中，該細胞是真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優選實施方案中，該細胞是一種哺乳動物細胞，例如初級或次級哺乳動物細胞，例如成纖維細胞、造血干細胞、成肌細胞、角化細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、含有血液有形成分的細胞、肌細胞和這些體細胞的前體；轉化的或無限增殖化細胞系。優選地，該細胞是人細胞。在本方法中有用的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細胞(ATCC保藏號CRL9607)、Daudi細胞(ATCC保藏號CCL213)、HeLa細胞和HeLa細胞衍生物(ATCC保藏號CCL2 CCL2.1和CCL2.2)、HL-60細胞(ATCC保藏號CCL240)、HT-1080細胞(ATCC保藏號CCL121)、Jurkat細胞(ATCC保藏號TIB152)、KB癌細胞(ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細胞(ATCC保藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC保藏號BTH22)、MOLT-4細胞(ATCC保藏號1582)、Namalwa細胞(ATCC保藏號CRL1432)、Raji細胞(ATCC保藏號CCL86)、RPMI8226細胞(ATCC保藏號CCL155)、U-937細胞(ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細胞(ATCC保藏號CCL155)、CCRF-CEM細胞(ATCC保藏號CCL119)和2780AD卵巢癌細胞(Van Der Blick等人，Cancer Res.485927-5932，1988)，以及人細胞與其它種的細胞融合產生的雜交瘤細胞。在另一個實施方案中，無限增殖化細胞系可以是人細胞系之外的細胞系，如CHO細胞系、COS細胞系。在另一個實施方案中，細胞可以來自克隆細胞株或克隆細胞系。
在一個優選實施方案中，提供能表達hmGCB的細胞群體，至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部細胞產生含有至少1條糖鏈、優選地2、3或4條糖鏈的hmGCB分子，它們含有特定數量的甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，細胞在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養。在一個優選實施方案中，該方法還包括從培養細胞的培養基中獲得hmGCB。
另一方面，本發明表征了通過此處所述任一種方法生產的一種hmGCB分子，例如此處所述的hmGCB分子，如人hmGCB。優選地，hmGCB分子包含至少1條糖鏈，優選地2、3或4條糖鏈，它們含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基。
另一方面，本發明表征了一種包含hmGCB分子的一部分的hmGCB制劑，該分子包含至少1條糖鏈，優選地2、3或4條糖鏈，它們含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基。優選地，hmGCB制劑通過此處所述的任一種方法生產。
在一個優選實施方案中，hmGCB是人hmGCB。
在一個優選實施方案中，hmGCB分子可含有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含6個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含7個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含8個甘露糖殘基的糖鏈；至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。
在一個優選實施方案中，產生的hmGCB(一種或多種hmGCB分子或整個制劑)含有至少一種糖鏈，其中甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優選地，甘露糖與GlcNAc之比為4∶2、5∶2、6∶2、7∶2、8∶2、9∶2，更優選地，甘露糖與GlcNAc之比為5∶2、8∶2或9∶2。
在一個優選實施方案中，制劑中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部的hmGCB分子含有至少1條、優選地2條、3條或4條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
另一方面，本發明表征了一種細胞，其至少一種甘露糖苷酶活性被抑制，并且包含一種含外源調節序列的核酸序列，該調節序列調節被導入后使得能調節內源GCB編碼區的表達，其中該細胞產生防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的GCB。
在一個優選實施方案中，該細胞產生一種hmGCB制劑，例如，人hmGCB制劑，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基；防止去除遠離五糖核心的α1，3甘露糖殘基；和/或防止去除遠離五糖核心的α1，6甘露糖殘基。優選地，防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，細胞接觸一種抑制甘露糖苷酶的物質可抑制細胞中至少一種甘露糖苷酶活性。在一個優選實施方案中，該物質是一種甘露糖苷酶抑制劑。該甘露糖苷酶抑制劑可以是1類加工甘露糖苷酶抑制劑、2類加工甘露糖苷酶抑制劑或此兩者。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是kifunensine和deoxymannojirimycin之一或兩者。優選地，1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶抑制劑可以是苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM和6-脫氧-6-氟-DIM中的一種或多種。優選地，2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
在一個優選實施方案中，細胞具有至少一種高爾基加工甘露糖苷酶的突變，如敲除。該突變可以是降低基因表達、降低蛋白質或活性水平或改變甘露糖苷酶分布或其它翻譯后修飾如糖鏈加工的突變。該突變可以降低高爾基加工甘露糖苷酶活性水平，例如降低基因表達，如無效突變，如缺失、移碼或插入。在一個優選實施方案中，該突變是甘露糖苷酶基因中的敲除。該突變能影響結構(和蛋白質活性)，例如可以是一種溫度敏感突變。在一個優選實施方案中，該細胞是1類加工甘露糖苷酶、2類加工甘露糖苷酶、1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的突變體，例如敲除突變體。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，細胞還包含一種核酸序列，如反義分子或核酶，它們能結合或滅活一種細胞甘露糖苷酶核酸序列，如mRNA，并抑制該蛋白質的表達。在一個優選實施方案中，該核酸序列是1類加工甘露糖苷酶反義分子；2類加工甘露糖苷酶反義分子；1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。在一個優選實施方案中，1類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶IA；高爾基體甘露糖苷酶IB；高爾基體甘露糖苷酶IC；其組合。在一個優選實施方案中，2類加工甘露糖苷酶是高爾基體甘露糖苷酶II。
在一個優選實施方案中，該細胞包含一種可結合并抑制甘露糖苷酶的分子，如一種外源分子。該分子可以是，例如一種單鏈抗體、胞內蛋白或競爭性或非競爭性抑制劑。
在一個優選實施方案中，該細胞產生的hmGCB分子中甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基，優選地，甘露糖與GlcNAc之比為4∶2、5∶2、6∶2、7∶2、8∶2、9∶2，更優選地，甘露糖與GlcNAc之比為5∶2、8∶2或9∶2。
在一個優選實施方案中，該細胞不能在hmGCB的1、2、3或4條糖鏈上去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，細胞產生的至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或全部的hmGCB分子含有至少1條、優選地2條、3條或4條糖鏈，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個甘露糖殘基。
在一個優選實施方案中，調節序列包括下列之一種或多種啟動子、增強子、上游激活序列(UAS)、支架結構附著區或轉錄因子結合位點。在一個優選實施方案中，調節序列包括來自金屬硫蛋白-I基因(例如小鼠金屬硫蛋白-I基因)的調節序列、來自SV-40基因的調節序列、來自巨細胞病毒基因的調節序列、來自膠原蛋白基因的調節序列、來自肌動蛋白基因的調節序列、來自免疫球蛋白基因的調節序列、來自HMG-CoA還原酶基因的調節序列，或來自EF-1α基因的調節序列。
在一個優選實施方案中，細胞是一種真核細胞。在一個優選實施方案中，細胞是真菌、植物或動物來源的，例如脊椎動物來源的。在一個優選實施方案中，細胞是一種哺乳動物細胞，例如初級或次級哺乳動物細胞，例如成纖維細胞、造血干細胞、成肌細胞、角化細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、含有血液有形成分的細胞、肌細胞和這些體細胞的前體；轉化的或無限增殖化細胞系。優選地，該細胞是人細胞。在本方法中有用的無限增殖化人細胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細胞(ATCC保藏號CRL9607)、Daudi細胞(ATCC保藏號CCL213)、HeLa細胞和HeLa細胞衍生物(ATCC保藏號CCL2 CCL2.1和CCL2.2)、HL-60細胞(ATCC保藏號CCL240)、HT-1080細胞(ATCC保藏號CCL121)、Jurkat細胞(ATCC保藏號TIB152)、KB癌細胞(ATCC保藏號CCL17)、K-562白血病細胞(ATCC保藏號CCL243)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC保藏號BTH22)、MOLT-4細胞(ATCC保藏號1582)、Namalwa細胞(ATCC保藏號CRL1432)、Raji細胞(ATCC保藏號CCL86)、RPMI8226細胞(ATCC保藏號CCL155)、U-937細胞(ATCC保藏號1593)、WI-28VA13亞系2R4細胞(ATCC保藏號CCL155)、CCRF-CEM細胞(ATCC保藏號CCL119)和2780AD卵巢癌細胞(Van Der Blick等人，Cancer Res.485927-5932，1988)，以及人細胞與其它種的細胞融合產生的雜交瘤細胞。在另一個實施方案中，無限增殖化細胞系可以是人細胞系之外的細胞系，如CHO細胞系、COS細胞系。在另一個實施方案中，細胞可以來自克隆細胞株或克隆細胞系。
