專利名稱：內切葡聚糖酶stce和含有內切葡聚糖酶的纖維素酶配制品的制作方法
技術領域：
本發明關于內切葡聚糖酶STCE(Endoglucanases STCE)和含有內切葡聚糖酶的纖維素配制品，以及利用它們對含有纖維素的纖維進行處理的方法。
背景技術：
以往，對于含有纖維素的纖維，為賦予纖維所期望的特性，采用纖維素酶對其進行處理。例如，在纖維產業中，為改善含有纖維素的纖維與皮膚的觸感和外觀，或者為使染色后的含有纖維素的纖維具有色澤局部性變化的“石磨”外觀，采用纖維素酶進行處理歐洲專利第307,564號說明書(專利文獻1)。
此外已知，染色后的含有纖維素的纖維，在反復清洗后，會起毛，染色布料的色澤也變得不鮮明。因此，通過在洗滌劑中含有纖維素酶，除毛或者使其不再起毛，可使得染色布料的色澤鮮明，即，使其澄澈化歐洲專利第220,016號說明書(專利文獻2)、國際公開第95/02675號小冊子(專利文獻3)、國際公開第97/30143號小冊子(專利文獻4)、國際公開第98/08926號小冊子(專利文獻5)，含有纖維素酶的洗滌劑主要在歐洲銷售。
對于洗滌中使用的纖維素酶，已知在洗滌劑中，腐質霉屬(Humicola)來源的純化的43kD內切葡聚糖酶成分(EGV)的澄澈化活性(除去布料中起的毛，使布料色澤鮮明的活性)是以往的由多種纖維素成分混合而成的纖維素配制品的約30倍國際公開第91/17243號小冊子(專利文獻6)。此外已知，通過使來源于腐質霉屬的內切葡聚糖酶NCE5(以下有時簡稱為NCE5)在洗滌劑中發生反應，也可達到染色布料澄澈化的效果國際公開第01/90375號小冊子(專利文獻7)。進而已知，在洗滌劑中，根霉屬(Rhizopus)來源的內切葡聚糖酶RCEI(以下有時簡稱為RCEI)表達增強的Humicola insolens培養液的澄澈化活性是RCEI表達未增強的Humicola insolens培養液的20倍以上國際公開第00/24879號小冊子(專利文獻8)。
像這樣，盡管已知有多種內切葡聚糖酶具有使染色布料澄澈化活性，然而實際和歐美洗滌劑配合使用時，能夠充分發揮活性的內切葡聚糖酶卻很少。這被認為是由于歐美洗滌劑中含有大量陰離子表面活性劑、增效組分等，抑制了酶的活性。
此外，歐美洗滌用自來水一般硬度較高，含有大量的Ca2+、Mg2+等2價陽離子。這些2價陽離子可顯著降低洗滌劑中的表面活性劑的洗滌能力，因而，為吸附這些2價陽離子，洗滌劑中配合有增效組分Fragrance Journal，1995年，11卷，p.33-55(非專利文獻1)。此外，由于自來水的硬度因地域而差別很大，在洗滌劑中配合的增效組分的種類和添加量上，也根據地域不同頗費工夫。此外，已知不僅洗滌劑的洗滌能力，而且纖維素酶的活性也受到這些2價陽離子的影響Mansfield，S.D.等人，Enzyme Microb.Technol.，23，1998年，p133-140(非專利文獻)、Jenkins，C.C.AND Suberkropp，K.，FreshwaterBiology，33卷第2號，1995年，p245-253(非專利文獻3)。因而，產生了纖維素酶的活性因水的硬度受到抑制，無法取得滿意的澄澈化效果的問題，反之會出現纖維素酶活性增強使布料的強度降低的問題。
由于增效組分本身會影響纖維素酶的活性，因而，通過添加增效組分來緩和水的硬度對纖維素酶澄澈化活性的影響是很難的。所以人們需要不易受到自來水硬度的影響，并且具有穩定的澄澈化活性的纖維素酶。
以往，盡管可以使用多種纖維素酶成分的混合物處理含有纖維素的纖維，但對于含有纖維素的纖維而言，為取得滿意的效果需要配合使用大量纖維素酶，因而其實用性受到限制。因此，大多數情況下，提供的纖維素酶配制物中含有大量高活性內切葡聚糖酶。其制造方法已知有，采用基因重組技術，在宿主細胞中大量表達高活性的目的內切葡聚糖酶成分的方法國際公開第91/17243號小冊子(專利文獻6)、國際公開第98/03667號小冊子(專利文獻9)、國際公開第98/11239號小冊子(專利文獻10)。
作為這些方法中優選的宿主細胞，可以舉出屬于不完全菌類的絲狀菌，例如，曲霉屬(Aspergillus)、腐質霉屬、木霉屬(Trichoderma)的絲狀菌等。進而，在生產洗滌劑中使用的纖維素酶時，因洗滌劑中的pH為堿性，較之生產酸性纖維素酶的木霉屬絲狀菌而言，以生產中性纖維素酶的曲霉屬和腐質霉屬的絲狀菌為宿主，更為適宜。尤其考慮到生產工業化酶時，生產性高的腐質霉屬絲狀菌是更優良的宿主國際公開第01/90375號小冊子(專利文獻7)、國際公開第98/03640號小冊子(專利文獻11)。
然而，將異源基因在腐質霉屬絲狀菌中表達時，因其堿基序列上的特性差異(基因密碼子使用頻率不同)等原因，表達常常受到抑制。因而，有必要對異源基因進行改變的操作。例如，為使屬于接合菌類的根霉屬來源的內切葡聚糖酶RCEI在Humicola insolens中大量表達，必須將編碼RCEI的基因最適化，以適合宿主細胞的密碼子使用頻率國際公開第00/24879號小冊子(專利文獻8)。但是，盡管這樣進行了最適化，可以預想，得到和通常同種基因同等程度的表達量是很難的。并且，在實際表達時，由宿主產生的目的酶在培養過程中可被培養液中的蛋白酶分解，從而獲得分解物或部分分解物。
專利文獻1歐洲專利第307,564號說明書專利文獻2歐洲專利第220,016號說明書專利文獻3國際公開第95/02675號小冊子專利文獻4國際公開第97/30143號小冊子專利文獻5國際公開第98/08926號小冊子專利文獻6國際公開第91/17243號小冊子專利文獻7國際公開第01/90375號小冊子專利文獻8國際公開第00/24879號小冊子專利文獻9國際公開第98/03667號小冊子專利文獻10國際公開第98/11239號小冊子專利文獻11國際公開第98/03640號小冊子非專利文獻1Fragrance Journal，1995年，11卷，p33-55非專利文獻2Mansfield，S.D.等人，Enzyme Microb.Technol.，23，1998年，p133-140非專利文獻3Jenkins，C.C.AND Suberkropp，K.，FreshwaterBiology，33卷第2號，1995年，p245-25
發明內容發明要解決的問題以往，為用于纖維用·洗滌用途，從腐質霉屬、木霉屬、根霉屬、毛霉屬(Mucor)、須霉屬(Phycomyces)等多種絲狀菌分離纖維素酶，再分離出編碼這些纖維素酶的基因。然而，在含有大量陰離子表面活性劑和增效組分的歐美型洗滌劑中仍具有高澄澈化活性，并且不易受到自來水的硬度影響，并且具有穩定的澄澈化活性的酶，目前尚未見報道。
進而，若發現在優良宿主腐質霉屬絲狀菌中可大量表達，并且基因未經過改變的異源絲狀菌來源的纖維素酶基因，其產業上的應用價值將不可估量，然而，目前尚未見這樣的基因報道。
解決問題的手段在此，本發明人發現并提供了來自以往分離纖維素酶或纖維素酶基因的報告中從未提到的圓孢霉屬(Staphylotrichum)的微生物的、具有高內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質和其基因。
本發明人發現，本發明的從圓孢霉屬微生物分離得到的具有高內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質，在歐美洗滌劑中，對含有纖維素酶布料顯示出極強的澄澈化活性。例如，Staphylotrichum coccosporum來源的本發明的內切葡聚糖酶，尤其是其中的內切葡聚糖酶STCE1(以下有時簡稱為STCE1)，在代表性歐洲洗滌劑中具有高澄澈化活性，約為已知的具有澄澈化活性的洗滌用纖維素酶-內切葡聚糖酶NCE5(以下有時簡稱為NCE5)(國際公開第01/90375號小冊子)的16倍，內切葡聚糖酶RCEI(國際公開第00/24879號小冊子)的80倍以上。
進而，驚奇地發現該內切葡聚糖酶STCE1的活性不受到自來水的硬度影響，具有穩定的澄澈化活性。例如，已知的對含有纖維素的纖維具有高絨毛去除活性的內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)、NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)的澄澈化活性隨自來水的硬度的增加而增加，而內切葡聚糖酶RCEI(國際公開第00/24879號小冊子)的澄澈化活性則隨自來水的硬度的增加而降低。然而，本發明的內切葡聚糖酶STCE1不受自來水的硬度影響，具有穩定的澄澈化活性。到目前為止，沒有任何有關在歐美洗滌劑中具有高澄澈化活性，并且不受自來水硬度的影響，并具有穩定活性的纖維素酶的了解。
更令人驚嘆的發現是，Staphylotrichum coccosporum來源的內切葡聚糖酶STCE1在以與Staphylotrichum coccosporum不同的菌株Humicola insolens為宿主的轉化體中，在不用對內切葡聚糖酶STCE1基因進行任何改變操作的情況下就能大量表達。
因而，本發明提供圓孢霉屬微生物來源的具有內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質及其基因，并提供含有上述蛋白質、具有良好特性的纖維素酶配制物。本發明還提供以編碼上述蛋白質的基因轉化的宿主細胞，以及培養上述宿主細胞并收集目的蛋白的方法。進一步提供通過本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的方法。
即，本發明包含以下發明。
(1)來源于圓孢霉屬微生物，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。
(2)具有以下(A)和(B)特性的(1)中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
(3)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為49kD。
(4)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列、(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為45kD。
(5)來源于Staphylotrichum coccosporum的(1)-(4)中任一項記載的蛋白質。
(6)選自下述的蛋白質(a)包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質，以及(c)包含與含有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質至少85％同源的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的同源蛋白質。
(7)編碼(1)-(6)中任一項記載的蛋白質的多核苷酸。
(8)選自下述的多核苷酸(i)包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基序列的多核苷酸，(ii)包括在包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列中缺失、取代、插入或添加1個或多個堿基所得的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及(iii)包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基序列的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。
(9)包含(7)或(8)中記載的多核苷酸的表達載體。
(10)(9)中記載的表達載體轉化的宿主細胞。
(11)宿主是酵母或絲狀菌的(10)中記載的宿主細胞。
(12)(11)中記載的宿主細胞，所述的酵母為釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物。
(13)(11)中記載的宿主細胞，所述的絲狀菌為腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、圓孢霉屬(Staphylotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢霉屬(Fusarium)或頂孢霉屬(Acremonium)的微生物。
(14)(13)中記載的宿主細胞，所述的絲狀菌為Humicola insolens或綠色木霉(Trichoderma viride)。
(15)蛋白質的制造方法，其包含培養(10)-(14)中任一項記載的宿主細胞的步驟以及從前述培養所得的宿主細胞或其培養物收集(1)-(6)任一項記載的蛋白質的步驟。
(16)以(15)中記載的方法生產的蛋白質。
(17)包含(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質的纖維素酶配制物。
(18)包含(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質，或(17)中記載的纖維素酶配制物的洗滌組合物。
