專利名稱：內切葡聚糖酶stce和含有內切葡聚糖酶的纖維素酶配制品的制作方法
技術領域：
本發明關于內切葡聚糖酶STCE(End0glucanaSeS STCE)和含有內切葡聚糖酶的纖維素配制品，以及利用它們對含有纖維素的纖維進行處理的方法。
背景技術：
以往，對于含有纖維素的纖維，為賦予纖維所期望的特性，采用纖維素酶對其進行處理。例如，在纖維產業中，為改善含有纖維素的纖維與皮膚的觸感和外觀，或者為使染色后的含有纖維素的纖維具有色澤局部性變化的“石磨”外觀，采用纖維素酶進行處理歐洲專利第307，564號說明書(專利文獻I)。此外已知，染色后的含有纖維素的纖維，在反復清洗后，會起毛，染色布料的色澤也變得不鮮明。因此，通過在洗滌劑中含有纖維素酶，除毛或者使其不再起毛，可使得染色布料的色澤鮮明，即，使其澄澈化歐洲專利第220，016號說明書(專利文獻2)、國際公開第95/02675號小冊子(專利文獻3)、國際公開第97/30143號小冊子(專利文獻4)、國際公開第98/08926號小冊子(專利文獻5)，含有纖維素酶的洗滌劑主要在歐洲銷售。對于洗滌中使用的纖維素酶，已知在洗滌劑中，腐質霉屬(Humicola)來源的純化的43kD內切葡聚糖酶成分(EGV)的澄澈化活性(除去布料中起的毛，使布料色澤鮮明的活性)是以往的由多種纖維素成分混合而成的纖維素配制品的約30倍國際公開第91/17243號小冊子(專利文獻6)。此外已知，通過使來源于腐質霉屬的內切葡聚糖酶NCE5(以下有時簡稱為NCE5)在洗滌劑中發生反應，也可達到染色布料澄澈化的效果國際公開第01/90375號小冊子(專利文獻7)。進而已知，在洗滌劑中，根霉屬(Rhizopus)來源的內切葡聚糖酶RCEI (以下有時簡稱為RCEI)表達增強的Humicola insolens培養液的澄澈化活性是RCEI表達未增強的Humicola insolens培養液的20倍以上國際公開第00/24879號小冊子(專利文獻8)。像這樣，盡管已知有多種內切葡聚糖酶具有使染色布料澄澈化活性，然而實際和歐美洗滌劑配合使用時，能夠充分發揮活性的內切葡聚糖酶卻很少。這被認為是由于歐美洗滌劑中含有大量陰離子表面活性剤、增效組分等，抑制了酶的活性。此外，歐美洗滌用自來水一般硬度較高，含有大量的Ca2+、Mg2+等2價陽離子。這些2價陽離子可顯著降低洗滌劑中的表面活性劑的洗滌能力，因而，為吸附這些2價陽離子，洗漆劑中配合有增效組分Fragrance Journal, 1995年，11卷,p. 33-55 (非專利文獻I)。此外，由于自來水的硬度因地域而差別很大，在洗滌劑中配合的增效組分的種類和添加量上，也根據地域不同頗費工夫。此外，已知不僅洗滌劑的洗滌能力，而且纖維素酶的活性也受到這些 2 價陽離子的影響Mansfield, S. D.等人,Enzyme Microb. Technol. ,23,1998 年,pl33_140 (非專利文獻)、Jenkins, C. C. AND Suberkropp, K. , Freshwater Biology, 33 卷第2號，1995年，p245-253(非專利文獻3)。因而，產生了纖維素酶的活性因水的硬度受到抑制，無法取得滿意的澄澈化效果的問題，反之會出現纖維素酶活性增強使布料的強度降低的問題。由于增效組分本身會影響纖維素酶的活性，因而，通過添加增效組分來緩和水的硬度對纖維素酶澄澈化活性的影響是很難的。所以人們需要不易受到自來水硬度的影響，并且具有穩定的澄澈化活性的纖維素酶。以往，盡管可以使用多種纖維素酶成分的混合物處理含有纖維素的纖維，但對于含有纖維素的纖維而言，為取得滿意的效果需要配合使用大量纖維素酶，因而其實用性受到限制。因此，大多數情況下，提供的纖維素酶配制物中含有大量高活性內切葡聚糖酶。其制造方法已知有，采用基因重組技術，在宿主細胞中大量表達高活性的目的內切葡聚糖酶成分的方法國際公開第91/17243號小冊子(專利文獻6)、國際公開第98/03667號小冊子(專利文獻9)、國際公開第98/11239號小冊子(專利文獻10)。作為這些方法中優選的宿主細胞，可以舉出屬于不完全菌類的絲狀菌，例如，曲霉屬(Aspergillus)、腐質霉屬、木霉屬(Trichoderma)的絲狀菌等。進而，在生產洗漆劑中使用的纖維素酶時，因洗滌劑中的PH為堿性，較之生產酸性纖維素酶的木霉屬絲狀菌而言，以生產中性纖維素酶的曲霉屬和腐質霉屬的絲狀菌為宿主，更為適宜。尤其考慮到生產エ業化酶時，生產性高的腐質霉屬絲狀菌是更優良的宿主國際公開第01/90375號小冊子(專利文獻7)、國際公開第98/03640號小冊子(專利文獻11)。然而，將異源基因在腐質霉屬絲狀菌中表達時，因其堿基序列上的特性差異(基因密碼子使用頻率不同)等原因，表達常常受到抑制。因而，有必要對異源基因進行改變的操作。例如，為使屬于接合菌類的根霉屬來源的內切葡聚糖酶RCEI在Humicola insolens 中大量表達，必須將編碼RCEI的基因最適化，以適合宿主細胞的密碼子使用頻率國際公開第00/24879號小冊子(專利文獻8)。但是，盡管這樣進行了最適化，可以預想，得到和通常同種基因同等程度的表達量是很難的。并且，在實際表達時，由宿主產生的目的酶在培養過程中可被培養液中的蛋白酶分解，從而獲得分解物或部分分解物。專利文獻I :歐洲專利第307，564號說明書專利文獻2 :歐洲專利第220，016號說明書專利文獻3 :國際公開第95/02675號小冊子專利文獻4 :國際公開第97/30143號小冊子專利文獻5 :國際公開第98/08926號小冊子專利文獻6 :國際公開第91/17243號小冊子專利文獻7 :國際公開第01/90375號小冊子專利文獻8 :國際公開第00/24879號小冊子專利文獻9 :國際公開第98/03667號小冊子專利文獻10 :國際公開第98/11239號小冊子專利文獻11 :國際公開第98/03640號小冊子非專利文獻I :Fragrance Journal, 1995 年，11 卷，p33-55