另一方面，本發明表征了一種包含hmGCB分子(如人hmGCB)的藥用組合物，它包含至少一條糖鏈，優選地2、3或4條糖鏈，這些糖鏈含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基，其量適于治療戈謝病。
在一個優選實施方案中，該藥用組合物還包含一種藥學可接受的載體或稀釋劑。
本發明的另一方面表征了一種治療戈謝病患者的方法。該方法包括對戈謝病患者施用一種hmGCB制劑，如人hmGCB制劑，它包含至少一條糖鏈，優選地2、3或4條糖鏈，這些糖鏈含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基，其量適于治療戈謝病。
另一方面，本發明表征了一種從樣品中純化hmGCB的方法。該方法包括提供一種收獲的hmGCB產物；對該hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)和/或疏水作用層析(HIC)，從而獲得純化的hmGCB。
在一個優選實施方案中，用MEP Hypercel進行HCIC。在另一個優選實施方案中，用MacroPrep Methyl進行HIC。
在另一個優選實施方案中，該方法還包括對hmGCB產物進行離子交換層析。可在離子交換層析之前對hmGCB產物進行HCIC和/或HIC，或者在HCIC和/或HIC之前對hmGCB產物進行離子交換層析。優選地，對hmGCB產物進行一次以上的離子交換層析步驟。離子交換層析可以是陰離子交換層析、陽離子交換層析或此兩者。
在一個優選實施方案中，使用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose Fast Flow、MacroPrep High Q Support、DEAESepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。在一個優選實施方案中，用下列之一或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose FastFlow、Source 30S、CM Sepharose Fast Flow、Macro-Prep CMSupport和Macro-Prep High S Support。
在一個優選實施方案中，該方法還包括對hmGCB產物進行大小排阻層析。優選地，用下列之一或多種進行大小排阻層析Superdex200、Sephacryl S-200HR和Bi0-Gel A1.5m。
另一方面，本發明表征了一種純化hmGCB的方法。該方法包括提供收獲的hmGCB產物；對hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)和/或疏水作用層析(HIC)；對hmGCB產物進行陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析中的一種或多種，從而獲得純化的hmGCB。
在一個優選實施方案中，用MEP Hypercel進行HCIC。在另一個優選實施方案中，用MacroPrep Methyl進行HIC。
在一個優選實施方案中，該方法包括使用陰離子交換層析。優選地，用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose FastFlow、MacroPrep High Q Support、DEAE Sepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。
在一個優選實施方案中，該方法包括使用陽離子交換層析。優選地，用下列之一種或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose FastFlow、Source 30S、CM Sepharose Fast Flow、Macro-Prep CMSupport和Macro-Prep High S Support。
在一個優選實施方案中，該方法包括使用大小排阻層析。優選地，用下列之一種或多種進行大小排阻層析Superdex 200、SephacrylS-200HR和Bio-Gel A1.5m。
在一個優選實施方案中，對hmGCB進行(以任何順序)陰離子交換層析和陽離子交換層析；陰離子交換層析和大小排阻層析；陽離子交換層析和大小排阻層析；陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析。優選地，以下列順序對hmGCB進行所有這三種層析步驟陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析。
另一方面，本發明表征了一種純化hmGCB的方法。該方法包括提供收獲的hmGCB產物；對hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)和/或疏水作用層析(HIC)；對HCIC和/或HIC純化的hmGCB產物進行陰離子交換層析；對陰離子交換純化的hmGCB進行陽離子交換層析；以及，對陽離子交換純化的hmGCB進行大小排阻層析，從而獲得純化的hmGCB。
在一個優選實施方案中，用MEP Hypercel進行HCIC。在另一個優選實施方案中，用MacroPrep Methyl進行HIC。
在一個優選實施方案中，用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose Fast Flow、MacroPrep High Q Support、DEAESepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。
在一個優選實施方案中，用下列之一種或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose Fast Flow、Source 30S、CM Sepharose FastFlow、Macro-Prep CM Support和Macro-Prep High S Support。
在一個優選實施方案中，用下列之一種或多種進行大小排阻層析Superdex 200、Sephacryl S-200HR和Bio-Gel A1.5m。
術語“高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)”在此使用時是指含有至少一條糖鏈的葡糖腦苷脂酶，該糖鏈含有4個或4個以上的來自前體寡糖的甘露糖殘基。優選地，hmGCB含有5、6、7、8或9個來自前體寡糖鏈的甘露糖殘基。最優選地，hmGCB含有5、8或9個來自前體寡糖鏈的甘露糖殘基。
術語“hmGCB制劑”是指兩種或多種hmGCB分子。
術語“初級細胞”包括存在于自脊椎動物組織來源分離的細胞懸液中的細胞(在平板接種之前，即附著于組織培養底物如平皿或瓶上的)、在來自組織的外植體中存在的細胞、第一次平板接種的前述兩種細胞型、由這些平板接種的細胞衍生的細胞懸液。術語次級細胞或細胞株是指培養中所有后來步驟的細胞。即，首先從培養底物中取出平板接種的初級細胞，再次平板接種(傳代)，在此稱為次級細胞，如隨后傳代的所有細胞。次級細胞是由傳代一次或多次的次級細胞組成的細胞株。細胞株由下列次級細胞組成，它們1)被傳代一次或多次；2)在培養中顯示有限數量的平均群體倍增；3)顯示接觸抑制、錨定依賴生長的特性(錨定依賴性不適用于懸浮培養繁殖的細胞)；4)不是無限增殖的。“克隆細胞株”被定義為由單個創始細胞(founder cell)衍生的細胞株。“異源細胞株”被定義為由兩種或多種生成細胞衍生的細胞株。
在此使用時，“無限增殖化細胞”是主要特征在于在培養中顯示明顯不受限制的壽命的細胞系(不同于命名為初級和次級細胞具有的“株”的細胞株)。
術語“轉染的細胞”是指導入外源合成核酸序列(如編碼一種蛋白質的序列)的細胞。一旦進入細胞，合成核酸序列即能整合到受體細胞染色體DNA中或能以附加型存在。能用標準轉染方法向細胞中導入合成核酸序列，例如脂質體聚凝胺(polybrene)、DEAE介導的轉染、葡聚糖介導的轉染、電穿孔、磷酸鈣沉淀或顯微注射。術語“轉染”不包括通過病毒向細胞中運送DNA或RNA。
術語“感染的細胞”或“轉導的細胞”是指通過病毒導入外源合成核酸序列(如編碼一種蛋白質的序列)的細胞。公知可用于基因轉移的病毒包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、反轉錄酶病毒、辛德畢斯病毒、慢病毒和痘苗病毒如金絲雀痘病毒。
通過下列詳述和權利要求書，本發明的其它特征和優點將是顯然的。
附圖簡述


圖1是一張示意圖，顯示N連接的聚糖當在內質網、中室和高爾基體中存在時的修剪。這些酶如下編號(1)α-葡糖苷酶I；(2)α-葡糖苷酶II；(3)ER甘露糖苷酶I；(4)ER甘露糖苷酶II；(5)ER葡糖基轉移酶；(6)內甘露糖苷酶；(7)高爾基體甘露糖苷酶IA、IB和IC；(8)GlcNAc轉移酶I；(9)高爾基體甘露糖苷酶II。，葡萄糖；，GlcNAc；，甘露糖。酶(3)和(7)被kifunensine抑制；酶(9)被苦馬豆素抑制。
發明詳述
本發明部分地基于以下發現抑制去除遠離葡糖腦苷脂酶(GCB)前體寡糖鏈五糖核心的一個或多個甘露糖殘基產生可有效導向甘露糖受體的高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)。抑制或降低一種或多種甘露糖苷酶(如一種或多種1類加工甘露糖苷酶和/或2類加工甘露糖苷酶)的活性能防止從前體寡糖鏈的五糖核心中去除甘露糖殘基。通過防止或抑制一個或多個甘露糖殘基的去除，能獲得含有至少一條含4個或4個以上來自前體寡糖鏈的甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。
戈謝病是由于GCB缺陷引起的。GCB是鞘糖脂葡糖腦苷脂降解所必需的。在GCB缺乏時，葡糖腦苷脂主要在吞噬細胞(例如巨噬細胞)中積累，最終在肝臟、脾臟和骨髓中積累。
巨噬細胞具有甘露糖受體。這些受體在這些細胞的受體介導的胞吞作用中起作用。hmGCB可有效地定向巨噬細胞上的甘露糖受體，提高這些細胞對GCB的攝取(以hmGCB形式)。通過將GCB(以hmGCB形式)引導到葡糖腦苷脂積累的細胞中，hmGCB能用來水解巨噬細胞中的葡糖腦苷脂，從而降低該糖脂在戈謝病患者的肝臟、脾臟和骨髓中的積累。
葡糖腦苷脂酶
來自不同種的編碼葡糖腦苷脂酶的基因的核苷酸序列信息可以獲得。(參見Horowitz等人(1989)Genomics 4(1)87-96；Beutler等人(1992)Genomics 12(4)795-800)。