(19)含有纖維素的纖維的處理方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(20)降低含有纖維素的纖維起毛速度或者減少含有纖維素的纖維的起毛的方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(21)為改善含有纖維素的纖維的肌膚觸感和外觀的減量加工方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(22)使染色后的含有纖維素的纖維的色澤澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(23)使染色后的含有纖維素的纖維的色澤具有局部性變化的方法，其包括使染色后的含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(24)降低含有纖維素的纖維開始變硬的速度或減小含有纖維素的纖維的硬度的方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
(25)(19)-(24)任一項記載的方法，其中所述的纖維素處理是通過將纖維浸漬、清滌或洗涮進行的。
(26)舊紙脫墨的方法，其特征在于，在通過舊紙脫墨化學品處理來脫墨的步驟中，使用(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物。
(27)改善紙漿的濾水性的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。
(28)改善動物飼料的消化能力的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的步驟。
發明的效果本發明的蛋白質，尤其是內切葡聚糖酶STCE1，可用于洗滌、纖維加工用途，可使含有纖維素的纖維色澤澄澈，起毛減少，肌膚觸感改善，色澤局部變化，硬度降低等。
具體實施例方式
具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質本說明書中的“內切葡聚糖酶”指的是具有內切葡聚糖酶活性的酶，即，指的是內切-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，上述酶水解β-1，4-葡聚糖的β-1，4-吡喃葡萄糖苷鍵。此外，本說明書的“β-1，4-葡聚糖酶活性”指的是CMC酶活性。“CMC酶活性”指的是水解羧甲基纖維素(CMC，東京化成工業株式會社生產)的活性，測定被檢蛋白質和CMC溶液孵育一定時間后游離出的還原糖量，將生成相當于1μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個單位。
內切葡聚糖酶活性，例如可通過如下方法測定。首先，將含有被檢蛋白質的溶液0.5mL添加于溶解有2％CMC的50mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH6.0)0.5mL中，50℃孵育30分鐘。接著，以3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)定量。即，在反應30分后的反應液中添加DNS試液3.0mL，在沸騰水浴中孵育5分鐘后，以蒸餾水8.0mL稀釋，測定540nm的吸光度。利用分段稀釋的葡萄糖溶液制成檢測線，以葡萄糖換算確定酶反應液中生成的還原糖量。以1分鐘內生成相當于1μmol葡萄糖的還原糖的酶量作為1個單位，計算出活性。DNS試劑可依據文獻(例如，《生物化學試驗法1-還原糖的定量法》，p19-20，福井作藏著，學會出版中心)中的記載配制，例如，可采用如下順序配制。首先，在4.5％氫氧化鈉水溶液300mL中，添加1％3，5-二硝基水楊酸溶液880mL，和羅氏鹽255g(溶液A)。另外，在1.0％氫氧化鈉溶液22mL中添加結晶酚10g，再添加水溶解成為100mL(溶液B)。在溶液B 69mL中添加碳酸氫鈉6.9g使其溶液，再注入溶液A，攪拌混合直至羅氏鹽充分溶解，放置2天后，過濾。
本發明的蛋白質可從絲狀菌類，具體而言，圓孢霉屬微生物，優選Staphylotrichum coccosporum，更優選Staphylotrichum coccosporumIFO 31817株獲得，也可以是其變異株。
進而，本發明的蛋白質，典型地，其N末端的氨基酸序列具有以SEQ ID NO.1所示的序列。N末端的氨基酸序列，例如，可由后述實施例2表示的方法確定。
根據本發明，提供來源于圓孢霉屬并具有以下特性的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列，(C)由SDS-PAGE測定的平均分子量為49Kd。
進而提供具有以下特性的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列，(C)由SDS-PAGE測定的平均分子量為45Kd。
此處，由SDS-PAGE測定的平均分子量可由實施例1所示的方法確定。
本發明的其他實施方式，提供包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質，以及其修飾蛋白質或其同源蛋白質。
“包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質”包括，例如，由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列構成的蛋白質，在由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中添加信號肽序列構成的蛋白質，以及由在SEQ IDNO.3表示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加適當標記序列而得的氨基酸序列構成的蛋白質。
信號肽，例如，在SEQ ID NO.2所示的堿基序列中，是由第1-3位的ATG開始到第61-63結束的核苷酸序列編碼的21個氨基酸殘基構成的氨基酸序列(SEQ ID NO.33)。作為上述標記序列，例如，可以使用有助于容易地進行多肽的表達確認、細胞內局部確認的序列，例如，使用FLAG標記、六個組氨酸標記、血球凝集素標記或myc表位等。
本發明中的“修飾蛋白質”指的是，包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1個或多個(優選1個或幾個)氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處，與“缺失、取代、插入或添加”等修飾相關的氨基酸的數目，優選為1-30個，更優選為1-10個，尤其優選為1-6個。此外，進行修飾的氨基酸，只要是能夠維持或提高內切葡聚糖酶活性，就沒有特殊限定，例如，可以修飾催化區域、接頭或結合區域中的氨基酸。
進而，修飾蛋白質包括，例如，包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中，有1個或多個氨基酸殘基被保守性取代的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處，“保守性取代”指的是，在不實質性改變蛋白質活性的條件下，將1個或多個氨基酸殘基以化學上類似的其它氨基酸取代。例如可舉出，將某疏水性殘基以其它疏水性殘基取代的情形，將某極性殘基以具有相同電荷的其它極性殘基取代的情形。
可進行這種保守性取代的功能類似的氨基酸，在各氨基酸相應的技術領域都是公知的。具體而言，作為非極性(疏水性)氨基酸，可以舉出，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可以舉出，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為帶有正電荷(堿性)的氨基酸，可以舉出，精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。此外，作為負電荷(酸性)氨基酸，可以舉出，天冬氨酸、谷氨酸等。
本發明中的“同源蛋白質”指的是，包含和SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列具有至少85％，優選90％，更優選95％以上同源性(序列同一性)的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處所示同源性數值，表示的是在本領域技術人員所公知的同源性檢索程序FASTAScience，227，1435-1441(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988)；http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html中采用默認(初期設定)參數而計算出的數值(同一性；identity)。
作為本發明蛋白質的具體例子，可以舉出，內切葡聚糖酶STCE1或內切葡聚糖酶STCE3。本發明中，將這些統稱為“內切葡聚糖酶STCE”。
本發明的內切葡聚糖酶STCE是，如后述實施例2所示，屬于家族45的內切葡聚糖酶。作為屬于家族45的公知的內切葡聚糖酶，例如可以舉出，腐質霉屬來源的內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)或NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)、或根霉屬來源的內切葡聚糖酶RCEI(國際公開第00/24879號小冊子)。
圖1和圖2顯示的是，本發明的內切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列信號肽(SEQ ID NO.33)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.3)與屬于家族45的公知內切葡聚糖酶NCE信號肽(SEQ ID NO.34)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.35)以及NCE信號肽(SEQ ID NO.36)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.37)的各氨基酸序列比較的結果。
圖1表示的是前半部(N末端側)結果，圖2表示的是后半部(C末端側)結果。圖1和圖2中，記號“*”表示的是和STCE1共有的氨基酸。
如圖1和圖2所示，屬于家族45的內切葡聚糖酶，共有區域為催化區域(catalytic domain)(1位到207位)，根據情況，有時還具有接頭(Linker)(208位-258位)以及或纖維素結合區域(cellulose-bindingdomain；CBD)(259位-295位)。各區域后括號內顯示的序號，是內切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)中的氨基酸號。
上述各區域內，發現在催化區域和纖維素結合區域，有很多各內切葡聚糖酶間的保守氨基酸，而在接頭未發現顯著的保守區域。含有大量保守氨基酸的區域(例如，催化區域或纖維素結合區域，尤其是催化區域)，或者是包含在該區域中的共有氨基酸，因被認為是關系到本發明內切葡聚糖酶(例如，STCE1)的酶活性的重要區域或氨基酸，通過在其以外的區域或氨基酸中改變氨基酸(例如，缺失、取代、插入、以及/或添加，尤其是保守取代)，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。
此外，在含有大量保守氨基酸的區域，即使將各內切葡聚糖酶間非共有氨基酸變為其它氨基酸(優選可保守取代的類似氨基酸)，其酶活性的維持可能性也很高，通過進行這種氨基酸改變，可高效率得到其酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。
即使是含有大量保守氨基酸的區域內的共有氨基酸，改變為其它氨基酸時，有時也可維持其酶活性，尤其是改變為可保守取代類似氨基酸的時候，其可能性增高。本發明的修飾蛋白質或同源蛋白質，只有是具有內切葡聚糖酶活性(即，維持或提高改變前的內切葡聚糖酶活性)，可以是任意區域，例如催化區域、接頭或纖維素結合區域所含的氨基酸改變的蛋白質。
本發明的蛋白質，例如可以通過如實施例1記載的從微生物中提取、純化得到。此外，如后述利用基因重組技術，使編碼本發明的蛋白質的多核苷酸在適當宿主中表達，分離、純化產生的蛋白質，也可得到本發明的蛋白質。
編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸根據本發明，提供編碼包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質、其修飾蛋白質、以及同源蛋白質的多核苷酸。若提供了蛋白質的氨基酸序列，則很容易確定其編碼堿基序列，由此，可選擇編碼本發明蛋白質的各種堿基序列。本說明書中，“多核苷酸”一詞，DNA和RNA兩者都包含，優選DNA。