非專利文獻2 Mansf ield, S. D.等人，Enzyme Microb. Technol.，23,1998 年，P133-140非專利文獻3 Jenkins, C. C. AND Suberkropp, K.，Freshwater Biology, 33 卷第2 號，1995 年，p245-2
發明內容
發明要解決的問題以往，為用于纖維用 洗滌用途,從腐質霉屬、木霉屬、根霉屬、毛霉屬(Mucor)、須霉屬(Phycomyces)等多種絲狀菌分離纖維素酶，再分離出編碼這些纖維素酶的基因。然而，在含有大量陰離子表面活性劑和增效組分的歐美型洗滌劑中仍具有高澄澈化活性，并且不易受到自來水的硬度影響，并且具有穩定的澄澈化活性的酶，目前尚未見報道。進而，若發現在優良宿主腐質霉屬絲狀菌中可大量表達，并且基因未經過改變的 異源絲狀菌來源的纖維素酶基因，其產業上的應用價值將不可估量，然而，目前尚未見這樣的基因報道。解決問題的手段在此，本發明人發現并提供了來自以往分離纖維素酶或纖維素酶基因的報告中從未提到的圓孢霉屬(Staphylotrichum)的微生物的、具有高內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質和其基因。本發明人發現，本發明的從圓孢霉屬微生物分離得到的具有高內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質，在歐美洗滌劑中，對含有纖維素酶布料顯示出極強的澄澈化活性。例如，Staphylotrichum coccosporum來源的本發明的內切葡聚糖酶，尤其是其中的內切葡聚糖酶STCEl (以下有時簡稱為STCE1)，在代表性歐洲洗滌劑中具有高澄澈化活性，約為已知的具有澄澈化活性的洗滌用纖維素酶-內切葡聚糖酶NCE5(以下有時簡稱為NCE5)(國際公開第01/90375號小冊子)的16倍，內切葡聚糖酶RCEI (國際公開第00/24879號小冊子)的80倍以上。進而，驚奇地發現該內切葡聚糖酶STCEl的活性不受到自來水的硬度影響，具有穩定的澄澈化活性。例如，已知的對含有纖維素的纖維具有高絨毛去除活性的內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)、NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)的澄澈化活性隨自來水的硬度的增加而增加，而內切葡聚糖酶RCEI (國際公開第00/24879號小冊子)的澄澈化活性則隨自來水的硬度的增加而降低。然而，本發明的內切葡聚糖酶STCEl不受自來水的硬度影響，具有穩定的澄澈化活性。到目前為止，沒有任何有關在歐美洗滌劑中具有高澄澈化活性，并且不受自來水硬度的影響，并具有穩定活性的纖維素酶的了解。更令人驚嘆的發現是，Staphylotrichum coccosporum來源的內切葡聚糖酶STCEl在以與Staphylotrichum coccosporum不同的菌株Humicola insolens為宿主的轉化體中，在不用對內切葡聚糖酶STCEl基因進行任何改變操作的情況下就能大量表達。因而，本發明提供圓孢霉屬微生物來源的具有內切葡聚糖酶活性的新的蛋白質及其基因，并提供含有上述蛋白質、具有良好特性的纖維素酶配制物。本發明還提供以編碼上述蛋白質的基因轉化的宿主細胞，以及培養上述宿主細胞并收集目的蛋白的方法。進ー步提供通過本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的方法。
即，本發明包含以下發明。(I)來源于圓孢霉屬微生物，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。(2)具有以下(A)和⑶特性的⑴中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B)N末端氨基酸序列是SEQ ID NO. I所示的序列。(3)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性、(B) N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列