成熟的人GCB在Asn-19、Asn-59、Asn-146、Asn-270和Asn-462處有5個潛在的N-連接糖基化位點。在人組織衍生的GCB中，在5個位點中的4個處發生糖基化(Erickson等人(1985)J.Biol.Chem.26014319-14324)。利用定點誘變的研究證明，位點Asn-462不再被占據(Berg-Fussman等人(1993)J.Biol.Chem.26814861-14866)。從人胎盤GCB中釋放的接近20％的聚糖鏈顯示為含有可達7個甘露糖殘基的高甘露糖類型，而大多數聚糖鏈是具有唾液酸二天線和三天線結構的復合型(Takasaki等人(1984)J.Biol.Chem.25910112-10117)。
GCB N-糖基化的第一個事件是內質網(ER)腔中Glc3Man9GlcNAc2從寡糖-PP-多萜醇向新生肽的協同翻譯轉移。供體寡糖上存在3個葡萄糖殘基允許由寡糖基轉移酶向受體天冬酰胺有效轉移。N-糖基化后，在折疊過程中ER葡糖苷酶I和II從GCB中快速除去葡萄糖殘基。兩種不同的ER甘露糖苷酶均能從Man9GlcNAc2上水解下一個甘露糖殘基，形成Man8GlcNAc2的兩種不同的異構體(見圖1)。可接近的聚糖然后在高爾基體中進一步加工為Man5GlcNAc2，是通過高爾基體甘露糖苷酶I除去可達4個α1，2-連接的甘露糖殘基。至少有3種不同的編碼相關高爾基體甘露糖苷酶I同工型(IA、IB和IC)的人類基因，它們有略微不同的底物特異性和組織表達，但全都能從Man9GlcNAc2聚糖上剪下4個甘露糖殘基，形成Man5GlcNAc2(Tremblay等人(2000年7月27日)J.Biol.Chem.[待印刷])。它們位于染色體6q22、1p13和1p35-36上，其cDNA序列可從GenBank獲得，分別為X74837、AF027156和AF261655。
加工的最后一個階段是使聚糖進入復雜聚糖的生物合成途徑，需要開始時通過GlcNAc轉移酶I的作用使Man5GlcNAc2轉化為GlcNAcMan5GlcNAc2，之后高爾基體甘露糖苷酶II能催化去除另外兩個甘露糖殘基，產生GlcNAcMan3GlcNAc2。它是位于跨高爾基體和跨高爾基體網絡中的糖基轉移酶引起聚糖延伸形成復合型鏈的底物。
如果在最初的N-糖基化步驟中轉移給GCB的高甘露糖鏈在高爾基體中能免于被加工為復合鏈，則含有高甘露糖鏈的GCB(hmGCB)可有效地定向網狀內皮組織細胞上的甘露糖受體。
細胞
將要轉染或感染的初級和次級細胞能從多種組織中獲得，包括能培養保存和繁殖的細胞型。例如，能被轉染或感染的初級和次級細胞包括成纖維細胞、角化細胞、上皮細胞(例如哺乳動物上皮細胞、腸上皮細胞)、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、血液的有形成分(例如淋巴細胞、骨髓細胞)、肌細胞和這些體細胞型的前體。初級細胞優選地從施用了轉染或感染的初級或次級細胞的個體中獲得(即自體細胞)。然而，初級細胞可從相同種(即，同種異體細胞)或其它種(即，異種細胞)(例如，小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、母牛、鳥、綿羊、山羊、馬、猴、狒狒)的供體(不是受體)中獲得。
脊椎動物(特別是哺乳動物)來源的初級或次級細胞能用外源DNA序列(例如編碼治療蛋白的外源DNA序列)轉染或感染，在并長期在體外和體內穩定且可再生的產生編碼的治療蛋白。另外，轉染或感染的初級和次級細胞能以生理相關水平在體內表達編碼產物，細胞能在植入后恢復，并在重新培養后生長并顯示其植入前的特性。能修飾細胞，以減少細胞表面組織相容性復合物或外源糖部分，以降低免疫原性，例如普通供體細胞。
此外，脊椎動物(特別是哺乳動物)的初級或次級細胞能用含有調節序列的外源DNA序列轉染或感染。這些調節序列的例子包括啟動子、增強子、UAS、支架附著區或轉錄結合位點之一種或多種。導向事件能導致DNA序列中插入調節序列，將導向的內源基因置于其控制下(例如，通過將啟動子或增強子或此兩者插入內源基因或調節區上游)。任選地，導向事件能同時導致基因的內源調節序列的缺失，如組織特異性負調節序列的缺失。導向事件能替換存在的調節序列；例如，組織特異性增強子能被替換為比內源元件有更寬或不同細胞型特異性，或顯示與相應未轉染或未感染細胞不同的調節或誘導模式的增強子。就此而言，刪除內源序列并加入新序列。此外，內源調節序列也可不被去除或替換，但被導向事件破壞或失能，例如通過將外源序列導向內源調節元件內。通過同源重組導入調節序列能產生表達通常不被表達的治療蛋白的初級或次級細胞。另外，導入調節序列能用于以低于正常的量(以低于生理正常較低水平的量)或以缺陷形式產生或含有治療蛋白的細胞，和以生理正常水平產生治療蛋白的細胞，但其含量或產量將增加。美國專利號5,641,670、美國專利號5,733,761和美國專利號5,968,502描述了激活內源編碼序列的方法，其內容在此引用作為參考。
轉染的或感染的初級或次級細胞也可含有編碼賦予選擇性表型的選擇性標記的DNA序列，便于其鑒定和分離。生產穩定表達該DNA序列的轉染初級或次級細胞的方法，這些轉染細胞的克隆細胞株和異源細胞株，生產克隆和異源細胞株的方法眾所周知，例如在美國專利號5,641,670、美國專利號5,733,761和美國專利號5,968,502中描述，其內容在此引用作為參考。
轉染的初級或次級細胞能通過電穿孔制備。電穿孔以適當電壓和電容(和相應的時間常數)進行，導致DNA構件進入初級或次級細胞。電穿孔能在寬范圍的電壓(例如50-2000伏)和相應電容下進行。一般使用約0.1-500μg的總DNA。
此外，能利用公知的方法轉染細胞，如磷酸鈣沉淀、顯微注射、改良磷酸鈣沉淀和聚凝胺沉淀、脂質體融合和受體介導的基因送遞。
葡糖腦苷脂酶的加工
為防止去除甘露糖殘基而未被處理的細胞中的寡糖裝配通常如下所述進行
GCB的寡糖鏈通過N-糖苷鍵與多肽骨架連接。N-連接的聚糖含有一個酰胺鍵，它連接寡糖的還原端N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)殘基的異頭碳(C-1)與多肽的天冬酰胺(Asn)殘基的一個氮。
N-連接的寡糖裝配的起始不在GCB蛋白的Asn殘基上直接發生，而是包括脂連接的14糖前體寡糖的預裝配，然后在由mRNA翻譯期間或之后不久轉移給ER中的蛋白質。“前體寡糖”在此使用時是指參與糖鏈生物合成的初始步驟的寡糖鏈。“前體寡糖”可以是至少包含下列糖的寡糖結構Man9GlcNAc2，例如，前體寡糖可具有下列結構Glc3Man9GlcNAc2，如圖1所示。當通過焦磷酸橋與聚類異戊二烯載體脂(一種多萜醇)連接時，前體寡糖合成。這種裝配涉及至少6種不同的膜結合糖基轉移酶。這些酶中的一些從核苷酸糖轉移單糖，而其它的利用多萜醇-連接的單糖作為糖供體。在完成脂連接的前體的裝配后，另一種膜結合酶將其轉移給空間上可接近的Asn殘基，它是序列-Asn-X-Ser/Thr-的部分。
新合成的GCB的糖基化Asn殘基短時攜帶Glc3Man9GlcNAc2，在此也被稱為“未加工的糖鏈”。
N-連接的寡糖的加工通過大量膜結合酶的順序作用完成，在將前體寡糖Glc3Man9GlcNAc2轉移給蛋白質之后立即開始。術語“加工”、“修剪”和“修飾”在此可互換使用。
N-連接的寡糖加工能分為三個階段3個葡萄糖殘基的去除，可變數量的甘露糖殘基的去除，和多個糖殘基向產生的修剪核心的加入。
加工第一階段中葡萄糖殘基的去除包括所有三個葡萄糖殘基的去除，產生N-連接的Man9GlcNAc2。該結構在此也被稱為Manα1-2Manα1-2Manα1-3[Manα1-2Manα1-3(Manα1-2Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc(參見圖1，結構9’)。加工通常持續到去除甘露糖殘基的第二階段。
Man9GlcNAc2部分的4個甘露糖殘基通過α-1，2連接結合。甘露糖苷酶IA、IB和IC能除去可達4個這樣的α1，2-連接的甘露糖殘基，產生N-連接的Man5-8GlcNAc2。
蛋白質-連接的Man5GlcNAc2然后能作為GlcNAc轉移酶I的底物，該酶將β1，2-連接的GlcNAc殘基從UDP-GlcNAc轉移給核心α1，3-連接的甘露糖殘基，形成GlcNAcMan5GlcNAc2。甘露糖苷酶II然后能完成該加工途徑的修剪階段，是通過除去2個甘露糖殘基產生蛋白質連接的寡糖，其中含有Man3GlcNAc2，“五糖核心”。結構GlcNAcMan3GlcNAc2是GlcNAc轉移酶II的底物，該酶能將β1，2-連接的GlcNAc殘基轉移給α1，6-連接的甘露糖殘基。
在修剪階段后，由一系列膜結合的高爾基體糖基轉移酶向延長的寡糖鏈上連續加入單糖，這些酶對于受體寡糖、供體糖和糖間形成的鍵型而言都是高度特異的。它們包括不同的GlcNAc轉移酶(產生β1，2、β1，4或β1，6鍵)；半乳糖基轉移酶(產生β1，4、β1，3和α1，3鍵)；唾液酸轉移酶(產生α2，3鍵的一種酶，和產生α2，6鍵的另一種酶)；巖藻糖基轉移酶(產生α1，2、α1，3、α1，4或α1，6鍵)；和產生多種異常鍵的不斷增加的其它酶。這些糖基轉移酶的協同作用產生通稱為“復合”寡糖的不同結構家族。它們可含有與不變的核心五糖Man3GlcNAc2連接的2、3或4個外分支(“天線”)。這些結構根據其外分支的數量是指二天線(兩個分支)、三天線(三個分支)或四天線(四個分支)。這些復合聚糖的大小可能變化。
高甘露糖葡糖腦苷脂酶的加工
通過減少或防止GCB的細胞糖修飾(即加工)能產生hmGCB。在防止去除遠離GCB前體寡糖鏈五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下產生GCB，能防止糖修飾。例如，能防止從前體寡糖中除去甘露糖殘基期間的一個或多個“修剪”階段。
細胞甘露糖苷酶歸為兩大類1類加工酶，包括ER甘露糖苷酶I、高爾基體甘露糖苷酶IA、IB和IC，能水解α1，2-連接的甘露糖殘基，其活性需要Ca2+；2類加工酶，包括ER甘露糖苷酶II、高爾基體甘露糖苷酶II、胞質α甘露糖苷酶和溶酶體α甘露糖苷酶，它們具有較寬的底物特異性，其活性不需要Ca2+。
從前體寡糖上修剪甘露糖殘基至少涉及下列甘露糖苷酶高爾基體甘露糖苷酶IA、IB和IC，和高爾基體甘露糖苷酶II。通過在細胞的N-連接的寡糖裝配過程中抑制一種或多種這類酶，能產生至少含有一條糖鏈的GCB，該糖鏈除了五糖核心外含有一個或多個甘露糖殘基。例如，ER甘露糖苷酶I和高爾基體ER甘露糖苷酶I的抑制能產生至少含有一條糖鏈(優選地所有鏈)的hmGCB，該糖鏈含有來自前體寡糖的至少8個甘露糖殘基；高爾基體甘露糖苷酶II的抑制能產生至少含有一條糖鏈(優選地所有鏈)的hmGCB，該糖鏈含有來自前體寡糖的至少5個甘露糖殘基。
例如，使細胞接觸一種防止從GCB前體寡糖上除去一個或多個甘露糖殘基的物質，或在不能產生或以缺陷水平產生至少一種甘露糖苷酶的細胞中或在產生突變和/或失活甘露糖苷酶的細胞中產生GCB，能抑制甘露糖苷酶引起的修剪。例如，細胞可以是至少一種甘露糖苷酶的敲除體，能表達至少一種反義甘露糖苷酶分子，或者對于至少一種甘露糖苷酶可能是顯性陰性的。
防止去除甘露糖殘基的物質
防止從GCB的前體寡糖上除去一個或多個甘露糖殘基的物質能用來生產hmGCB制劑。例如，表達GCB的細胞能接觸一種物質，該物質可防止去除GCB的前體寡糖的一個或多個α1，2甘露糖殘基，和/或去除GCB的前體寡糖的α1，3甘露糖殘基，和/或去除GCB的前體寡糖的α1，6甘露糖殘基。優選地，該物質是一種甘露糖苷酶抑制劑，例如，1類加工甘露糖苷酶抑制劑或2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