本發明的多核苷酸，典型而言，選自由下述的組(i)包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-948位堿基序列的多核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO.2所示的堿基序列的第64-948位堿基構成的序列中缺失、取代、插入或添加1個或多個堿基而成的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及(iii)與包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-948位堿基的序列的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。
在SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-948位堿基的序列中，可以缺失、取代、插入或添加的堿基數，優選為1-30個，更優選為1-18個，尤其優選為1-9個。
此處，上述(iii)中的“嚴緊條件”指的是控制在如下條件使得包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-948位堿基序列的探針，和編碼同源蛋白質的多核苷酸雜交，但該探針不和內切葡聚糖酶NCE5基因(國際公開第01/90375號小冊子)雜交。
更具體而言，例如可舉出如下條件，探針使用具有編碼標記的內切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列的全長堿基序列的探針，通過ECL直接DNA/RNA水平檢測系統(Amersham公司生產)附帶的操作方法，42℃預雜交1小時后，添加上述探針，42℃雜交15分鐘后，以添加有0.4％SDS和6mol/L尿素的0.4倍或0.4倍以下濃度的SSC(1倍濃度的SSC15mmol/L枸櫞酸三鈉、150mmol/L的氯化鈉于42℃反復清洗2次，每次20分鐘，接著，以5倍濃度的SSC于室溫清洗2次，每次10分鐘。
本發明的多核苷酸，可以是天然來源的多核苷酸，也可以是全合成的多核苷酸，此外，也可利用天然來源的多核苷酸的一部分，合成得到。作為本發明的多核苷酸的典型獲得方法，可以舉出，從Staphylotrichum coccosporum的基因文庫，采用基因工程學領域常用方法，例如，使用以部分氨基酸序列的信息為基礎制成的適當DNA探針，進行篩選的方法等。
編碼本發明的內切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列的典型堿基序列，具有SEQ ID NO.2所示的堿基序列中第64-948位堿基的序列。SEQID NO.2所示的堿基序列，具有從1-3位的ATG開始，到949-951位的TAA終止的開放閱讀框。此外，64-66的核苷酸序列，對應于包含295個氨基酸殘基的內切葡聚糖酶STCE1的成熟蛋白質的N末端氨基酸。
表達載體和轉化微生物本發明提供一種表達載體，其可使編碼包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質，其修飾蛋白質和同源蛋白質的堿基序列(以下稱為“本發明的多核苷酸”)在宿主微生物內復制，并且以可表達狀態含有其堿基序列編碼的蛋白質。本發明的載體是自我復制載體，即，作為獨立體存在于染色體外，其復制不依賴于染色體的復制，例如，可由此構建質粒。此外，本發明的表達載體，在導入宿主微生物時，也重組到其宿主微生物的基因組中，和重組后的染色體一起復制。本發明的載體的構建順序和方法，可使用基因工程學領域常用的方法。
本發明的表達載體，為將其實際導入宿主微生物，表達具有期望活性的蛋白質，優選除含有上述本發明的多核苷酸外，還含有調控其表達的堿基序列和用于選擇轉化體的基因標記等。作為調控表達的堿基序列，包含啟動子、終止子以及編碼信號肽的堿基序列等。啟動子只要是可在宿主微生物中表現轉錄活性，就沒有特殊限制，可得到調控編碼和宿主微生物同種或異種任意蛋白質的基因表達的堿基序列。信號肽只要是在宿主微生物中提供蛋白質分泌作用即可，無特殊限制，可以由編碼與宿主微生物同種或異種的任意蛋白質的基因的堿基序列獲得。此外，本發明的基因標記，可以根據轉化體的選擇方法適宜選擇，例如，可利用編碼耐藥性的基因、需要補充營養的基因。
進而，根據本發明，提供經表達載體轉化的微生物。該宿主-載體系統，沒有特殊限定，例如，可采用使用了大腸菌、放線菌、酵母、絲狀菌等的系統，以及使用它們和其它蛋白質構成的融合蛋白質表達系統。這些表達載體對微生物的轉化可使用本領域慣用的方法進行。
進一步，在適當的培養基種培養轉化體，可以從宿主細胞或其培養物種分離本發明的蛋白質。因而，根據本發明的其它實施方式，提供上述本發明的新蛋白質的制造方法。轉化體的培養及其條件，可以是和使用的微生物實質上等同的培養和培養條件。此外，轉化體培養后，回收目的蛋白質的方法，可以使用在該領域慣用的方法。
根據本發明的優選實施方式，提供由本發明的多核苷酸堿基序列編碼，表達內切葡聚糖酶的酵母細胞。作為本發明的酵母細胞，可舉出例如，釀酒酵母屬、漢遜酵母屬、或畢赤酵母屬的微生物，例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，作為本發明種的新蛋白質的最適制造方法，提供在屬于不完全菌類的絲狀菌的表達方法。作為本發明中的較為適宜的宿主絲狀菌，可舉出腐質霉屬、木霉屬、圓孢霉屬、曲霉屬、鐮孢霉屬或頂孢霉屬的絲狀菌，更優選腐質霉屬或木霉屬。更具體而言，可舉出，Humicola insolens、Humicolathermoidea、綠色木霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)或纖維素分解頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)，更優選，Humicola insolens或綠色木霉。
纖維素酶的用途/纖維素酶配制物本發明還涉及含有本發明蛋白質(例如，包含序號3表示的氨基酸序列的蛋白質，或其修飾蛋白質或同源蛋白質，或培養本發明的宿主細胞而得到的蛋白質)的纖維素酶配制物。
一般而言，所說的纖維素酶配制物，除纖維素外，還可含有例如，賦形劑(例如，乳糖、氯化鈉、山梨醇等)、防腐劑、以及/或非離子表面活性劑等。此外，纖維素酶配制物的形態，可以是固態，也可以是液態，具體而言，可舉出，粉劑、粒劑、顆粒劑、非粉塵化顆粒、或液體制劑。本發明的纖維素酶配制物中，除本發明的蛋白質外，也可含有其它纖維素酶，例如，纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、β-葡萄糖苷酶、以及/或本發明的內切葡聚糖酶以外的內切葡聚糖酶。
作為纖維素酶配制物的一種，非粉塵化顆粒(優選無飛散性顆粒狀)，可使用通常的干式造粒法制造。即，將粉末狀本發明蛋白質混合到選自不影響內切葡聚糖酶活性的中性無機鹽(例如，硫酸鈉、氯化鈉)、不影響內切葡聚糖酶活性的礦物質(例如，膨潤土、蒙脫石)和中性有機物(例如，淀粉或粒狀纖維素等)等的1種或多種中后，加入1種或多種非離子表面活性劑粉末，或微細懸濁的懸濁液，充分混合或混煉。根據情況，適當添加使固體粘著的合成高分子(例如，聚乙二醇等)或天然高分子(例如，淀粉等)，進而混煉后，進行圓盤造粒機(disc pelletizer)等擠出成形造粒，將成形物通過球形整粒機成形為球狀后，干燥可制得非粉塵化顆粒。1種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特殊限定，但相對于本發明的纖維素酶配制物總體，優選為0.1-50重量％，更優選0.1-30重量％，尤其優選1-10重量％。此外，通過以聚合物對顆粒表面包衣，也可控制氧通透和水分通透。
另一方面，作為纖維素酶配制物的一種，液體制劑(優選，穩定化的液狀)，可通過在包含本發明的蛋白質的溶液中，配合內切葡聚糖酶穩定化劑(例如，合成高分子，天然高分子等)，根據需要，添加無機鹽類以及/或合成防腐劑，進行配制。此時，也可配合1種或多種非離子表面活性劑。1種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特殊限定，但相對于本發明的纖維素酶配合物總體，優選為0.1-50重量％，更優選為0.1-30重量％，尤其優選為1-10重量％。
進而，本發明提供包含本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物的洗滌組合物。本發明的洗滌組合物也含有表面活性劑(可以是陰離子性、非離子性、陽離子性、兩性或雙性離子性或它們的混合物)此外，本發明的洗滌組合物，可含有本領域已知的其它洗滌成分，例如，增效組分、漂白劑、漂白活性劑、防腐劑、金屬離子封閉劑、除污聚合物、香料、其它酶(例如，蛋白酶、脂酶、淀粉酶)、酶穩定劑、制劑化助劑、熒光增白劑、以及/或發泡促進劑等。代表性的陰離子性表面活性劑有，直鏈狀烷基苯基磺酸鹽(LAS)、烷基硫酸鹽(AS)、α-烯基磺酸鹽(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽(AES)、α-磺基脂肪酸酯鹽(α-SFMe)、以及天然脂肪酸的堿金屬鹽等。作為非離子表面活性劑的例子，可以舉出，聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙氧基化合物、蔗糖以及葡萄糖的脂肪酸酯、烷基糖苷、聚乙氧基化烷基糖苷的酯等。
本發明的含有纖維素的纖維的處理方法，通過使本發明的蛋白質、本發明的纖維素酶配制物或本發明的洗滌組合物與含有纖維素的纖維接觸來進行。由本發明的纖維處理方法改善的含有纖維素的纖維的性質，包含以下(1)絨毛被除去(起毛速度降低、起毛減少)(2)減量而帶來的纖維肌膚觸感和外觀的改善(3)染色的含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化(4)染色的含有纖維素的纖維的色彩產生局部變化，即，使染色的含有纖維素的纖維，更具代表性地，使斜紋布具有石磨樣外觀和風格。
(5)柔軟化(開始出現硬化的速度降低、硬化減少)本發明的纖維處理方法，具體而言，可通過將浸泡有纖維或纖維能夠被浸泡的水中，添加本發明的蛋白質、本發明的纖維素酶配制物或本發明的洗滌組合物來進行，例如，可通過纖維浸泡步驟、洗滌步驟或洗涮步驟進行。
接觸溫度或本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物的添加量等條件，可參考其它各種條件適當確定，例如，在降低含有纖維素的纖維的起毛速度或減少含有纖維素的纖維的起毛時，優選使用溫度在10-60℃左右，蛋白質濃度為0.01-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。
在用于改善纖維肌膚觸感和外觀的減量加工時，優選使用溫度在10-60℃左右，蛋白質濃度為0.1-50mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。
此外，在用于提供染色后的含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化作用時，優選使用溫度在10-60℃左右，蛋白質濃度為0.1-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。
此外，在用于提供染色后的含有纖維素的纖維的色彩局部變化的時候，優選使用溫度在20-60℃左右，蛋白質濃度為0.1-100mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。
此外，上述方法，在用于降低含有纖維素的纖維硬化開始出現的速度或減少含有纖維素的纖維的硬化時，優選使用溫度在10-60℃左右，蛋白質濃度為0.01-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。
進而，本發明關于舊紙脫墨的方法，其特征在于，在由脫墨化學品處理舊紙來脫墨的步驟中，使用本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物。
本發明的蛋白質或纖維素酶配制物，由于當作用于舊紙時，可提高脫墨效率，因而，在從舊紙制造再生紙的過程中是有用的。根據上述脫墨方法，因殘留有墨的纖維大量減少，可提高舊紙的白色度。
上述脫墨化學品，只要是舊紙脫墨中常使用的化學品就可以，其它沒有特殊限定，例如可以舉出，氫氧化鈉、碳酸鈉等堿，硅酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽、陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或油酸等捕獲劑等，作為助劑，可以舉出，pH穩定劑、絡合劑或分散劑等。
可適用于上述脫墨方法的舊紙，只有是通常被稱為舊紙的紙就可以，其它沒有特殊限定，例如可以舉出，配合有機械漿和化學漿的新聞舊紙、雜志舊紙、低等-中等印刷舊紙、由化學漿構成的上等舊紙、它們的涂工紙等印刷舊紙。進而，也可以是通常被稱為舊紙的紙以外的紙，只要是帶有墨的紙，上述脫墨方法就可適用。
進而，本發明關于紙漿的透水性的改善方法，上述方法包含以本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。