(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為49kD。(4)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中記載的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列、(C)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)測定的平均分子量為45kD。(5)來源于 Staphylotrichum coccosporum 的(1)-(4)中任一項記載的蛋白質。(6)選自下述的蛋白質(a)包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質，(b)包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質，以及(c)包含與含有SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質至少85%同源的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的同源蛋白質。(7)編碼(1)-(6)中任一項記載的蛋白質的多核苷酸。(8)選自下述的多核苷酸(i)包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基序列的多核苷酸，(ii)包括在包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個堿基所得的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及(iii)包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基序列的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。(9)包含(7)或⑶中記載的多核苷酸的表達載體。(10) (9)中記載的表達載體轉化的宿主細胞。(11)宿主是酵母或絲狀菌的(10)中記載的宿主細胞。(12) (11)中記載的宿主細胞,所述的酵母為釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物。(13)(11)中記載的宿主細胞，所述的絲狀菌為腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、圓抱霉屬(Staphylotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)、祿抱霉屬(Fusarium)或頂孢霉屬(Acremonium)的微生物。(14) (13)中記載的宿主細胞,所述的絲狀菌為Humicola insolens或綠色木霉(Trichoderma viride)。(15)蛋白質的制造方法，其包含培養(10)-(14)中任一項記載的宿主細胞的步驟以及從前述培養所得的宿主細胞或其培養物收集(1)-(6)任一項記載的蛋白質的步驟。(16)以(15)中記載的方法生產的蛋白質。(17)包含(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質的纖維素酶配制物。(18)包含(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質，或(17)中記載的纖維素酶配制物的洗滌組合物。(19)含有纖維素的纖維的處理方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(20)降低含有纖維素的纖維起毛速度或者減少含有纖維素的纖維的起毛的方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中 記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(21)為改善含有纖維素的纖維的肌膚觸感和外觀的減量加工方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(22)使染色后的含有纖維素的纖維的色澤澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(23)使染色后的含有纖維素的纖維的色澤具有局部性變化的方法，其包括使染色后的含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(24)降低含有纖維素的纖維開始變硬的速度或減小含有纖維素的纖維的硬度的方法，其包含使含有纖維素的纖維和(1)-(6)以及(16)中的任一項記載的蛋白質、(17)中記載的纖維素酶配制物、或(18)中記載的洗滌組合物接觸的步驟。(25) (19)-(24)任一項記載的方法，其中所述的纖維素處理是通過將纖維浸潰、清滌或洗涮進行的。(26)舊紙脫墨的方法，其特征在于，在通過舊紙脫墨化學品處理來脫墨的步驟中，使用(1)-(6)以及(16)中任一項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物。(27)改善紙漿的濾水性的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任ー項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。(28)改善動物飼料的消化能力的方法，其包含以(1)-(6)以及(16)中任ー項記載的蛋白質、或(17)中記載的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的步驟。發明的效果本發明的蛋白質，尤其是內切葡聚糖酶STCE1，可用于洗滌、纖維加工用途，可使含有纖維素的纖維色澤澄澈，起毛減少，肌膚觸感改善，色澤局部變化，硬度降低等。