細胞甘露糖苷酶根據蛋白質序列同源性歸于兩大類(Moremen等人(1994)Glycobiology 4113-125)。這兩類在機理上不同。1類酶包括ER甘露糖苷酶I和高爾基體甘露糖苷酶I同工型，分子量約為63-73kDa，可水解α1，2-連接的甘露糖殘基，其活性需要Ca2+。例如，用底物模擬物如甘露糖的吡喃糖類似物處理能阻斷1類加工甘露糖苷酶。例如，用下列一種或多種酶抑制劑處理能阻斷1類加工甘露糖苷酶kifunensine、deoxymannojirimycin或其組合。2類酶包括ER甘露糖苷酶I、高爾基體甘露糖苷酶II、胞質α-甘露糖苷酶和溶酶體α-甘露糖苷酶，具有約為107-136kDa的較大分子量，其活性不需要Ca2+，具有較寬的底物特異性。例如，用甘露糖基陽離子的呋喃糖過濾態類似物處理能阻斷2類加工甘露糖苷酶(Daniels等人(1994)GlycoBiol.4551-566)。例如，用下列一種或多種抑制劑處理能阻斷2類加工甘露糖苷酶苦馬豆素、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM、mannostatin A或其組合。
Kifunensine能用作內質網甘露糖苷酶I和/或高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的抑制劑；deoxymannojirimycin能用作ER甘露糖苷酶I、ER甘露糖苷酶II和/或高爾基體甘露糖苷酶IA和/或IB和/或IC的抑制劑；苦馬豆素能用作高爾基體甘露糖苷酶II的抑制劑；mannostatin A能用作高爾基體甘露糖苷酶II的抑制劑。
使用甘露糖苷酶抑制劑能抑制寡糖裝配期間甘露糖殘基修剪特定階段后GCB糖鏈的加工。例如，細胞與Kifunensine接觸能抑制前體寡糖的任何或1、2、3或4個甘露糖殘基的修剪。
用下列一種或多種酶抑制劑處理細胞能阻斷加工α-甘露糖苷酶
·Kifunensine，內質網I和高爾基體甘露糖苷酶I的一種抑制劑(Weng和Spiro(1993)J.Biol.Chem.26825656-25663；Elbein等人(1990)J.Biol.Chem.26515599-15605)。
·苦馬豆素，高爾基體甘露糖苷酶II的一種抑制劑(Tulsiani等人(1982)J.Biol.Chem.2577936-7939)。
·deoxymannojirimycin，內質網甘露糖苷酶I和II和高爾基體甘露糖苷酶I的一種抑制劑(Weng和Spiro(1993)J.Biol.Chem.26825656-25663；Tremblay和Herscovics(2000)J.Biol.Chem.Jul27；[待印刷])。
·DIM(1，4-雙脫氧-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇)，高爾基體甘露糖苷酶II的一種抑制劑(Palamarzyk等人(1985)Arch.Biochem.Biophys.24335-45)。
·6-脫氧-DIM和6-脫氧-6-氟-DIM，高爾基體甘露糖苷酶II的抑制劑(Winchester等人(1993)Biochem J.290743-749)。
·mannostatin A，高爾基體甘露糖苷酶II的一種抑制劑(Tropea等人(1990)Biochemistry 2910062-10069)。
可根據滲入特定細胞型的能力以及甘露糖苷酶抑制劑的抑制能力選擇不同的甘露糖苷酶抑制劑。例如，培養的成纖維細胞能以時間和濃度依賴的方式快速內化苦馬豆素。苦馬豆素也是2類甘露糖苷酶(如高爾基體甘露糖苷酶II)的一種強抑制劑。因此，苦馬豆素能用來在培養的成纖維細胞中產生hmGCB，例如含有至少一條含前體寡糖的至少4個或5個甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。另外，kifunensine可容易地被培養的成纖維細胞攝取，是1類甘露糖苷酶(如ER甘露糖苷酶I和高爾基體甘露糖苷酶I)的強抑制劑。因此，kifunensine能用來在培養的成纖維細胞中產生hmGCB，例如含有至少一條含前體寡糖的至少4、5、6、7、8或9個甘露糖殘基的糖鏈的hmGCB。
優選地，甘露糖苷酶抑制劑以0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在。例如，1類加工甘露糖苷酶抑制劑能以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；2類加工甘露糖苷酶抑制劑能以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；1類和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的每一種均能以約0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、優選地約0.1-2.0μg/ml的濃度存在；或者1類和2類加工甘露糖苷酶抑制劑的總濃度可以是約0.025-40.0μg/ml、0.05-20μg/ml、0.05-10μg/ml、優選地約0.1-5.0μg/ml。
細胞能接觸一種甘露糖苷酶抑制劑，例如在含有至少一種甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養細胞。
甘露糖苷酶突變細胞
甘露糖苷酶敲除細胞
甘露糖苷酶基因表達的永久或調節滅活能通過用轉染的質粒DNA構件或合成寡核苷酸導向甘露糖苷酶基因座位實現。質粒構件或寡核苷酸可設計為幾種形式。包括下列1)在甘露糖苷酶基因外顯子內插入選擇性標記基因或其它序列；2)在非編碼序列的調節區內插入外源序列；3)調節和/或編碼序列的缺失或置換；和，4)通過位點特異性誘變改變蛋白質編碼序列。
在向編碼序列中插入選擇性標記基因的情況中，實現內源甘露糖苷酶外顯子與改構后含有如一種選擇性標記基因的甘露糖苷酶外顯子的框內融合是可能的。這樣在成功導向后，內源甘露糖苷酶基因表達一種融合mRNA(甘露糖苷酶序列加選擇性標記序列)。而且，融合mRNA將不能產生功能性甘露糖苷酶翻譯產物。
在向調節區中插入DNA序列的情況中，通過破壞內源啟動區或轉錄所需的5’非翻譯區(5’UTR)中的其它任何區域能使甘露糖苷酶基因的轉錄沉默。這些區域包括，例如翻譯控制區和內含子的剪接供體。其次，一種新調節序列能插入甘露糖苷酶基因上游，這將使甘露糖苷酶基因受胞外因子的控制。因此為了最佳hmGCB產生如希望地下調或抑制甘露糖苷酶基因表達是可能的。而且，能用一種包含選擇性標記和啟動子的序列破壞內源序列的表達。最后，通過適當設計導向底物能刪除所有或部分內源甘露糖苷酶基因。
為了產生含有至少一個染色體拷貝的人高爾基體甘露糖苷酶IA、IB或IC基因的敲除的細胞，分離至少含有基因5’部分(包括調節序列、5’UTR、編碼序列)的基因組DNA。例如，利用聚合酶鏈反應(PCR)，能用保藏號為NM005907(人)的GenBank序列產生針對高爾基體甘露糖苷酶IA的探針，或者用保藏號AAF97058產生針對高爾基體甘露糖苷酶IB或IC的探針。用于PCR的寡核苷酸能根據GenBank序列設計。得到的探針能與單拷貝的高爾基體甘露糖苷酶IA、IB或IC基因雜交。然后能用該探針篩查可商品獲得的重組噬菌體文庫(例如由人基因組DNA制成的文庫)，以分離含有全部或部分甘露糖苷酶I結構基因的克隆。一旦分離含有甘露糖苷酶調節和/或編碼序列的重組克隆，即可構建用來滅活甘露糖苷酶基因表達的特異導向質粒。甘露糖苷酶活性的滅活是由于向調節或編碼序列中插入外源DNA，而破壞了翻譯閱讀框。該酶的滅活也可能是mRNA轉錄或mRNA加工破壞的結果，或者是由于內源甘露糖苷酶調節或編碼序列的缺失。
其它1類和2類加工甘露糖苷酶的核酸序列也可獲得，例如從GenBank獲得。利用以上對于高爾基體甘露糖苷酶IA、IB或IC所述的方法，能產生其它1類和/或2類加工甘露糖苷酶的敲除細胞。
甘露糖苷酶敲除細胞例如能用于基因治療。能對患者(如戈謝病患者)施用敲除細胞，使細胞在體內產生hmGCB。
反義甘露糖苷酶核酸序列
相對于編碼甘露糖苷酶(如1類加工或2類加工甘露糖苷酶)的核苷酸反義的核酸分子能作為抑制甘露糖苷酶表達的滅活劑。例如，高爾基體甘露糖苷酶IA、高爾基體甘露糖苷酶IB、高爾基體甘露糖苷酶IC和/或高爾基體甘露糖苷酶II表達能被反義核酸分子抑制。“反義”核酸包括與編碼甘露糖苷酶的“有義”核酸互補，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸能與有義核酸形成氫鍵。反義核酸能與完整甘露糖苷酶編碼鏈或只是與其一部分互補。例如，能使用相對于編碼甘露糖苷酶的核苷酸序列的編碼鏈“編碼區”反義的反義核酸分子。
由于在例如Bause(1993)Eur.J.Biochem.217(2)535-540；Gonzalez等人(1990)J.Biol.Chem.274(30)21375-21386；Misago等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(25)11766-11770；Tremblay等人(1998)Glycobiology 8(6)585-595；Tremblay等人(2000)J.Biol.Chem.Jul 27[電子出版物，待印刷]中公開了編碼多種甘露糖苷酶的編碼鏈序列，可根據Watson和Crick堿基配對原則設計反義核酸。反義核酸分子能包含與甘露糖苷酶mRNA的完整編碼區互補的序列，但更優選地是只與甘露糖苷酶mRNA的編碼區或非編碼區的一部分互補的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸能包含與甘露糖苷酶mRNA翻譯起始位點周圍的區域互補的序列。反義寡核苷酸的長度可以是，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸。反義核酸能用本領域周知的方法用化學合成法和酶連接反應構建。例如，能用自然存在的核苷酸或為了提高分子生物學穩定性或提高反義和有義核酸之間形成的雙螺旋的物理穩定性而不同修飾的核苷酸化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如，能使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。能用來產生反義核酸的修飾核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、ybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。此外，也能用以反義方向(即，由插入核酸轉錄的RNA相對于目的靶核酸是反義方向的)亞克隆了一種核酸的表達載體生物學產生反義核酸。
hmGCB的純化
術語“純化的”hmGCB在此使用時是指當由表達GCB的細胞產生時基本上不含細胞物質的hmGCB。詞語“基本上不含細胞物質”包括蛋白質與產生細胞的成分分開的hmGCB制劑。在一個實施方案中，詞語“基本上不含細胞物質”包括含有不到約30％(干重)非GCB蛋白(也稱為“蛋白質雜質”或“污染蛋白”)、更優選地不到約20％的非GCB蛋白、更優選地不到約10％的非GCB蛋白、最優選地不到約5％的非GCB蛋白的hmGCB制劑。當從培養基中獲得(即收獲)hmGCB時，也優選地基本上不含培養基成分，即，培養基成分不到蛋白質制品干重的約20％、更優選地不到約10％、最優選地不到約5％。