根據上述方法，在沒有伴隨出現強度顯著降低的情況下，紙漿的透水性顯著得到改善。可適用上述方法的紙漿沒有特殊限定，例如可舉出，舊紙漿、再循環板紙漿、工藝紙漿(craft pulp)、亞硫酸紙漿、加工熱處理的其它高收率漿等。
進而，本發明關于改善動物飼料消化能力的方法，包含以本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理動物飼料的步驟。
根據上述方法，因動物飼料中的葡聚糖被適度低分子化，可改善動物飼料的消化能力。
進而，通過在動物飼料中使用本發明的蛋白質，可改善飼料中的葡聚糖的消化能力。因而，根據本發明，提供改善動物飼料消化能力的方法，其包含以本發明的蛋白質或纖維素酶配制物處理動物飼料的步驟。
微生物的保藏本發明的內切葡聚糖酶STCE來源的StaphylotrichumcoccosporumIFO 31817株，于1985年保藏于日本國內的財團法人發酵研究所，國內保藏號是IFO 31817。此外，于2004年(平成16年)9月28日國際保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(地址 305-8566日本國茨城縣筑波東1丁目1番地1中央第6)，國際保藏號為FERM BP-10135。進而，IFO 31817株現在保藏于獨立行政法人配制品評價技術基礎機構生物技術總部( 292-0818千葉縣木更津市かずさ鐮足2-5-8かずさ學術園內)，保藏號為NBRC 31817。該菌株向第三者公開，處于可獲得的狀態的情況，依據與本說明書同時提交的證明文件平成15年(2003年)11月19日付是清楚的。
以在質粒pUC118的BamHI部位插入STCE1基因得到的質粒pUC118-STCEex轉化得到的本發明的大腸菌(Esherichia coli)DH5α/pUC118-STCEex株，于2003年(平成15年)12月1日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自2004年(平成16年)9月15日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-1012FERM P-19602。
可作為本發明的表達載體的宿主的Humicola insolens MN200-1株，于1996年(平成8年)7月15日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)6月13日起轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-597FERM P-15736。
可作為本發明的表達載體的宿主的Humicola viride MC300-1株，于1996年(平成8年)9月9日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)8月11日起轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-604FERM P-15842。
實施例以下，采用實施例更為具體地說明本發明，但本發明并不局限于這些實施例。
《實施例1從Staphylotrichum coccosporum分離純化具有脫脂棉纖維游離活性的成分》將Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在(T)培養基(2.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米漿、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氫鉀)中，28℃振蕩培養。培養10天后，去除菌體后，得到粗制纖維素酶配制液。
將該粗制纖維素酶配制液配制成最終濃度為1.5mol/L的硫酸銨溶液后，將其上樣于事先以1.5mol/L硫酸銨液平衡的HiTrapTMPhenylHP柱(Amersham生物科學社生產)，在去離子水中，以濃度分別為1.5mol/L、0.9mol/L、0.75mol/L、0.6mol/L、0.15mol/L、0mol/L的硫酸銨溶液梯度洗脫，分離。其中，當硫酸銨濃度為0.75mol/L和0mol/L時，發現洗脫的部分中脫脂棉纖維游離活性強。
接著，以Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生產)將硫酸銨0mol/L洗脫部分脫鹽后，調整使其成為50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)，再上樣于事先以50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科學社生產)。接著，相對于1mol/L氯化鈉的從50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)到的50mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0)線性梯度洗脫法洗脫，分離。其結果是，當氯化鈉濃度約為0.05mol/L時，發現得到的部分中的脫脂棉纖維游離活性強。將該部分作為STCE1分離。
此外，硫酸銨0.75mol/L的洗脫部分，也同樣，使用Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生產)脫鹽后，將其調整成為50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)，再上樣于事先以50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科學社生產)。接著，相對于1mol/L氯化鈉的從50mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)到的50mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0)線性梯度洗脫法洗脫，分離。其結果是，當氯化鈉濃度約為0.05mol/L時，發現得到的部分中的脫脂棉纖維游離活性強。將該部分作為STCE3分離。這些STCE1部分、STCE3部分，通過上述柱子數遍分離純化，獲得大量純化樣品。
該STCE1部分和STCE3部分，在SDS-PAGE中分別顯示單一點，其平均分子量(MW)依次約為49kD和45kD。SDS-PAGE，使用SafetyCell Mini STC-808電泳槽(TEFCO公司生產)和預制膠10％-SDS-PAGEmini、膠厚1.0mm(TEFCO公司生產)，依據產品使用說明書進行電泳和染色。分子量標記使用精確(Precision)蛋白標準(Bio-RadLaboratories公司生產)。此外，STCE1部分和STCE3部分都具有CMC酶活性。
脫脂棉纖維游離活性，采用依據Neena Din等的方法(Neena Din等人，“Biotechnology”，9(1991)，p.1096-1099)的方法進行。即，使用洗滌牢固度測試儀，以下述條件反應后，在600nm吸光度下測定從脫脂棉游離出的絨毛量。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間120分鐘反應pHpH7(50mmol/L磷酸緩沖液)處理液中，除洗脫液外，還適當添加不銹鋼珠和脫脂棉。
《實施例2Staphylotrichum coccosporum來源的內切葡聚糖酶STCE1和STCE3的部分氨基酸序列確定》(1)STCE1和STCE3的N末端氨基酸序列的確定將實施例1得到的STCE1部分和STCE3部分上樣于SDS-PAGE后，電轉移于PVDF膜problotTM(Apraid生物系統公司生產)。接著，以CBS染色液(0.1％考馬斯亮蘭G250、30％甲醇、10％醋酸)染色后，脫色、干燥。從該膜分別切下分子量和STCE1部分和STCE3部分相當的約49kD和45kD的蛋白質(STCE1和STCE3)印跡的部分，以極少量甲醇潤濕，再以還原用緩沖液(8mol/L胍鹽酸鹽、0.5mol/L tris、0.3％EDTA-二鈉、5％乙腈)輕輕清洗該膜片，分別將膜片在微管中浸漬于100μL左右的還原用緩沖液。在其中添加二硫蘇糖醇1mg，封入氮氣后封閉，靜置1小時以上。再添加4-乙烯基吡啶(Aldrich公司生產)1.5μL，避光，不停攪拌20分鐘以上，進行蛋白質的半胱氨酸殘基的吡啶乙基化。其后，以蒸餾水、2％乙腈水的順序，清洗STCE1、STCE3膜片，然后供于蛋白測序儀Procise491(Apraid生物系統公司生產)，分別確定N末端氨基酸序列的25個殘基。STCE1、STCE3的N末端25個殘基的氨基酸序列相同，得到的序列如下。
STCE1和STCE3的N末端氨基酸序列Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn(25個殘基)(SEQ ID NO1)(2)STCE1和STCE3內部氨基酸的確定將實施例1得到的STCE1和STCE3以Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生產)脫鹽，冷凍干燥。將冷凍干燥后的STCE1和STCE3約40μg加入到1.5mL容量的微管中，再加入500μL還原用緩沖液，溶解。在其中添加二硫蘇糖醇1.4mg，封入氮氣密閉，靜置5小時。再添加碘代乙酸2.7mg，避光靜置30分鐘，進行蛋白質的半胱氨酸殘基的吡啶乙基化。其后，使用Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生產)脫鹽濃縮。分別相對于約10μg的該還原羧甲基化的STCE1和STCE3，添加約1/100mol量的賴氨酸內肽酶(和光純藥公司生產)，在50μL 50mmol/L tris緩沖液(pH9.0)中，于37℃反應72小時。將該消化液供于173A Micro-blotter系統(Apraid生物系統公司生產)，STCE1、STCE3分別分離出7種肽，印跡到PVDF(poly(vinyllidenedifluoride))膜。得到的肽片段的氨基酸序列通過上述蛋白測序儀確定。
其結果是，STCE1內部氨基酸序列如下所示。
LE-1Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys(8個殘基)(SEQ ID NO4)LE-2Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(9個殘基)(SEQ ID NO5)LE-3Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg(10個殘基)(SEQ ID NO6)LE-4Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys(10個殘基)(SEQ ID NO7)LE-5Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe(7個殘基)(SEQ ID NO8)LE-6Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr(7個殘基)(SEQ ID NO9)LE-7Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu(9個殘基)(SEQ ID NO10)由這些N末端氨基酸序列和肽圖譜得到的內部氨基酸序列的同源性檢索顯示，STCE1是屬于家族45的新的內切葡聚糖酶。
另一方面，STCE3的內部氨基酸序列如下所示。
LE-8Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys(8個殘基)(SEQ ID NO11)LE-9Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(9個殘基)(SEQ ID NO12)LE-10Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg(10個殘基)(SEQ ID NO13)LE-11Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg(16個殘基)(SEQ ID NO14)LE-12Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-Ala-Val-Asn-Asp-Asn(22個殘基)(SEQ ID NO15)LE-13Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys(11個殘基)(序列16)LE-14Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn(16個殘基)(序列17)由這些N末端氨基酸序列和肽圖譜得到的內部氨基酸序列的同源性檢索顯示，STCE也是屬于家族45的內切葡聚糖酶。然而，因STCE1和STCE3對應的內部氨基酸序列完全一致，暗示STCE3可能是由STCE1生成的部分分解物。
《實施例3純化內切葡聚糖酶STCE1除去含有纖維素的纖維的毛羽的活性評價》使用實施例1得到的粗制纖維素酶配制液和純化內切葡聚糖酶STCE1，如下評價對綿織布料的絨毛去除活性。
將預先染色的藍色綿織布料與表面活性劑和膠球一起置于大型洗衣機中，使其產生毛羽。其后，通過在下述條件下進行該已起毛的藍色綿織布料的毛羽去除處理，計算當起的毛經目視評價大約有50％被除去所需的粗制纖維素酶配制液，和純化內切葡聚糖酶STCE1的蛋白質濃度。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間60分鐘反應pHpH6(5mmol/L磷酸緩沖液)
處理液中，除內切葡聚糖酶液外，還適當添加膠球。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表1。


《實施例4評價純化內切葡聚糖酶STCE1對靛藍染色的含有纖維素的纖維的脫色活性》使用實施例1得到的粗制纖維素酶配制液和純化內切葡聚糖酶STCE1，在下述條件下對脫漿的12盎司藍色牛仔褲進行脫色處理。
試驗儀器20kg洗衣機(三洋電機株式會社生產全自動洗衣機SCW5101)溫度55℃時間60分鐘反應pHpH6.2(6.7mmol/L磷酸緩沖液)處理液量15L處理液中，除內切葡聚糖酶液外，還適當添加膠球。
使用分光測色計(Minolta公司生產，CM-525i)，測定Lab表示系的L值(明度)來確定脫色度。求出相對于對照(未處理纖維)的L值的增加值(白色度的增加)，即ΔL值，由該ΔL值評價脫色程度。即，在每個試驗區測定10個點的ΔL值(n＝10)，算出其平均值。接著，算出為使ΔL值＝5所需的粗制纖維素酶配制液和純化內切葡聚糖酶STCE1的蛋白質濃度。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表2。


《實施例5和洗滌劑配合使用時，純化內切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5以及RCEI的絨毛去除活性(澄澈化活性)的比較評價》使用實施例1得到的純化內切葡聚糖酶STCE1、從Humicolainsolens培養液得到的純化內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)、從Humicola insolens得到的純化內切葡聚糖酶NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)、從在Humicola insolens中的大量表達產物中單一純化得到的內切葡聚糖酶RCEI使用纖維素結合區域缺失的RCEI-H4(25kD)(國際公開第02/42474號小冊子)，如下評價在歐美洗滌劑中對綿織布料的絨毛去除活性(澄澈化活性)。
將預先染色的藍色綿織布料和表面活性劑以及膠球一起置于大型洗衣機中，使起毛。此后，通過在下述條件下，于洗滌劑中處理該已起毛的藍色綿織布料，計算當起的毛經目視評價大約有50％被除去所需的純化內切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5和RCEI的蛋白質濃度。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間60分鐘處理液量40mL洗滌劑種類NEW Persil(Performance Tablets biological)(LEVER公司生產2002年3月于意大利得到。)洗滌劑的添加量0.8％處理液人工硬度水(25FH將在去離子水中加入80mmol/L的氯化鈣、20mmol/L的氯化鎂得到的1000FH人工硬度水，以去離子水稀釋制得。)處理液中，除內切葡聚糖酶溶液外，還適當添加膠球。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表3。


《實施例6自來水的硬度對各種純化內切葡聚糖酶的絨毛去除活性的影響》使用實施例1得到的純化內切葡聚糖酶STCE1、從Humicolainsolens得到的純化內切葡聚糖酶NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)、從Humicola insolens培養液得到的純化內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)、從在Humicola insolens中的大量表達產物中單一純化得到的內切葡聚糖酶RCEI使用纖維素結合區域缺失的RCEI-H4(25kD)(國際公開第02/42474號小冊子)，如下評價對人工硬度水中的綿織布料的絨毛去除活性。
將預先染色的茶色綿織布料和表面活性劑以及膠球一起置于大型洗衣機中，使起毛。此后，在各種硬度(0FH、5FH、10FH、20FH、40FH)的人工硬度水中，使用4種純化內切葡聚糖酶溶液，在下述條件下處理該已起毛的茶色綿織布料。對于處理后的布料，計算當起的毛經目視評價大約有50％被除去所需的純化內切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5和RCEI的蛋白質濃度，將該蛋白質濃度的倒數作為絨毛去除活性值。接著，求出當以0FH的硬度中的絨毛去除活性值為100時，各硬度下的絨毛去除活性相對值。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間60分鐘處理液量100mL反應pHpH6(5mmol/L磷酸緩沖液)處理液人工硬度水(25FH將在去離子水中加入80mmol/L的氯化鈣、20mmol/L的氯化鎂得到的1000FH人工硬度水，以去離子水稀釋制得。)處理液中，除內切葡聚糖酶溶液外，還適當添加膠球。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表4。


《實施例7內切葡聚糖酶STCE基因的克隆》實施例2確定的STCE1和STCE3的內部和N末端氨基酸序列，和同樣屬于家族45的Humicola insolens來源的內切葡聚糖酶NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)的氨基酸序列具有同源性。此處，為檢索Staphylotrichum coccosporum的基因組DNA中的內切葡聚糖酶STCE基因，以NCE5基因為探針進行Southern雜交分析，進而分離出其同源性基因。
(1)Staphylotrichum coccosporum來源的基因組DNA的分離將Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在T培養基(2.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米漿、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氫鉀)中于28℃培養72小時，通過離心分離回收菌體。將得到的菌體冷凍干燥，以攪拌機(blender)細細破碎后，溶解于TE(10mmol/Ltris鹽酸(pH8.0)、1mmol/L EDTA)緩沖液8mL中。在其中加入含有10％SDS的TE緩沖液4mL，60℃保溫30分鐘。此后，加入酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)12mL，激烈振蕩。離心后，將水層移至別的容器，在其中加入5mol/L醋酸鉀1mL，置于冰水中1小時以上。離心后，將水層移至別的容器，加入2.5體積的乙醇，使DNA沉淀。將沉淀物干燥后，溶解于5mL的TE緩沖液，加入10mg/mL核酶A(RNaseA)溶液5μL，37℃保溫1小時后，再加入20mg/mL蛋白酶K(Proteinase K)溶液50μL，37℃保溫1小時。其后，加入3mL的聚乙二醇溶液(20％PEG6000、2.5mol/L氯化鈉)，使DNA沉淀。將沉淀物溶解于500μL的TE緩沖液中，酚∶氯仿∶異戊醇提取2次后，用乙醇沉淀。將沉淀物用70％乙醇清洗后，干燥，溶解于適量TE緩沖液中，得到基因組DNA試料。
(2)以Southern雜交檢索NCE5同源性基因將實施例7得到的Staphylotrichum coccosporum的基因組DNA約10μg，以多種限制性酶(EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI、NcoI等)分別切割后，用于0.8％瓊脂糖凝膠電泳。將其轉移到尼龍薄膜(HybondN+尼龍轉移膜，Amersham公司生產)，以0.4N氫氧化鈉將DNA固定后，以5倍濃度SSC(75mmol/L枸櫞酸三鈉、750mmol/L氯化鈉)清洗，干燥，固定DNA。
探針是通過將含有NCE5基因的cDNA的質粒pJND-c5(國際公開第01/90375號小冊子)以BamHI消化后，供于0.8％瓊脂糖凝膠電泳，回收約700bp的DNA片段得到。將其通過ECL直接DNA/RNA水平檢測系統(Amersham公司生產)標記。依據上述試劑盒附帶的說明書記載方法，將固定有基因組DNA的尼龍膜于42℃預雜交1小時后，添加標記化的NCE5探針，42℃雜交15小時。
雜交后的尼龍膜的清洗依據上述試劑盒附帶的說明書記載的方法進行。首先，以添加0.4％SDS、6mol/L尿素的0.6倍濃度SSC(9mmol/L枸櫞酸三鈉、90mmol/L氯化鈉)于42℃反復清洗2次，每次20分鐘。接著，以5倍濃度SSC于室溫清洗2次，每次5分鐘。將經過清洗處理后的尼龍膜浸到試劑盒附帶的檢測溶液1分鐘后，富士醫療X射線膜(富士寫真膜公司生產)感光。
其結果是，在以EcoRI、BamHI、XhoI、NcoI切割時，各自雜交到大小不同的2條條帶，推測Staphylotrichum coccosporum基因組DNA上存在和NCE5具有同源性的2種基因。在以EcoRI切割基因組DNA進行的雜交中，檢測到約10kbp和5kbp的2條條帶。接著，將檢測到的約10kbp條帶的DNA克隆。
(3)基因組DNA文庫的制備將Staphylotrichum coccosporum的基因組DNA以EcoRI消化，使用SeaKemLE瓊脂糖(FMC公司生產)，進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。為包含10kbp附近DNA，依據常法提取、純化約8-12kbp大小的DNA片段。將該DNA片段連接到噬菌體載體、Lambda DASH II載體(Stratagene公司生產)上。將其乙醇沉淀后，溶解于TE緩沖液，然后使用Gigapack III金包裝試劑盒(Gigapack III Gold packaging kit)，將其包裝入Lambda頭部，得到的噬菌體感染大腸菌XL1-Blue MRA株。使用由該方法得到的5×104個噬菌體文庫，克隆目的基因。
(4)Plaque雜交篩選NCE5同源基因接著，將依據實施例7(3)得到的基因組DNA文庫(EcoRI文庫)轉移到尼龍薄膜(HybondN+尼龍轉移膜，Amersham公司生產)，以0.4N氫氧化鈉將DNA固定后，以5倍濃度SSC清洗，干燥、固定DNA。依據試劑盒方法，42℃預雜交1小時后，添加實施例7(2)中標記化的NCE5基因的探針，42℃雜交15小時。
雜交后的尼龍膜的清洗依據上述試劑盒附帶的說明書記載的方法進行。首先，以添加0.4％SDS、6mol/L尿素的0.6倍濃度SSC于42℃反復清洗2次，每次20分鐘。接著，以5倍濃度SSC于室溫清洗2次，每次5分鐘。將經過清洗處理后的尼龍膜浸到試劑盒附帶的檢測溶液1分鐘后，富士醫療X射線膜(富士寫真膜公司生產)感光，得到4個噬菌體克隆。
接著，用噬菌體感染大腸菌XL1-Blue MRA株，18小時后收集噬菌體顆粒。依據Grossberger方法(Grossberger，D.，“Nucleic Acids.Res.”，15，6737，1987)，以蛋白酶K和酚處理這些顆粒后，通過乙醇沉淀，分離噬菌體DNA。
(5)NCE5同源基因的亞克隆將4種噬菌體DNA以多種限制性酶切割后，進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。由Southern方法(Southern，E.M.，“J.Mol.Biol”，98，p.503-517)將DNA轉移至尼龍薄膜，和實施例7(4)一樣，進行雜交。其結果是，4種噬菌體DNA，即使經過多種限制性酶切割，仍都顯示出共有的雜交圖譜。此外，在以SalI切割4種噬菌體DNA，和實施例7(4)一樣進行雜交后，都在約4.4kbp條帶顯示強信號，在約2.5kbp條帶顯示弱信號。由此認為，同源基因存在于約4.4kbp和約2.5kbpDNA之間，回收此2個大片段DNA，分別亞克隆到質粒pUC119的SalI位點。將亞克隆約4.4kbp的DNA得到的質粒稱為pSTCE-Sal4.4，亞克東約2.5kbp的DNA得到的質粒稱為pSTCE-Sal2.5。
《實施例8NCE5同源基因的堿基序列的確定》實施例7(5)亞克隆的NCE5同源基因的堿基序列分析如下進行。