能用多種方法從培養基中收獲hmGCB。術語“收獲的hmGCB”在此使用時是指從培養基或從細胞中獲得的hmGCB。例如，能用下列備選方法之一在純化步驟之前制備收獲的hmGCB。可包括1)過濾新鮮收獲物；2)過濾新鮮收獲物，并在約-20℃到-80℃下冷凍過濾的產物直到準備加工(此時可融解，任選地過濾)；3)過濾新鮮收獲物，濃縮過濾產物(例如，約8-10倍)，然后任選地再次過濾；4)過濾新鮮收獲物，濃縮過濾產物(例如，約8-10倍)，任選地再次過濾，然后在約-20℃到-80℃下冷凍過濾的產物直到準備加工(此時可融解，任選地過濾)。也可進行這些備選方法的變更方法。例如，當冷凍收獲產物或濃縮的收獲產物時，不同收獲物能在融解和過濾后合并。另外，對于收獲的或濃縮的收獲產物，能將產物在純化之前保持在冷卻溫度下例如約2℃到8℃下較短時間，例如約1-3天，優選地1天。在純化之前能合并保持在冷卻溫度下的收獲產物。
當進行收獲物的濃縮時，能使用分子量截止值為5000-50000、優選地10000-30000的超濾膜。過濾澄清一般使用1.2μm/0.5μm預過濾器，隨后用0.2μm終過濾器。
HmGCB能用下列純化技術純化。例如，能用疏水電荷誘導層析(HCIC)純化hmGCB制劑。此外，也能用疏水作用層析(HIC)純化hmGCB制劑。HCIC和HIC均在下面描述。
HCIC和HIC能單獨使用或與一個或多個離子交換步驟結合使用。能與HCIC或HIC步驟結合使用的離子交換步驟(在HCIC或HIC之前或之后)包括使用陰離子交換和/或陽離子交換層析。在蛋白質純化中使用的公知可購得的陰離子交換載體具有季銨功能基團。本方法中使用的優選基質是基于瓊脂糖或纖維素的基質，如微晶纖維素或交聯瓊脂糖。含有二乙基氨乙基、三乙基氨甲基或三甲基氨甲基功能基團的基質也是特別優選的。一種特別優選的陰離子交換基質是可以購得的三甲基氨甲基交聯瓊脂糖，如，Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)。可在蛋白質純化中使用的公知可購得的陽離子交換載體具有酸性功能基，包括羧基和磺酸。含有陽離子功能基的基質包括多種形式的基于纖維素和聚苯乙烯的基質。例如，本領域公知的弱陽離子交換劑包括但不限于羧甲基-Sepharose和羧甲基-纖維素。本領域公知的強陽離子交換劑包括但不限于磺化聚苯乙烯(AG 50W，Bio-Rex 70)、磺化纖維素(SP-Sephadex)和磺化Sepharoses(S-Sepharoses)。一種特別優選的陽離子交換基質是S-Sepharoses Fast Flow(Pharmacia)。
涉及這些基質的層析步驟最優選地作為柱層析步驟或以另一種分批吸附技術進行，任選地能在25℃至40℃的溫度下進行。優選地，向洗滌或洗脫緩沖液中加入一種鹽以提高緩沖液的離子強度。如果能被本領域技術人員容易地測定，常規使用的任何鹽均可用于這一目的，NaCl是最常用的鹽之一。
一種常規凝膠過濾步驟也能與HCIC或HIC層析步驟組合使用。這些基質的代表性實例是與丙烯酰胺交聯的葡聚糖，如烯丙基葡聚糖與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和交聯纖維素或瓊脂糖凝膠共價交聯制備的復合親水凝膠。可購得的交聯葡聚糖-丙烯酰胺的商品名為Sephacryl，可從Pharmacia獲得。可購得的交聯葡聚糖-瓊脂糖樹脂的商品名為Superdex，可從Pharmacia獲得。一種優選的Superdex凝膠是Superdex 200。交聯纖維素凝膠的例子是可購得的交聯多孔纖維素凝膠，例如可從Amicon Inc.獲得的GLC300或GLC1000。能使用基于硅石的樹脂如可從TosoHaas獲得的TSK-Gel SW。基于聚合物的樹脂如TSK-Gel PW、TSK Alpha Series、Toyopearl HWpackings(乙二醇與丙烯酸甲酯聚合物的共聚作用)也可從TosoHaas獲得。
優選地，HCIC或HIC能與這些離子交換步驟中的一種或多種組合。當使用HCIC或HIC與不同離子交換或凝膠過濾步驟的組合時，它們能以任何順序進行。例如，如下所述，能進行一種四步方法，包括利用MEP Hypercel層析的HCIC或利用MacroPrep Methyl層析的HIC，然后是Q Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow和最后的Superdex 200。以下更詳細地敘述了幾種這樣的方法。
MEP Hypercel層析
MEP(巰基乙基吡啶)Hypercel(BioSepra，Life Technologies)能用于HCIC。它是一種由與再生的多孔纖維素珠(80-100微米)連接的NEP組成的樹脂。由疏水尾和可電離首基組成的功能基團(MEP)在中性pH下不帶電荷，在生理離子強度下基于疏水相互作用能結合特定的蛋白質配基。通過將pH由4提高為5進行洗脫，此時MEP帶正電，由于靜電排斥蛋白質從柱上洗脫。例如，制備的收獲物或收獲濃縮物能直接加到用含180mM氯化鈉和2mM DTT的25mM磷酸鈉，pH6.8平衡的MEP柱上。任選地，用含25mM辛酸鈉的平衡緩沖液洗滌該柱，直到280nm的吸光度(A280)穩定。能用50mM乙酸鈉、2mM DTT，pH4.7從柱上洗脫hmGCB，收集在280nm下監測到的峰。
MacroPrep Methyl層析
MEP Hypercel的一種備選物是MacroPrep Methyl，它是一種疏水作用層析(HIC)樹脂。該樹脂由與多孔共聚乙二醇異丁烯酸和二甲基丙烯酸二甘醇酯的珠組合物連接的甲基功能基團組成。例如，MacroPrep Methyl(BioRad)層析能如下進行。將收獲物或收獲濃縮物的pH調節為5.6，加入硫酸銨至終濃度為0.70M。制備的收獲物加到用0.70M硫酸銨、10mM MES，pH5.6平衡的MacroPrep Methyl柱上。加樣后，用平衡緩沖液洗滌該柱，直到A280回到基線。用10mMMES，pH5.6洗脫hmGCB。超濾和/或滲濾洗脫的hmGCB，準備進行離子交換步驟，如Q Sepharose層析、SP Sepharose層析和/或Superdex200層析。
Q Sepharose層析
Q Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)是一種相對較強的陰離子交換層析樹脂。功能取代基是一種季胺基，它在pH2-12的工作pH范圍內帶正電。在工作pH下帶凈負電荷的蛋白質在相對較低的離子強度下傾向于結合樹脂，在較高離子強度或較低pH下能被洗脫。在接近pH6和低離子強度下，hmGCB不能結合Q Sepharose，但雜質可以結合，由此純化樣品。例如，能用下列方案經Q SepharoseFast Flow層析純化樣品中的hmGCB。在適當的條件下，hmGCB流經該柱，于是產物出現于流通/洗滌級分中。向如上所述制備的MEP洗脫合并液中加入磷酸鈉(250mM，pH6)至終濃度為25mM，用NaOH(必要時用HCl)將合并液的pH調節為pH6。通過用水稀釋或用接近pH6的25mM磷酸鈉、2mM DTT超濾和/或滲濾，將傳導率調節為2.5±0.1mS/cm。然后過濾該物質，加到用25mM磷酸鈉、2mM DTT，pH6平衡的Q Sepharose Fast Flow柱上。加樣后，用平衡緩沖液洗滌該柱，直到A280達到基線。之后不久，例如在24小時內，流通/洗滌級分可通過另一個柱子(如SP Sepharose Fast Flow柱)，或者在進一步處理之前在約-20℃到-80℃下凍存。
能使用其它強陰離子交換樹脂，如Macro-Prep High Q Support(BioRad)，代替Q Sepharose。也能使用較弱的陰離子交換樹脂如DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia)或Macro-Prep DEAE(BioRad)。該柱用緩沖液(如25mM磷酸鈉，pH6)平衡。調節樣品的pH為pH6，通過稀釋或滲濾為相對較低的離子強度調節傳導率，這使雜質結合于柱上，而hmGCB流過。加樣，用平衡緩沖液洗柱。雜質仍結合于柱上，能用鹽如氯化鈉或氯化鉀，或用較低pH的緩沖液，或增多的鹽和較低pH的組合洗脫。
也能使hmGCB在加樣期間與陰離子交換柱結合，方法包括降低加樣中的鹽濃度，或在較高pH下使用該柱，或減少鹽和較高pH的組合。
SP Sepharose層析
SP Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)是一種相對較強的陽離子交換層析樹脂。功能取代基是帶電的磺酸基，它在pH2-12的工作pH范圍內帶負電荷。在工作pH下帶凈正電荷的蛋白質在相對較低的離子強度下傾向于結合樹脂，在較高離子強度或較高pH下能被洗脫。在接近pH6和中離子強度(例如6.5mS/cm)下，hmGCB能結合SP Sepharose，在較高離子強度(例如10.7mS/cm)下能被洗脫。在hmGCB洗脫條件下雜質蛋白仍結合于SP Sepharose，由此純化樣品中的hmGCB。例如，能用下列方案經SP Sepharose Fast Flow層析純化hmGCB。向Q Sepharose流通/洗滌液中加入氯化鈉(2.0M貯存液)直到傳導率為6.3mS/cm。檢查pH，必要時重新調節為pH6.0。然后，繼續加入氯化鈉貯存液直到傳導率為6.5mS/cm。過濾該物質，加到用25mM磷酸鈉、44mM氯化鈉，pH6.0平衡的SP Sepharose FastFlow柱上。加樣后，用平衡緩沖液洗柱，直到達到基線，并用25mM磷酸鈉、84mM氯化鈉，pH6.0洗脫。HmGCB存在于洗脫級分中。
另一種陽離子交換樹脂，例如Source 30S(Pharmacia)、CMSepharose Fast Flow(Pharmacia)、Macro-Prep CM Support(BioRad)或Macro-Prep High S Support(BioRad)能作為SPSepharose的備選物。在接近pH6和低到中度離子強度下，如4-7mS/cm，hmGCB能與該柱結合。用一種緩沖液(如10mM檸檬酸鈉，pH6.0，10mM MES，pH6.0，25mM磷酸鈉，pH6.0)或在pH6.0時有足夠緩沖能力的其它緩沖液平衡該柱。通過稀釋或滲濾調節樣品的離子強度，直到適合與該柱結合的水平。樣品加于柱上，加樣后洗柱以除去未結合的物質。用一種鹽(如氯化鈉或氯化鉀)從柱上洗脫hmGCB。此外，也能用較高pH或較高鹽濃度與較高pH結合的緩沖液從柱上洗脫hmGCB。
也可使hmGCB在加樣過程中流經陽離子交換柱，方法包括提高平衡緩沖液和加樣樣品中的鹽濃度，在較高pH下使用該柱，或增多的鹽和較高pH的組合。
Superdex 200層析