堿基序列分析裝置，使用的是A.L.F.DNA測序儀II(法瑪西亞生物技術公司生產)。測序凝膠采用的是Hydro-link Long Range(FMC公司生產)可使用的聚丙烯酰胺載體。凝膠制備用各種試劑(N，N，N’，N’-四甲基亞乙基二胺、尿素和過硫酸銨)使用的是A.L.F.級試劑(法瑪西亞生物技術公司生產)。堿基序列解讀反應，使用的是自動讀取測序試劑盒(法瑪西亞生物技術公司生產)。凝膠制作條件、反應條件和點用條件等等，均參照試劑盒附帶的各說明書設定。
這樣，根據通常方法，確定質粒pSTCE-Sal4.4內的約4.4kbpDNA片段和質粒pSTCE-Sal2.5內的約2.5kbpDNA片段的堿基序列。進而，在將解讀后的堿基序列翻譯成氨基酸序列后，有一個閱讀框和實施例2所示STCE1的N末端氨基酸序列以及內部氨基酸序列完全一致。這些結果提示，該NCE5同源基因是編碼STCE1的基因。因此，以后將該NCE5同源基因作為STCE1基因記載。此外，根據該基因組DNA翻譯得到的STCE1氨基酸序列可以判斷，STCE1具有N末端側催化區域(catalytic domain)、C末端側纖維素結合區域(cellulose-bingdingdomain)，是屬于家族45的內切葡聚糖酶。然而，因推斷該DNA序列種含有內含子區域，因而采用RT(reverse transcriptase)-PCR，對STCE1基因的cDNA進行了分離。
《實施例9RT-PCR分離STCE1基因的cDNA和堿基序列確定》(1)由Staphylotrichum coccosporum分離mRNA將Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在T培養基(2.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米漿、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氫鉀)中于28℃培養72小時，通過離心分離回收菌體。將得到的菌體冷凍干燥，以攪拌機(blender)細細破碎。總RNA采用Isogen(和光純藥工業公司生產)分離。
首先，在菌體粉末中加入Isogen 5mL，30秒旋渦攪拌機攪拌后，于50℃保溫10分鐘。其后，室溫放置5分鐘。接著，加入0.8mL氯仿，激烈振蕩。離心分離后，將水層移至別的容器，在其中加入4mol/L氯化鋰2mL，混合后，于-70℃放置15分鐘。其后，離心分離，去除上清液后，將沉淀物以1.6mL水溶解，接著，加入1.6mL異丙醇，混合后，于4℃放置30分鐘。離心分離后，去除上清液，將沉淀物以75％乙醇清洗后，溶解在1.6mL水中。該液乙醇沉淀后，將沉淀物以75％乙醇清洗后，干燥，再溶解到0.4mL水中，得到總RNA。
接著，使用mRNA分離試劑盒(Stratagenene公司生產)，制備mRNA。首先，在上述配制的0.2mL總RNA中，添加稀釋緩沖液10mL，再添加寡dT溶液5mL。去除上清液后，將該寡dT以高鹽緩沖液清洗3次，低鹽緩沖液清洗2次后，以事先加溫至68℃的稀釋緩沖液洗脫。將該溶液乙醇沉淀，沉淀物以75％乙醇清洗后，干燥，再溶解于15μL水中，將其作為mRNA部分。
(2)以RT-PCR分離STCE1基因的cDNA使用Takara RNA PCR試劑盒(AMV)Ver.2.1，以RT-PCR方法從mRNA制備STCE1基因的cDNA。N末端側的引物序列，參考STCE1的N末端氨基酸序列和由實施例8分析得到的基因組序列翻譯得到的氨基酸確定，C末端側引物序列，參考保守性很好的纖維素結合區域的信息(Hoffren，Annna-Marja.等人，“Protein Engineering”，8，p.443-450，1995)和由實施例8分析得到的基因組序列翻譯得到的氨基酸確定。即，制備具有以下序列的寡核苷酸引物，以如上配制的mRNA中的1μL為模板，由PCR法僅擴增STCE1基因的cDNA。
STCE1-CN5’-GCGGATCCATGCGTTCCTCCCCCGTC-3’(26mer)(SEQ ID NO18)STCE1-CC5’-GCGGATCCTTAAAGGCACTGCGAGTACC-3’(28mer)(SEQ ID NO19)RT-PCR反應以下述條件進行。首先，添加C末端引物，在逆轉錄酶作用下，反應后，添加Taq聚合酶(重組Taq，寶酒造公司生產)、N末端引物，以如下條件重復30次94℃1分鐘、50℃2分鐘、72℃2分鐘，進行擴增。擴增后的片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果是，是一個約1kbp的片段。將其亞克隆到pUC18(質粒pUC-STCE1)。
(3)STCE1基因的堿基序列確定上述片段的堿基序列依據實施例8的方法確定。進而，將該序列和基因組堿基序列比較，確定內含子。該分析結果是，確定了Staphylotrichum coccosporum來源的STCE1基因的全長cDNA堿基序列(SEQ ID NO.2)。
基于得到的STCE1基因的cDNA的序列信息，分離處于內含子含有狀態下的包含STCE1基因翻譯區域的DNA片段。以混合有實施例7(5)中使用的4種噬菌體DNA的序列為末端，使用引物STCE-HNBam和STCE-HNBam，進行PCR。擴增后的片段經瓊脂糖電泳分離純化后，用BamHI切割，再次通過瓊脂糖電泳分離純化。
STCE-HNBam5’-GGG GGA TCC TGG GAC AAG ATG CGT TCC TCC CCC GTC CTC-3’(39mer)(SEQ ID NO20)STCE-HCBam5’-GGG GGA TCC GCT CAA AGG CAC TGC GAG TAC CAG TC-3’(35mer)(SEQ ID NO21)在質粒pUC118的BamHI部位，插入約1.1kbp的上述片段，得到質粒pUC118-STCEex(FERM P-19602)。進而，采用上述方法，確定該插入片段的堿基序列，確認STCE1基因的內含子和翻譯區域的序列(SEQ ID NO.22)。PCR時，盡管因使用引物STCE-HCBam，終止密碼子序列由TAA變為TGA，但生成的蛋白質的氨基酸序列沒有變化。
《實施例10STCE1基因在Humicola insolens中的表達》Humicola insolens MN200-1株(FERM BP-5977)中的表達載體pJND-STCE1是在使得表達的蛋白質是NCE4的N末端16個氨基酸殘基和STCE1的剩余氨基酸殘基的融合蛋白的條件下制備的。即，利用質粒pJND-NCE4構建，質粒pJND-NCE4是通過在質粒pJD01(國際公開第00/24879號小冊子)的BamHI部位連接上NCE4基因(國際公開第98/03640號小冊子)制得的。
其理由在于，NCE4的N末端16個氨基酸殘基和STCE1的N末端16個氨基酸殘基一致，因而，即使將NCE4的N末端16個氨基酸殘基和STCE1的剩余氨基酸殘基融合，也可得到和STCE1一樣的表達蛋白質。
質粒pJND-NCE4如下制備。首先，在NCE4基因(國際公開第98/03640號小冊子)能夠連接到質粒pJD01的BamHI位點的條件下，設計下述引物，使得含有起始密碼子的緊鄰上游的序列和終止密碼子的緊鄰下游的BamHI位點，依據國際公開第01/90375號小冊子的實施例4(1)1)記載的方法，以質粒pCNCE4(國際公開第98/03640號小冊子)為模板，采用PCR方法，導入變異，進行擴增。
NCE4-N-BamHI5’-GGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCC-3’(39mer)(SEQ ID NO23)NCE4-C-BamHI5’-GGGGATCCTGCGTTTACAGGCACTGATGGTACCAGTC-3’(37mer)(SEQ ID NO24)擴增后的DNA經BamHI消化后，亞克隆到質粒pJD01(國際公開第00/24879號小冊子的實施例D1(2)(b))的BamHI位點，將得到的質粒稱為pJND-NCE4。
(1)STCE1表達質粒的構建以實施例9(2)得到的質粒pUC-STCE1為模板，STCE1-N-S9A4、STCE1-C-FokF為引物，進行PCR擴增，將擴增后的片段瓊脂糖電泳分離純化，以BamHI和FokI切斷后，再次以瓊脂糖電泳分離純化。
STCE1-N-S9A45’-GGGATCCTGCGTTTAAAGGCACTGCGAGTACCAG-3’(34mer)(SEQ ID NO25)STCE1-C-FokF5’-GGGATGCAAGCCGTCGTGCTCGTG-3’(24mer)(SEQ ID NO26)
接著，以STCE1-N-FokR4、STCE1-C-BamF為引物，通過PCR擴增上述質粒pJND-NCE4，將擴增后的片段由瓊脂糖電泳分離純化，以BamHI和FokI切割后，再次以瓊脂糖電泳分離純化。
STCE1-N-FokR45’-GGGATGGGCCCAGCCGCACGAAG-3’(23mer)(SEQ ID NO27)STCE1-C-BamF5’-GGGATCCTGGGACAAGATGC-3’(20mer)(SEQ ID NO28)在質粒pJD01的BamHI部位插入上述2個片段，得到質粒pJND-STCE1。進而，采用上述方法確定該插入片段的堿基序列，確認是和STCE1基因(SEQ ID NO.2)一樣的序列。
(2)通過質粒pJND-STCE1制備Humicola insolens的轉化體將Humicola insolens MN200-1株在NS培養基(3.0％葡萄糖、2.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.03％氯化鈣、0.03％氯化鎂、pH6.8)中37℃培養24小時后，3000rpm離心10分鐘，收集菌體。將得到的菌體以0.5mol/L蔗糖清洗，再混懸于經0.45μm濾膜過濾的原生質體化酶溶液(3mg/mLβ-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)、1mg/mL幾丁質酶(Chitinase)、1mg/mL溶菌酶(Zymolyase)、0.5mol/L蔗糖)10mL中。30℃振蕩60-90分鐘，使菌系原生質體化。過濾該混懸液后，2500rpm離心分離10分鐘，回收原生質體，以SUTC緩沖液(0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化鈣、10mmol/Ltris鹽酸(pH7.5)清洗。
將該原生質體混懸于SUTC緩沖液1mL，加入每100μL含有10μg質粒pJND-STCE1的溶液10μL，冰水中靜置5分鐘。接著，加入400μL的PEG溶液(60％PEG4000、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L tris鹽酸(pH7.5)，在冰水中靜置20分鐘后，添加SUTC緩沖液10mL，2500rpm離心分離10分鐘。將收集到的原生質體混懸于SUTC緩沖液1mL后，4000rpm離心分離5分鐘，最終混懸于SUTC緩沖液100μL。
將該原生質體和YMG軟瓊脂一起層積于添加有潮霉素B(200μg/mL)的YMG培養基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麥芽提取物、1％瓊脂(pH6.8))上，37℃培養5小時，將形成的克隆作為轉化體。
(3)pJND-STCE1轉化體的培養和確定
(i)依據SDS-PAGE的評價將質粒pJND-STCE1導入Humicola insolens MN200-1株，選出表現潮霉素B耐性的40株。將它們在(N)培養基(5.0％微晶纖維素、2.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.03％硫酸鎂、pH6.8)中37℃培養4天，將得到的培養上清用SDS-PAGE電泳(預制小型凝膠(MiniGel)，14％-SDS-PAGEmini、膠厚1.0mm(TEFCO公司生產)分析。其結果是，在13個克隆中，能夠確認推定為STCE1的分子量為45-49kD附近的蛋白質顯著增強。
(ii)重組STCE1的N末端氨基酸的確定(3)為確認(i)中大量表達的蛋白質來源于STCE1基因，確定N末端氨基酸序列。首先，用SDS-PAGE電泳分離培養上清，依據實施例2的方法電轉移蛋白質于PVDF膜，將分子量45-49kD附近的蛋白質進行蛋白測序。其結果是，和內切葡聚糖酶STCE1的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)一致。
《實施例11評價Humicola insolens表達的STCE1對含有纖維素的纖維的絨毛去除活性》使用實施例10(3)的SDS-PAGE確認的表達分子量為45-49kD附近的蛋白質的13株中表達尤為顯著的1株(4A-9株)的培養上清液，測定其對綿織布料的絨毛去除活性。使用來自非轉化體母株的培養上清液作為對照。方法依據實施例3進行，即，通過在pH6、40℃的條件下，以各種培養上清液處理預先有毛羽的藍色綿織布料1小時，去除毛羽，計算起的毛經目視評價大約100％被除去所需的培養上清液中的蛋白質濃度。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表5。