Superdex 200 prep grade(Amersham Pharmacia)用于hmGCB的大小排阻層析，由此根據大小、分子量、撞擊(strokes)半徑或流體體積分離分子。Superdex 200由與瓊脂糖共價交聯的葡聚糖組成，對于球狀蛋白質有10000-60000分子量的分級分離范圍。例如，能用下列方案經Superdex 200層析純化hmGCB。SP洗脫合并液用10000mw截止值的膜超濾濃縮。過濾濃縮的合并液，然后加于用50mM檸檬酸鈉，pH6.0平衡的Superdex 200 prep grade柱上。收集最初級分中柱流出液的A280，例如，運行8-16％SDS聚丙烯酰胺凝膠，確定級分的合并。可根據銀染色凝膠的目視檢查判斷合并。
也能用其它大小排阻層析樹脂如Sephacryl S-200HR、Bio-GelA1.5m或TosoHaas TSK Gel樹脂純化hmGCB。用于hmGCB大小排阻層析的緩沖液是50mM檸檬酸鈉，pH6.0。也能使用其它緩沖液，如含有0.15M氯化鈉的25mM磷酸鈉，pH6.0。緩沖液的pH可以為pH5-7，應當有足夠的離子強度使得與柱的離子相互作用最小。
上述任何純化方案中pH、緩沖液和/或鹽濃度的改變能用常規方法進行，以獲得希望的純化產物。
測定巨噬細胞攝取和hmGCB的細胞導向的試驗
例如通過測定巨噬細胞中的蛋白質水平和/或酶活性可測定巨噬細胞對hmGCB的攝取率。例如，如以下實施例和Diment等人(1987)J.Leukocyte Biol.42485-490所述，能用利用巨噬細胞系的一種體外試驗測定hmGCB的完全攝取和甘露糖受體特異的攝取。
另外，肝細胞對hmGCB和GCB的攝取的體內對比能如Friedman等人(1999)Blood 932807-2816所述確定。簡言之，能對一種小鼠模型注射hmGCB或GCB，然后在不久后殺死。用動物肝臟制備肝細胞(如實質細胞、枯否細胞、內皮細胞和肝細胞)懸液。然后分離細胞，根據形態學鑒定，測定不同肝細胞型中hmGCB和GCB的蛋白質水平和/或酶活性。此外，也可用免疫組化檢測將hmGCB定位于所治療動物的組織中的特定細胞或細胞型。
藥用組合物
高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)能摻入適于對患者(如病人)施用的藥用組合物中。該組合物可包含足夠劑量的hmGCB來治療戈謝病患者。在此使用時，詞語“藥學可接受的載體”是指包括適于藥用的任何和所有溶劑、賦形劑、分散劑、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這些基質和藥劑用于藥學活性物質的使用在本領域中眾所周知。只要不是任一常規基質或藥劑不適于活性化合物，這種基質即能在本發明的組合物中使用。補充的活性化合物也能摻入組合物中。
配制本發明的藥用組合物使其適于預期的施用途徑。施用途徑的例子包括腸胃外，例如靜脈內、皮內和皮下施用。優選地，施用途徑是靜脈內。用于腸胃外施用的溶劑或懸液可包含下列成分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸脂；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調節張力的試劑如氯化鈉或右旋葡萄糖。pH能用酸或堿(如鹽酸或氫氧化鈉)調節。腸胃外制劑能包封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。
適于注射使用的藥用組合物包括無菌水溶液(水溶時)或分散和無菌粉末，例如凍干的制劑，用于臨時制備無菌注射液或分散。對于靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、制菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，并且應當是流體以便具有易注射性。它在生產和貯存條件下必須穩定，并且必須可在保存中防止微生物如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，包括如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，及其適當的混合物。例如，使用包被如卵磷脂，在分散時保持需要的顆粒大小，使用表面活性劑，能保持適當的流動性。預防微生物的作用能用多種抗細菌劑和抗真菌劑實現，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，組合物中優選地包含等滲劑，例如糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉。在組合物中含有延遲吸收的試劑，如一硬脂酸鋁、人血清白蛋白和明膠，能使可注射組合物的穩定性延長。
無菌注射液能如下制備在含有上述一種或組合的成分的適當溶劑中摻入需要量的hmGCB，必要時，隨后過濾除菌。一般通過向含有基本分散劑和需要的上述其它成分的無菌載體中摻入活性化合物進行分散。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，例如凍干，這產生活性成分加預先無菌過濾溶液的希望的其它任何成分的粉末。
在一個優選實施方案中，活性化合物用可保護化合物免于從體內快速消除的載體制備，例如控釋制劑，包括植入物和微膠囊輸送系統。能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法為本領域技術人員所知。材料也能從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.購得。脂質體懸液(包括針對用病毒抗原的單克隆抗體感染的細胞的脂質體)也能用作藥學可接受的載體。它們能按照本領域技術人員周知的方法制備，如美國專利號4,522,811所述。
戈謝病的治療
HmGCB，例如任何hmGCB分子或此處所述的制劑，能用來治療戈謝病患者。此外，也能將此外所述的任何甘露糖苷酶敲除細胞導入戈謝病患者中，以對患者輸送hmGCB。能使用不同施用途徑和不同部位。在植入個體中后，敲除細胞能產生hmGCB。
優選地，使用的敲除細胞一般是患者特異的遺傳工程細胞。但是，從同種不同個體或從不同種獲得細胞也是可能的。使用這些細胞可能需要施用免疫抑制劑，改變組織相容性抗原，或使用可預防植入細胞排斥的屏障裝置。
戈謝病是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCB)缺陷。GCB水解在白細胞和紅細胞膜中的鞘糖脂降解后形成的糖脂葡糖腦苷脂。如果GCB水解不充分，則葡糖腦苷脂能在巨噬細胞(戈謝細胞)中積累，導致貧血、血小板減少、器官肥大和嚴重的骨骼問題。
戈謝病有幾種類型，包括1型、2型和3型戈謝病，可由于GCB基因的不同突變而引起。能對戈謝病患者施以“治療有效量的”hmGCB，即足以治療戈謝病的hmGCB的劑量。術語“治療”在此使用時是指減少或抑制戈謝病的一種或多種癥狀。I型戈謝病的癥狀包括骨骼并發癥，如骨痛、骨損傷、骨質減少、骨壞死、無血管性壞死和病理性骨折；貧血；肝脾腫大；脾節結和肝功能障礙；血小板減少；和/或生長和青春期發育延遲。II型戈謝病的癥狀包括I型戈謝病的癥狀，以及頸強直、冷漠、緊張、斜視、深反射和喉痙攣增強。III型戈謝病的癥狀除了發作較輕和較晚外類似于II型戈謝病。
治療有效量的hmGCB可根據個體確定，至少部分地基于患者體重、使用的藥劑、使用的施用系統的類型、相對于疾病嚴重程度的施用時間，以及是使用單劑量、多劑量還是控釋劑量方案。優選地，足以治療戈謝病的hmGCB的劑量低于人組織產生的或人胎盤產生的GCB的量，或細胞體外產生、然后修飾暴露核心甘露糖殘基的GCB。
其它溶酶體貯積病的治療
此處所述的本發明一般能用來生產可導向在表面表達甘露糖受體的任何細胞的蛋白質。因此，此處所述的本發明能用來治療希望向甘露糖受體表達細胞導向一種治療蛋白質的任何疾病。例如，此處所述的本發明也能用于其它溶酶體貯積酶和其它溶酶體貯積病，其中細胞(如網狀內皮來源的細胞)積累未消化的底物。網狀內皮細胞包括肝臟中的巨噬細胞、枯否細胞和脾中的組織細胞。這些溶酶體貯積病包括但不限于法韋爾病和Neimann-Pick病。
法韋爾病是一種常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于酸性神經酰胺酶缺陷。神經酰胺酶是引起神經酰胺降解的酶。如果神經酰胺降解不充分，則神經酰胺積累，導致肉芽腫形成和組織細胞反應(Moser，H.W.神經酰胺酶缺陷法韋爾脂肪肉芽腫癥；于《遺傳病的代謝與分子基礎》(C.R.Scriver，A.L.Beaudet，W.S.Sly和D.Valle編寫)，第7版，2589-2599頁，McGraw-Hill Inc.，紐約(1995))。
法韋爾病有幾種類型，包括I型、2型、3型、4型和5型法韋爾病，它們在嚴重程度和主要組織參與部位上不同。也有6型和7型法韋爾病。能對法韋爾病患者施以高甘露糖酸性神經酰胺酶，以治療(即緩解或減少)該疾病的至少一種癥狀。1型法韋爾病的癥狀包括關節(特別是指骨間、掌、踝、腕、膝和肘關節)腫脹，與患處關節有關的和壓點上可觸及的結節，可發展為失聲的嘶叫，進食和呼吸困難，體重增加較差和間歇性發熱。這些癥狀一般在2周和4個月大之間發生。2型和3型法韋爾病的癥狀包括皮下結節、關節變形和累及喉。這些患者比1型法韋爾病患者存活期長。5型法韋爾病的癥狀包括從1到2.5歲時開始的精神運動性退化。
A型和B型Neimann-Pick病是常染色體隱性溶酶體貯積病，其特征在于酸性鞘磷脂酶缺陷。酸性鞘磷脂酶是一種引起鞘磷脂降解的酶。如果鞘磷脂酶缺陷，鞘磷脂和其它脂類能在單核細胞-巨噬細胞系統中積累(Schuman，E.H.和Desnick，R.J.A型和B型Neimann-Pick病酸性鞘磷脂酶缺陷；于《遺傳病的代謝與分子基礎》(C.R.Scriver，A.L.Beaudet，W.S.Sly和D.Valle編寫)，第7版，2589-2599頁，McGraw-Hill Inc.，紐約(1995))。
Neimann-Pick病有幾種類型，包括A型和B型。能對Neimann-Pick病患者施以高甘露糖酸性鞘磷脂酶，以治療(即緩解或減少)該病的至少一種癥狀。A型Neimann-Pick病的癥狀包括脾和肝增大、淋巴結病、小細胞性貧血、血小板計數減少、張力減退、肌無力、精神運動性阻抑。B型Neimann-Pick病的癥狀包括肝和/或脾增大、肝脾腫大(heptosplenomegaly)；肺損傷。
因此，高甘露糖溶酶體貯積酶如高甘露糖酸性神經酰胺酶或高甘露糖酸性鞘磷脂酶能用此處所述的方法產生，以便將這些蛋白質導向甘露糖受體表達細胞。
實施例
在使用表達Gene-ActivatedTM GCB(GA-GCB)的HT-1080細胞的實驗中，細胞用濃度為0.1-2μg/mL的kifunensine或苦馬豆素處理。
kifunensine或苦馬豆素對GA-GCB糖型(glycoform)的作用
將產生GA-GCB的HT-1080細胞一式兩份接種于6孔板上，并將生產培養基調節為以下的kifunensine或苦馬豆素濃度0(無藥物)、0.1、0.25、0.5、1和2μg/mL。收獲培養基，每24小時重新補充細胞共三天。對第三天的樣品進行等電聚焦(IEF)分析。通過IEF分析顯示kifunensine和苦馬豆素對GA-GCB的分子電荷的影響。對于這兩種藥物，都觀察到表觀等電點(pI)的濃度依賴的提高，在最高測試濃度(2μg/ml)時，kifunensine比苦馬豆素引起更大的pI遷移。
kifunensine或苦馬豆素對GA-GCB產生的影響