《實施例12評價Humicola insolens表達的內切葡聚糖酶STCE1對靛藍染色的含有纖維素的脫色活性》使用實施例10得到的STCE1大量表達株(4A-9株)和非轉化體母株(MN200-1株)的培養上清液，在下述條件下對脫漿的12盎司藍色牛仔褲進行脫色處理。
試驗儀器20kg洗衣機(三洋電機株式會社生產全自動洗衣機SCW5101)溫度55℃時間60分鐘反應pHpH6.2(6.7mmol/L磷酸緩沖液)處理液量15L處理液中，除培養上清液外，還適當添加膠球。
使用分光測色計(Minolta公司生產，CM-525i)，測定Lab表示系的L值(明度)來確定脫色度。求出相對于對照(未處理纖維)的L值的增加值(白色度的增加)，即ΔL值，由該ΔL值評價脫色程度。即，在每個試驗區測定10個點的ΔL值(n＝10)，算出其平均值。接著，算出為使ΔL值＝7所需的粗制纖維素酶配制液和純化內切葡聚糖酶STCE1的蛋白質濃度。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(BioRa公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表6。


《實施例13和洗滌劑配合使用時，Humicola insolens表達的內切葡聚糖酶STCE1的絨毛去除活性(澄澈化活性)的評價》使用實施例10得到的STCE1大量表達株(4A-9株)和非轉化體母株(MN200-1株)的培養上清液，，如下評價在歐美洗滌劑中對綿織布料的絨毛去除活性(澄澈化活性)。
將預先染色的茶色綿織布料和表面活性劑以及膠球一起置于大型洗衣機中，使起毛。此后，通過在下述條件下，于洗滌劑中處理該起毛的茶色綿織布料，計算當起的毛經目視評價大約有50％被除去所需的培養上清液中的蛋白質濃度。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間60分鐘處理液量40mL洗滌劑種類NEW Persil(Performance Tablets biological)(LEVER公司生產2002年3月于意大利得到。)洗滌劑的添加量0.4％處理液人工硬度水(25FH將在去離子水中加入80mmol/L的氯化鈣、20mmol/L的氯化鎂得到的1000FH人工硬度水，以去離子水稀釋制得。)處理液中，除培養上清液外，還適當添加膠球。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表7。


《實施例14自來水的硬度對Humicola insolens表達的內切葡聚糖酶的絨毛去除活性的影響》使用實施例10得到的內切葡聚糖酶STCE1大量表達株(4A-9株)、NCE5大量表達的Humicola insolens轉化體(國際公開第01/90375號小冊子)、NCE4大量表達的Humicola insolens轉化體(國際公開第98/03640號小冊子)、RCEI(纖維素結合區域缺失的RCEI-H4(25kD))大量表達的Humicola insolens轉化體(國際公開第02/42474號小冊子)等4株的培養上清液，如下評價對洗滌劑中的各種硬度的水中的綿織布料的絨毛去除活性。
將預先染色的茶色綿織布料和表面活性劑以及膠球一起置于大型洗衣機中，使起毛。此后，在各種硬度(0FH、5FH、10FH、20FH、40FH)的人工硬度水中，使用4種培養上清液，在下述條件下處理該已起毛的茶色綿織布料。
試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40℃時間60分鐘處理液量100mL洗滌劑的種類NEW Persil(Performance Tablets biological)(LEVER公司生產2002年3月于意大利得到。)洗滌劑的添加量0.4％處理液人工硬度水(25FH將在去離子水中加入80mmol/L的氯化鈣、20mmol/L的氯化鎂得到的1000FH人工硬度水，以去離子水稀釋制得。)處理液中，除培養上清液外，還適當添加膠球。
對于處理后的布料，計算當起的毛經目視評價大約有50％被除去所需的培養上清液量中的蛋白質濃度，將該蛋白質濃度的倒數作為絨毛去除活性值。接著，求出當以0FH的硬度中的絨毛去除活性值為100時，各硬度下的絨毛去除活性相對值。該結果示于表8。


《實施例15STCE1基因在綠色木霉中的表達》(1)STCE1表達質粒STCE1N-pCB1的構建STCE1基因，在起始密碼子的上游序列預先含有SmaI，終止密碼子的下游預先含有XhoI的狀態下，設計如下變異導入用引物，以PCR法擴增。
STCE1-N-SmaI5’-CAGCCCGGGGCGCATCATGCGTTCCTCCCCTCTCC-3’(35mer)(SEQ ID NO29)STCE1-C-XhoI5’-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3’(33mer)(SEQ ID No30)PCR反應，以質粒pJND-STCE1為模板，STCE1-N-SmaI、STCE1-C-XhoI這兩個合成DNA為引物，使用TaKaRa LA Taq withGC buffer(寶酒造公司生產)進行。反應條件依據酶所附帶的說明書中的條件。由瓊脂糖凝膠電泳分離反應后的樣品，再以限制性酶SmaI和XhoI切割，得到約0.9kbp的基因片段STCE1-N。
另一方面，以限制性酶StuI和XhoI切割pCB1-M2(國際公開第98/11239號小冊子)，回收7.3kbp的片段。使用TaKaRa DNA Ligation試劑盒ver.1(寶酒造公司生產)在上述片段上連接約0.9kbp的基因片段STCE1-N，制成質粒STCE1N-M2。
進而，在質粒STCE1-M2的XbaI位點插入PDH25(Cullen，D.，Leong，S.A.，Wilson，L.J.AND Henner，D.J.，“Gene”，57，p.21-26，1987)來源的潮霉素B耐性盒(resistance cassette)，構建質粒STCE1N-pCB1。酶等的反應條件，依據試劑盒附帶的說明書中的條件。構建的質粒STCE1N-pCB可在宿主木霉內使用自身起始密碼子表達STCE1蛋白質。
(2)融合STCE1表達質粒STCE1M-pCB1的構建STCE1基因，在編碼N末端的氨基酸(Ala)密碼子的緊鄰上游預先含有SphI，終止密碼子的下游預先含有XhoI的狀態下，設計如下變異導入用引物，以PCR法擴增。
STCE1-M-SphI5’-CCGCATGCGCTGATGGCAAGTCCACC-3’(26mer)(SEQ ID NO31)STCE1-C-XhoI5’-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3’(33mer)(SEQ ID NO32)PCR反應，以質粒pJND-STCE1為模板，STCE1-M-SphI、STCE1-C-XhoI這兩個合成DNA為引物，使用TaKaRa LA Taq withGC buffer(寶酒造公司生產)進行。反應條件依據酶所附帶的說明書中的條件。由瓊脂糖凝膠電泳分離反應后的樣品，再以限制性酶SphI和XhoI切割，得到約0.9kbp的基因片段STCE1-M。
另一方面，以限制性酶SphI和XhoI切割pCB1-M2(國際公開第98/11239號小冊子)，回收7.3kbp的片段。使用TaKaRa DNA Ligation試劑盒ver.1(寶酒造公司生產)在上述片段上連接約0.9kbp的基因片段STCE1-N，制成質粒STCE1-M2。
進而，在質粒STCE1-M2的XbaI位點插入PDH25(Cullen，D.，Leong，S.A.，Wilson，L.J.AND Henner，D.J.，“Gene”，57，p.21-26，1987)來源的潮霉素B耐性盒，構建質粒STCE1N-pCB1。酶等的反應條件，依據試劑盒附帶的說明書中的條件。構建的質粒STCE1M-pCB1可在宿主木霉內使用自身起始密碼子，以和CBHI蛋白質的pre-pro序列和構成的融合蛋白的形式表達STCE1蛋白質。
(3)制備質粒STCE1N-pCB1、STCE1M-pCB1對木霉的轉化體將木霉MC300-1株(FERM BP-6047)在S培養基(3.0％葡萄糖、1.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.14％硫酸銨、0.2％磷酸鉀、0.03％硫酸鎂、pH6.8)中28℃培養24小時后，3000rpm離心10分鐘，收集菌體。將得到的菌體以0.5mol/L蔗糖清洗，再混懸于經0.45μm濾膜過濾的原生質體化酶溶液(5mg/mL Novozyme 234、5mg/mL纖維素酶Onozuka R-10、0.5mol/L蔗糖)中。30℃振蕩60-90分鐘，使菌系原生質體化。過濾該混懸液后，2500rpm離心分離10分鐘，回收原生質體，以SUTC緩沖液清洗。
將該原生質體混懸于SUTC緩沖液1mL，加入每100μL含有10μgSTCE1N-pCB1或STCE1M-pCB1的DNA溶液10μL，冰水中靜置5分鐘。接著，加入400μL的PEG溶液(60％PEG4000、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L tris鹽酸(pH7.5)，在冰水中靜置20分鐘后，添加SUTC緩沖液10mL，2500rpm離心分離10分鐘。將收集到的原生質體混懸于SUTC緩沖液1mL后，4000rpm離心分離5分鐘，最終混懸于SUTC緩沖液100μL。
將該原生質體和PD軟瓊脂(1.3％土豆葡萄糖瓊脂、17.1％蔗糖)一起層積于添加有潮霉素B(20μg/mL)的土豆葡萄糖(PD)培養基(3.9％土豆葡萄糖瓊脂、17.1％蔗糖)上，37℃培養5小時，將形成的克隆作為轉化體。
《實施例16STCE1基因的綠色木霉轉化體培養液中的STCE1的確定和絨毛去除活性評價》(1)HPLC評價將質粒STCE1N-pCB1、STCE1M-pCB1導入綠色木霉MC300-1株，選出表現潮霉素B耐性的50個菌株。將它們在S培養基中37℃培養5天，得到的培養上清液以TSKgel TMS-250柱(4.6mmI.D.×7.5cm)(東so公司生產)進行HPLC分析，乙腈濃度為0％到80％的0.05％TFA(三氟乙酸)進行梯度洗脫，流速為1.0mL/min，在UV280nm處檢測峰。其結果是，在STCE1N-pCB1轉化體、STCE1M-pCB1轉化體各自3株中，觀察到野生綠色木霉MC300-1培養上清液沒有的峰，因此，將這些峰分離，依據實施例2的方法確定N末端氨基酸，結果發現，和STCE1的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)一致。
(2)評價STCE1轉化體培養液的絨毛去除活性使用實施例16(1)中表達STCE1的2株和非轉化體母株(MC300-1)的培養液上清，依據實施例3，通過在pH10(5mmol/L碳酸鈉緩沖液)、40℃的條件下，以各種培養上清液對預先已起毛的藍色綿織布料進行毛除去處理1小時，計算出起的毛經目視評價約有50％被除去所需的培養上清液中的蛋白質濃度。
蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-RadLaboratory公司生產)，以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表9。


產業上利用的可能性本發明的新的內切葡聚糖酶STCE，可適用于例如，含有纖維素的纖維的處理、舊紙的脫墨、紙漿的透水性改善、動物試料消化能力的改善等用途。
以上，盡管通過特定的實施方式對本發明進行了說明，但對本領域技術人員而言顯而異見的變形和改良也包含在本發明范圍內。


圖1是顯示，在本發明的內切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列信號肽(SEQ ID NO.33)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.3)與屬于家族45的公知內切葡聚糖酶NCE信號肽(SEQ ID NO.34)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.35)以及NCE信號肽(SEQ ID NO.36)和成熟蛋白質(SEQ ID NO.37)的各氨基酸序列比較的結果中，有關其N末端側序列的結果的說明圖。
圖2是顯示，圖1所示比較結果中，有關C末端側序列的結果的說明圖。
序列表文本以下序列表中的數字<223>中記載“人工序列”的說明。SEQ IDNO18～21的序列表示的堿基序列是引物STCE1-CN，引物STCE1-CC，引物STCE-HNBam，以及引物STCE-HCBam，SEQ ID NO23～32的序列表示的堿基序列是引物NCE4-N-BamHI，引物NCE4-C-BamHI，引物STCE1-N-S9A4，引物STCE1-C-FokF，引物STCE1-N-FokR4，引物STCE1-C-BamF，引物STCE1-C-SmaI，引物STCE1-C-XhoI，引物STCE1-M-SphI，以及引物STCE1-C-C-XhoI。
序列表<110>MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.