10個搖瓶(每個表面積1700cm2)的生長培養基(含10％小牛血清的DMEM)中接種產生GA-GCB的HT-1080細胞。在生長兩周后，吸出培養基，向三組搖瓶中加入新鮮生產培養基(DMEM/F12，0％小牛血清)。兩組4只搖瓶用1μg/mL kifunensine或苦馬豆素處理。第三組兩只搖瓶不接受藥物處理。大約24小時后，從每個搖瓶中收獲培養基，合并，對樣品進行GA-GCB酶活性分析。這一步驟重復7天。對于所有搖瓶，在7種日收獲物中都觀察到GA-GCB的穩定產生(表1)。然而，酶的絕對水平因藥物處理組而不同，在7種收獲物中觀察到以下平均GA-GCB產生水平38.3±3.5mg/L(對照，未藥物處理)、24.5±4.0mg/L(苦馬豆素，1μg/ml)和21.3±2.8mg/L(kifunensine，1μg/ml)。因此，這兩種藥物都導致穩定的、但是較低的產生水平，kifunensine見到最大降低(與對照相比降低44％)。
表1.甘露糖苷酶抑制劑處理的細胞中葡糖腦苷脂酶的搖瓶生產a)測定如下進行待測物質與酶底物(4-甲基傘形基-β-D-吡喃葡糖苷)混合，在37℃下溫育1小時。加入NaOH/甘氨酸緩沖液終止反應。用熒光分光光度計定量熒光。b)比活性2500單位/mg。一單位定義為在37℃下1小時內轉化1μ摩爾底物。
kifunensine或苦馬豆素對巨噬細胞攝取GA-GCB的影響
在體外試驗中用HT-1080細胞產生的GA-GCB測定小鼠巨噬細胞細胞系的攝取效率。該實驗的具體目標是測定小鼠J774E細胞中GA-GCB的絕對和甘露糖受體特異的攝取。測定前一天，將J774E細胞以50000細胞/cm2平板接種于12孔板的生長培養基中。為了測定，向細胞加入0.5mL含50nM維生素D3(1，2-5，二羥基維生素D3)的生產培養基(DMEM/F12，0％小牛血清)。在2μg/mL甘露聚糖(甘露糖受體的一種競爭劑)的存在或不存在下，向測試孔中加入未純化的GA-GCB(來自收獲物4，表1)，至終濃度為10μg/mL。使用三種不同形式的GA-GCB來自kifunensine(1μg/mL)處理的細胞的GA-GCB，來自苦馬豆素(1μg/mL)處理的細胞的GA-GCB，來自未處理的細胞的GA-GCB(1μg/mL)。對照細胞不接受GA-GCB。孔在37℃下溫育4小時，然后用緩沖鹽水充分洗滌，刮到GA-GCB酶反應緩沖液中，經過2次凍/融循環，離心澄清。然后定量測定上清液的酶活性和總蛋白。GA-GCB向小鼠J774E細胞中的內化在表2中顯示，以單位/mg細胞裂解物報告。結果證明，來自kifunensine處理的細胞的GA-GCB的攝取比背景高14倍，可被甘露聚糖抑制73％，而來自苦馬豆素處理的細胞的GA-GCB比背景高7倍，可被甘露聚糖抑制67％。另外，也證明來自未處理的細胞的GA-GCB比背景約高3倍，可被甘露聚糖抑制53％。因此，kifunensine或苦馬豆素對胞內甘露糖苷酶的抑制產生能通過甘露糖受體有效轉運到細胞中的GA-GCB，kifunensine引起比苦馬豆素約高2倍的攝取。因此通過在kifunensine或苦馬豆素存在下生產GA-GCB，能優化GA-GCB通過甘露糖受體向細胞導向的提高。
表2.葡糖腦苷脂酶向J774E細胞中的內化。甘露糖苷酶抑制劑處理的細胞產生的葡糖腦苷脂酶。a)測定如下進行樣品與酶底物(4-甲基傘形基-β-D-吡喃葡糖苷)混合，在37℃下溫育1小時。加入NaOH/甘氨酸緩沖液終止反應。用熒光分光光度計定量熒光。凍/融細胞裂解物中的總蛋白用二金雞寧酸(BCA)測定。活性報告為單位/mg總蛋白。一單位定義為在37℃下1小時內轉化1μ摩爾底物。b)藥物處理的細胞在甘露聚糖(2μg/mL)存在或不存在下接受1μg/mL kifunensine或苦馬豆素。
hmGCB的純化和表征
從在濃度為2μg/ml的kifunensine存在下生長的人成纖維細胞的培養基中純化hmGCB。hmGCB上存在的4個N連接的聚糖用肽N-糖苷酶F釋放，用Sep-pak C18柱純化。在5％乙酸級分中洗脫的寡糖用氫氧化鈉和甲基碘化物預甲基化，溶解于甲醇∶水(80∶20)中，預甲基化的聚糖混合物部分用基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)分析。
用Voyager STR Biospectrometry ResearchStation激光解吸質譜儀結合使用2，5-二羥基苯甲酸基質的延遲提取分析樣品。在m/z 1500-2500范圍內見到假分子離子模式，表明存在Man5GlcNAc2到Man9GlcNAc2的高甘露糖聚糖。
表3.MALDI-TOF-MS分析kifunensine處理細胞的hmGCB的N-聚糖獲得的數據概表
存在的最豐富的高甘露糖聚糖是Man9GlcNAc2和Man8GlcNAc2，Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2和Man5GlcNAc2的豐度降低。發現有痕量的含兩個唾液酸殘基的巖藻糖二天線復合聚糖。通過測量峰高獲得每種聚糖的相對豐度的近似指標。見表3。對高甘露糖聚糖平均鏈長的更精確的估計通過MALDI-TOF-MS分析完整糖蛋白獲得。由于聚糖鏈的同質性在m/z62483.1處獲得頂點。由氨基酸序列計算的成熟肽的質量為55577.6，表明4個N-連接的聚糖鏈為hmGCB的總質量貢獻了6905.5。根據這一數字，能計算平均聚糖長度為8.15個甘露糖殘基。
此處引用的所有專利和參考文獻均完整引用作為參考。
其它實施方案在下列權利要求書中。
權利要求
1.一種生產高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)的方法，包括
提供一種能表達葡糖腦苷脂酶(GCB)的細胞；和
在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產含有前體寡糖的GCB，從而生產一種hmGCB制劑。
2.權利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
3.權利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，3甘露糖殘基。
4.權利要求1的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，6甘露糖殘基。
5.權利要求1的方法，其中該方法包括使細胞接觸一種物質，該物質可防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基。
6.權利要求5的方法，其中該物質是一種甘露糖苷酶抑制劑。
7.權利要求6的方法，其中該甘露糖苷酶抑制劑是一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑。
8.權利要求6的方法，其中該甘露糖苷酶抑制劑是一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
9.權利要求7的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑選自kifunensine、deoxymannojirimycin和其組合。
10.權利要求7的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑是kifunensine。
11.權利要求8的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑選自苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM和其組合。
12.權利要求8的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
13.權利要求6的方法，其中甘露糖苷酶抑制劑以約0.05-20.0μg/ml的濃度存在。
14.權利要求13的方法，其中甘露糖苷酶抑制劑以約0.1-2.0μg/ml的濃度存在。
15.權利要求7的方法，其還包括使細胞接觸一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
16.權利要求15的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑選自苦馬豆素、mannostatin和其組合。
17.權利要求15的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑是苦馬豆素。
18.權利要求1的方法，其中細胞是至少一種甘露糖苷酶的敲除體。
19.權利要求18的方法，其中細胞是1類加工甘露糖苷酶的敲除體。
20.權利要求18的方法，其中細胞是2類加工甘露糖苷酶的敲除體。
21.權利要求18的方法，其中細胞是1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的敲除體。
22.權利要求1的方法，其中細胞含有一種反義甘露糖苷酶分子。
23.權利要求22的方法，其中所述反義分子選自1類加工甘露糖苷酶反義分子、2類加工甘露糖苷酶反義分子、1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子兩者。
24.權利要求1的方法，其中hmGCB具有一條至少含4個甘露糖殘基的糖鏈。
25.權利要求24的方法，其中hmGCB具有一條至少含5個甘露糖殘基的糖鏈。
26.權利要求24的方法，其中hmGCB具有一條至少含8個甘露糖殘基的糖鏈。
27.權利要求24的方法，其中hmGCB具有一條至少含9個甘露糖殘基的糖鏈。
28.權利要求1的方法，其中產生的hmGCB的甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基。
29.權利要求1的方法，其中在hmGCB的至少2條糖鏈上防止去除一個或多個遠離五糖核心的甘露糖殘基。
30.權利要求1的方法，其中制品中至少60％的hmGCB含有一條或多條糖鏈，其中防止去除一個或多個遠離五糖核心的甘露糖殘基。
31.權利要求1的方法，其中細胞含有一種包含GCB編碼區的外源核酸序列。
32.權利要求31的方法，其中細胞還包含一種作用為調節GCB編碼區表達的外源調節序列。
33.權利要求1的方法，其中細胞含有一種作用為調節內源GCB編碼序列表達的外源調節序列。
34.權利要求1的方法，其中細胞是一種初級細胞。
35.權利要求1的方法，其中細胞是一種次級細胞。
36.權利要求1的方法，其中細胞是一種哺乳動物細胞。
37.權利要求36的方法，其中細胞是一種人細胞。
38.權利要求37的方法，其中細胞是一種成纖維細胞或成肌細胞。
39.權利要求37的方法，其中細胞是一種無限增殖化細胞。
40.權利要求39的方法，其中細胞是一種HT-1080細胞。
41.權利要求1的方法，其中提供能表達GCB的細胞群體，至少10％的細胞產生具有4條含特定數量甘露糖殘基的糖鏈的GCB。
42.權利要求5的方法，其中細胞在至少含有一種甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養。
43.權利要求42的方法，其中甘露糖苷酶抑制劑是1類加工甘露糖苷酶抑制劑。