<120>內切葡聚糖酶STCE和含有內切葡聚糖酶STCE的纖維素酶配制品<130>MEJ-718<150>JP <151>2003-12-03<160>37<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>1Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys1 5 10 15Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn20 25<210>2<211>951<212>DNA<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<220>
<221>信號肽<222>(1)..(63)<223>
<220>
<221>CDS<222>(64)..(951)<223>
<400>2
atgcgttcct cccccgtcct ccgcacggcc ctggccgctg ccctccccct ggccgccctc 60gct gcc gat ggc aag tcg acc cgc tac tgg gac tgt tgc aag ccg tcg108Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser1 5 10 15tgc tcg tgg ccc ggc aag gcc tcg gtg aac cag ccc gtc ttc gcc tgc156Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys20 25 30agc gcc aac ttc cag cgc atc agc gac ccc aac gtc aag tcg ggc tgc204Ser Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys35 40 45gac ggc ggc tcc gcc tac gcc tgc gcc gac cag acc ccg tgg gcc gtc252Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val50 55 60aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc gcc gcc acg tcc atc tcg ggc ggc300Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly65 70 75aac gag gcc tcg tgg tgc tgt ggc tgc tac gag ctg acc ttc acc tcg348Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser80 85 90 95ggc ccc gtc gct ggc aag acc atg gtt gtc cag tcc acc tcg acc ggc396Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly100 105 110ggc gac ctc ggc acc aac cac ttc gac ctg gcc atg ccc ggt ggt ggt444Gly Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly115 120 125gtc ggc atc ttc gac ggc tgc tcg ccc cag ttc ggc ggc ctc gcc ggc492Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly130 135 140gac cgc tac ggc ggc gtc tcg tcg cgc agc cag tgc gac tcg ttc ccc540Asp Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro145 150 155gcc gcc ctc aag ccc ggc tgc tac tgg cgc ttc gac tgg ttc aag aac588Ala Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn
160 165 170 175gcc gac aac ccg acc ttc acc ttc cgc cag gtc cag tgc ccg tcg gag636Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu180 185 190ctc gtc gcc cgc acc ggc tgc cgc cgc aac gac gac ggc aac ttc ccc684Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro195 200 205gtc ttc acc cct ccc tcg ggc ggt cag tcc tcc tcg tct tcc tcc tcc732Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser210 215 220agc agc gcc aag ccc acc tcc acc tcc acc tcg acc acc tcc acc aag780Ser Ser Ala Lys Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Lys225 230 235gct acc tcc acc acc tcg acc gcc tcc agc cag acc tcg tcg tcc acc828Ala Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ser Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr240 245 250 255ggc ggc ggc tgc gcc gcc cag cgc tgg gcg cag tgc ggc ggc atc ggg876Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gln Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly260 265 270ttc tcg ggc tgc acc acg tgc gtc agc ggc acc acc tgc aac aag cag924Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Asn Lys Gln275 280 285aac gac tgg tac tcg cag tgc ctt taa951Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu290 295<210>3<211>295<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>3Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Ser20 25 30Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp35 40 45Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn50 55 60Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly Asn65 70 75 80Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly85 90 95Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly100 105 110Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly Val115 120 125Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly Asp130 135 140Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala145 150 155 160Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala165 170 175Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu180 185 190Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Val195 200 205Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser210 215 220Ser Ala Lys Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Lys Ala225 230 235 240Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ser Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr Gly245 250 255
Gly Gly Cys Ala Ala Gln Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe260 265 270Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Asn Lys Gln Asn275 280 285Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu290 295<210>4<211>8<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>4Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>5Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>6Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg1 5 10<210>7<211>10<212>PRT
<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>7Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>8Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>9Thr Met Val Val Gln Ser Thr1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>10Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>11Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys
1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>12Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>13Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg1 5 10<210>14<211>16<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>14Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Ser Ala Asn Phe Gln Arg1 5 10 15<210>15<211>22<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>15Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro1 5 10 15Trp Ala Val Asn Asp Asn20
<210>16<211>11<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>16Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys1 5 10<210>17<211>16<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>17Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Thr Asn1 5 10 15<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-CN<400>18gcggatccat gcgttcctcc cccgtc 26<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-CC<400>19gcggatcctt aaaggcactg cgagtacc28<210>20
<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE-HNBam<400>20gggggatcct gggacaagat gcgttcctcc cccgtcctc39<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE-HCBam<400>21gggggatccg ctcaaaggca ctgcgagtac cagtc35<210>22<211>1037<212>DNA<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<220>
<221>信號肽<222>(1)..(63)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(64)..(333)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(420)..(1037)<223>
<220>
<221>內含子<222>(334)..(419)
<223>
<400>22atgcgttcct cccccgtcct ccgcacggcc ctggccgctg ccctccccct ggccgccctc 60gct gcc gat ggc aag tcg acc cgc tac tgg gac tgt tgc aag ccg tcg108Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser1 5 10 15tgc tcg tgg ccc ggc aag gcc tcg gtg aac cag ccc gtc ttc gcc tgc156Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys20 25 30agc gcc aac ttc cag cgc atc agc gac ccc aac gtc aag tcg ggc tgc204Ser Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys35 40 45gac ggc ggc tcc gcc tac gcc tgc gcc gac cag acc ccg tgg gcc gtc252Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val50 55 60aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc gcc gcc acg tcc atc tcg ggc ggc300Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly65 70 75aac gag gcc tcg tgg tgc tgt ggc tgc tac gag tgagtgcttc cccccccccc 353Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu80 85 90ccccccccac ccccggttcg gtcccttgcc gtgccttctt catactaacc gcctaccccc 413tccagg ctg acc ttc acc tcg ggc ccc gtc gct ggc aag acc atg gtt 461Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val95 100gtc cag tcc acc tcg acc ggc ggc gac ctc ggc acc aac cac ttc gac509Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp105 110 115 120ctg gcc atg ccc ggt ggt ggt gtc ggc atc ttc gac ggc tgc tcg ccc557Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro125 130 135cag ttc ggc ggc ctc gcc ggc gac cgc tac ggc ggc gtc tcg tcg cgc605
Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg140 145 150agc cag tgc gac tcg ttc ccc gcc gcc ctc aag ccc ggc tgc tac tgg653Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp155 160 165cgc ttc gac tgg ttc aag aac gcc gac aac ccg acc ttc acc ttc cgc701Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg170 175 180cag gtc cag tgc ccg tcg gag ctc gtc gcc cgc acc ggc tgc cgc cgc749Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg185 190 195 200aac gac gac ggc aac ttc ccc gtc ttc acc cct ccc tcg ggc ggt cag797Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Gln205 210 215tcc tcc tcg tct tcc tcc tcc agc agc gcc aag ccc acc tcc acc tcc845Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Lys Pro Thr Ser Thr Ser220 225 230acc tcg acc acc tcc acc aag gct acc tcc acc acc tcg acc gcc tcc893Thr Ser Thr Thr Ser Thr Lys Ala Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ser235 240 245agc cag acc tcg tcg tcc acc ggc ggc ggc tgc gcc gcc cag cgc tgg941Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gln Arg Trp250 255 260gcg cag tgc ggc ggc atc ggg ttc tcg ggc tgc acc acg tgc gtc agc989Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser265 270 275 280ggc acc acc tgc aac aag cag aac gac tgg tac tcg cag tgc ctt tga 1037Gly Thr Thr Cys Asn Lys Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu285 290 295<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物NCE4-N-BamHI<400>23ggggatcctg ggacaagatg cgttcctccc ctctcctcc39<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物NCE4-C-BamHI<400>24ggggatcctg cgtttacagg cactgatggt accagtc 37<210>25<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-N-S9A4<400>25gggatcctgc gtttaaaggc actgcgagta ccag 34<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-C-FokF<400>26gggatgcaag ccgtcgtgct cgtg24<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-N-FokR4<400>27gggatgggcc cagccgcacg aag 23<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-C-BamF<400>28gggatcctgg gacaagatgc 20<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-N-SmaI<400>29cagcccgggg cgcatcatgc gttcctcccc tctcc35<210>30<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-C-XhoI<400>30gcctcgagta ccttaaaggc actgcgagta cca 33<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-M-SphI<400>31ccgcatgcgc tgatggcaag tccacc 26<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物STCE1-C-XhoI<400>32gcctcgagta ccttaaaggc actgcgagta cca 33<210>33<211>21<212>PRT<213>Staphylotrichum coccosporum IFO 31817<400>33Met Arg Ser Ser Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro1 5 10 15Leu Ala Ala Leu Ala20<210>34<211>20<212>PRT<213>Humicola insolens<400>34Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro1 5 10 15Val Leu Ala Leu20
<210>35<211>286<212>PRT<213>Humicola insolens<400>35Ala A1a Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser1 5 10 15Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys20 25 30Asn Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys35 40 45Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala50 55 60Val Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly65 70 75 80Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr85 90 95Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr100 105 110Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly115 120 125Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro130 135 140Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe145 150 155 160Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys165 170 175Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala180 185 190Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe
195 200 205Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Gly Gln210 215 220Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro225 230 235 240Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Cys245 250 255Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly260 265 270Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu275 280 285<210>36<211>17<212>PRT<213>Humicola insolens<400>36Met Gln Leu Pro Leu Thr Thr Leu Leu Thr Leu Leu Pro Ala Leu Ala1 5 10 15Ala<210>37<211>206<212>PRT<213>Humicola insolens<400>37Ala Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys1 5 10 15Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys20 25 30Asp Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly
35 40 45Cys Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp50 55 60Ala Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe85 90 95Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn100 105 110Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly115 120 125Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro130 135 140Pro Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu145 150 155 160Cys Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe165 170 175Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val180 185 190Ser Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg195 200 20權利要求
1.來源于圓孢霉屬(Staphylotrichum)微生物，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。
2.如權利要求1所述蛋白質，其具有以下(A)和(B)特性(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
3.如權利要求2所述蛋白質，其具有以下(A)、(B)和(C)特性(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列、(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為49kD。
4.如權利要求2所述蛋白質，其具有以下(A)、(B)和(C)特性(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列、(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為45kD。
5.如權利要求1-4中任一項記載的蛋白質，其來源于Staphylotrichum coccosporum。
6.選自下述的蛋白質(a)包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質，以及(c)包含與含有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白質至少85％同源的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的同源蛋白質。
7.編碼權利要求1-6中任一項記載的蛋白質的多核苷酸。
8.選自下述的多核苷酸(i)包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列的多核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列缺失、取代、插入或添加1個或多個堿基而得的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及(iii)于包含SEQ ID NO.2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。
9.包含權利要求7或8中記載的多核苷酸的表達載體。
10.權利要求9中記載的表達載體轉化的宿主細胞。
11.權利要求10中記載的宿主細胞，其中所述的宿主是酵母或絲狀菌的。
12.如權利要求11所記載的宿主細胞，其中，所述酵母為釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物。
13.如權利要求11所記載的宿主細胞，其中，絲狀菌為腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、圓孢霉屬、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢霉屬(Fusarium)或頂孢霉屬(Acremonium)的微生物。
14.如權利要求13所記載的宿主細胞，其中，絲狀菌為Humicolainsolens或綠色木霉(Trichoderma viride)。
15.蛋白質的制造方法，其包含培養權利要求10-14中任一項記載的宿主細胞的步驟，以及從前述培養所得的宿主細胞或其培養物收集權利要求1-6中任一項記載的蛋白質的步驟。
16.以權利要求15中記載的方法生產的蛋白質。
17.纖維素酶配制物，其包含權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質的纖維素酶配制物。
18.洗滌組合物，其包含權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質，或權利要求17中記載的纖維素酶配制物。
19.含有纖維素的纖維的處理方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中的任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
20.降低含有纖維素的纖維起毛速度或者減少含有纖維素的纖維的起毛的方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
21.為改善含有纖維素的纖維的肌膚觸感和外觀的減量加工方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
22.使染色后的含有纖維素的纖維的色澤澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中的任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
23.使染色后的含有纖維素的纖維的色澤具有局部性變化的方法，其包括使染色后的含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
24.降低含有纖維素的纖維開始變硬的速度或減少含有纖維素的纖維的硬度的方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、權利要求17中記載的纖維素酶配制物、或權利要求18中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
25.權利要求19-24中任一項記載的方法，其中所述的纖維素處理是通過將纖維浸漬、清滌或洗涮進行的。
26.舊紙脫墨的方法，其特征在于，在通過舊紙脫墨化學品處理來脫墨的步驟中，使用權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、或權利要求17中記載的纖維素酶配制物。
27.改善紙漿的濾水性的方法，其包含以權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、或權利要求17中記載的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。
28.改善動物飼料的消化能力的方法，其包含以權利要求1-6以及權利要求16中任一項記載的蛋白質、或權利要求17中記載的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的步驟。
全文摘要
公開Staphylotrichum coccosporum來源的新的內切葡聚糖酶、編碼上述內切葡聚糖酶的多核苷酸、以及含有上述內切葡聚糖酶的纖維素酶配制物。上述內切葡聚糖酶或纖維素酶配制物可用于含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化、起毛的減少、肌膚觸感和外觀的改善、色彩的局部性變化、以降低硬化等為目的的洗滌用，以及纖維加工用途。
文檔編號C11D3/386GK1902315SQ20048003610
公開日2007年1月24日 申請日期2004年10月22日 優先權日2003年12月3日
發明者古賀仁一郎, 馬場裕子, 中根公隆, 花村聰, 西村智子, 五味修一, 洼田英俊, 河野敏明 申請人:明治制果株式會社