44.權利要求43的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑選自kifunensine、deoxymannojirimycin和其組合。
45.權利要求42的方法，其中甘露糖苷酶抑制劑是2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
46.權利要求45的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑選自苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM和其組合。
47.權利要求43的方法，其中培養基中還含有一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
48.權利要求42的方法，其中hmGCB從培養細胞的培養基中獲得。
49.一種生產高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)的方法，包括
提供一種能表達葡糖腦苷脂酶(GCB)的細胞；和
在抑制1類加工甘露糖苷酶活性和2類加工甘露糖苷酶活性使得防止去除遠離GCB前體寡糖五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下產生含有前體寡糖的GCB，從而產生一種hmGCB制劑。
50.權利要求49的方法，其中使細胞接觸一種可抑制1類加工甘露糖苷酶的物質和一種可抑制2類加工甘露糖苷酶的物質。
51.權利要求49的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，2甘露糖殘基。
52.權利要求49的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，3甘露糖殘基。
53.權利要求49的方法，其中防止去除遠離五糖核心的一個或多個α1，6甘露糖殘基。
54.權利要求49的方法，其中所述物質是一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑。
55.權利要求49的方法，其中所述物質是一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑。
56.權利要求54的方法，其中1類加工甘露糖苷酶抑制劑選自kifunensine、deoxymannojirimycin和其組合。
57.權利要求55的方法，其中2類加工甘露糖苷酶抑制劑選自苦馬豆素、mannostatin、6-脫氧-DIM、6-脫氧-6-氟-DIM和其組合。
58.權利要求56或57的方法，其中甘露糖苷酶抑制劑以約0.05-20.0μg/ml的濃度存在。
59.權利要求49的方法，其中細胞是1類加工甘露糖苷酶的敲除體。
60.權利要求49的方法，其中細胞是2類加工甘露糖苷酶的敲除體。
61.權利要求49的方法，其中細胞是1類加工甘露糖苷酶和2類加工甘露糖苷酶的敲除體。
62.權利要求49的方法，其中細胞含有1類加工甘露糖苷酶反義分子。
63.權利要求49的方法，其中細胞含有2類加工甘露糖苷酶反義分子。
64.權利要求63的方法，其中細胞含有1類加工甘露糖苷酶反義分子和2類加工甘露糖苷酶反義分子。
65.權利要求49的方法，其中細胞含有一種包含GCB編碼區的外源核酸序列。
66.權利要求65的方法，其中細胞還含有一種用來調節GCB編碼區的表達的外源調節序列。
67.權利要求49的方法，其中細胞含有一種用來調節內源GCB編碼序列的表達的外源調節序列。
68.權利要求50的方法，其中細胞在含有至少一種1類加工甘露糖苷酶抑制劑和至少一種2類加工甘露糖苷酶抑制劑的培養基中培養。
69.權利要求68的方法，還包括從培養細胞的培養基中獲得hmGCB。
70.一種生產高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)的方法，包括
提供一種已導入含外源調節序列的核酸序列的細胞，使得該調節序列調節內源GCB編碼區的表達；和
在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下產生具有前體寡糖的GCB，從而產生一種hmGCB制劑。
71.一種高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)制劑，其含有至少一條含前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基的糖鏈。
72.權利要求71的hmGCB制劑，其中該hmGCB含有至少一條含5個甘露糖殘基的糖鏈。
73.權利要求71的hmGCB制劑，其中該hmGCB含有至少一條含8個甘露糖殘基的糖鏈。
74.權利要求71的hmGCB制劑，其中該hmGCB含有至少一條含9個甘露糖殘基的糖鏈。
75.權利要求71的hmGCB制劑，其中產生的hmGCB含有至少一條糖鏈，其甘露糖殘基與GlcNAc殘基之比大于3個甘露糖殘基比2個GlcNAc殘基。
76.權利要求71的hmGCB制劑，其中該hmGCB的至少2條糖鏈含有前體寡糖鏈的至少4個甘露糖殘基。
77.權利要求71的hmGCB制劑，其中制劑中至少85％的hmGCB含有4條糖鏈，其中防止去除一個或多個遠離五糖核心的甘露糖殘基。
78.一種藥用組合物，其含有
權利要求71的hmGCB制劑，其量適于治療戈謝病。
79.權利要求78的組合物，其進一步含有一種藥學可接受的載體或稀釋劑。
80.一種治療戈謝病患者的方法，包括
對患者施用權利要求78的組合物，由此治療戈謝病。
81.一種從樣品中純化hmGCB的方法，包括
提供收獲的hmGCB產物；和
對hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)或疏水作用層析(HIC)，
由此獲得純化的hmGCB。
82.權利要求81的方法，其中用MEP Hypercel進行HCIC。
83.權利要求81的方法，其中用MacroPrep Methyl進行HIC。
84.權利要求81的方法，其還包括對hmGCB產物進行離子交換層析。
85.權利要求84的方法，其中在離子交換層析之前對hmGCB產物進行HCIC或HIC。
86.權利要求84的方法，其中在HICI或HIC之前對hmGCB產物進行離子交換層析。
87.權利要求84的方法，其中對hmGCB產物進行一次以上的離子交換層析步驟。
88.權利要求84的方法，其中離子交換層析選自陰離子交換層析和陽離子交換層析。
89.權利要求88的方法，其中用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose Fast Flow、MacroPrep High Q Support、DEAE Sepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。
90.權利要求88的方法，其中用下列之一或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose Fast Flow、Source 30S、CM Sepharose FastFlow、Macro-Prep CM Support和Macro-Prep High S Support。
91.權利要求84的方法，其進一步包括對hmGCB產物進行大小排阻層析。
92.權利要求91的方法，其中用下列之一或多種進行大小排阻層析Superdex 200、Sephacryl S-200 HR和Bio-Gel A1.5m。
93.一種純化hmGCB的方法，包括
提供收獲的hmGCB產物；
對hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)或疏水作用層析(HIC)；和
對hmGCB產物進行陰離子交換層析、陽離子交換層析和大小排阻層析之一種或多種，
由此獲得純化的hmGCB。
94.權利要求93的方法，其中用MEP Hypercel進行HCIC。
95.權利要求93的方法，其中用MacroPrep Methyl進行HIC。
96.權利要求93的方法，其中用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose Fast Flow、MacroPrep High Q Support、DEAE Sepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。
97.權利要求93的方法，其中用下列之一種或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose Fast Flow、Source 30S、CM Sepharose FastFlow、Macro-Prep CM Support和Macro-Prep High S Support。
98.權利要求93的方法，其中用下列之一種或多種進行大小排阻層析Superdex 200、Sephacryl S-200HR和Bio-Gel A1.5m。
99.一種純化hmGCB的方法，包括
提供收獲的hmGCB產物；
對hmGCB產物進行疏水電荷誘導層析(HCIC)或疏水作用層析(HIC)；
對HCIC或HIC純化的hmGCB產物進行陰離子交換層析；
對陰離子交換純化的hmGCB進行陽離子交換層析；和
對陽離子交換純化的hmGCB進行大小排阻層析，
由此獲得純化的hmGCB。
100.權利要求99的方法，其中用MEP Hypercel進行HCIC。
101.權利要求99的方法，其中用MacroPrep Methyl進行HIC。
102.權利要求99的方法，其中用下列之一種或多種進行陰離子交換層析Q Sepharose Fast Flow、MacroPrep High Q Support、DEAE Sepharose Fast Flow和Macro-Prep DEAE。
103.權利要求99的方法，其中用下列之一種或多種進行陽離子交換層析SP Sepharose Fast Flow、Source 30S、CM SepharoseFast Flow、Macro-Prep CM Support和Macro-Prep High SSupport。
104.權利要求99的方法，其中用下列之一種或多種進行大小排阻層析Superdex 200、Sephacryl S-200HR和Bio-Gel A1.5m。
全文摘要
本發明表征了一種生產高甘露糖葡糖腦苷脂酶(hmGCB)的方法，包括提供一種能表達葡糖腦苷脂酶(GCB)的細胞；在防止去除遠離GCB前體寡糖的五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件下生產含有前體寡糖的GCB，從而生產一種hmGCB制劑。優選地，防止去除遠離五糖核心的至少一個甘露糖殘基的條件是抑制1類加工甘露糖苷酶和/或2類加工甘露糖苷酶。本發明也表征了一種hmGCB制劑和使用hmGCB制劑的方法。
文檔編號A61K38/43GK1392797SQ0180280
公開日2003年1月22日 申請日期2001年8月17日 優先權日2000年8月18日
發明者C·A·吉諾施塔, M·普拉施森特, M·布洛斯基, P·弗朗西斯-丹尼爾 申請人:核轉移治療公司