具體實施例方式具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質本說明書中的“內切葡聚糖酶”指的是具有內切葡聚糖酶活性的酶，S卩，指的是內切-1，4-P I-葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4)，上述酶水解3-1，4-葡聚糖的3-1，4-吡喃葡萄糖苷鍵。此外，本說明書的“ ￠-1,4-葡聚糖酶活性”指的是CMC酶活性。“CMC酶活性”指的是水解羧甲基纖維素(CMC，東京化成エ業株式會社生產)的活性，測定被檢蛋白質和CMC溶液孵育一定時間后游離出的還原糖量，將生成相當于Iymol葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為I個單位。內切葡聚糖酶活性，例如可通過如下方法測定。首先，將含有被檢蛋白質的溶液0. 5mL添加于溶解有2% CMC的50mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH6. 0)0. 5mL中，50°C孵育30分鐘。接著，以3，5-ニ硝基水楊酸法(DNS法)定量。即，在反應30分后的反應液中添加DNS試液3. OmL,在沸騰水浴中孵育5分鐘后，以蒸餾水8. OmL稀釋，測定540nm的吸光度。利用分段稀釋的葡萄糖溶液制成檢測線，以葡萄糖換算確定酶反應液中生成的還原糖量。以I分鐘內生成相當于Iumol葡萄糖的還原糖的酶量作為I個單位，計算出活性。DNS試劑可依據文獻(例如，《生物化學試驗法I-還原糖的定量法》，P19-20，福井作藏著，學會出版中心)中的記載配制，例如，可采用如下順序配制。首先，在4. 5%氫氧化鈉水溶液300mL中，添加1% 3，5-ニ硝基水楊酸溶液880111し和羅氏鹽255§(溶液八)。另外，在1.0%氫氧化鈉溶液22mL中添加結晶酚10g，再添加水溶解成為IOOmL (溶液B)。在溶液B 69mL 中添加碳酸氫鈉6. 9g使其溶液，再注入溶液A，攪拌混合直至羅氏鹽充分溶解，放置2天后，過濾。本發明的蛋白質可從絲狀菌類，具體而言，圓孢霉屬微生物，優選Staphylotrichum coccosporum,更優選 Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 株犾得，也可以是其變異株。進而，本發明的蛋白質，典型地，其N末端的氨基酸序列具有以SEQ ID NO. I所示的序列。N末端的氨基酸序列，例如，可由后述實施例2表示的方法確定。根據本發明，提供來源于圓孢霉屬并具有以下特性的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列，(C)由SDS-PAGE測定的平均分子量為49Kd。進而提供具有以下特性的蛋白質(A)具有內切葡聚糖酶活性，(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列，(C)由SDS-PAGE測定的平均分子量為45Kd。此處，由SDS-PAGE測定的平均分子量可由實施例I所示的方法確定。本發明的其他實施方式，提供包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質，以及其修飾蛋白質或其同源蛋白質。“包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質”包括，例如，由SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列構成的蛋白質，在由SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中添加信號肽序列構成的蛋白質，以及由在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加適當標記序列而得的氨基酸序列構成的蛋白質。信號肽，例如，在SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中，是由第1-3位的ATG開始到第61-63結束的核苷酸序列編碼的21個氨基酸殘基構成的氨基酸序列(SEQ ID NO. 33)。作為上述標記序列，例如，可以使用有助于容易地進行多肽的表達確認、細胞內局部確認的序列，例如，使用FLAG標記、六個組氨酸標記、血球凝集素標記或myc表位等。本發明中的“修飾蛋白質”指的是，包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個(優選I個或幾個)氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處，與“缺失、取代、插入或添加”等修飾相關的氨基酸的數目，優選為1-30個，更優選為1-10個，尤其優選為1-6個。此外，進行修飾的氨基酸，只要是能夠維持或提高內切葡聚糖酶活性，就沒有特殊限定，例如，可以修飾催化區域、接頭或結合區域中的氨基酸。進而，修飾蛋白質包括，例如，包含在SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列中，有I個或多個氨基酸殘基被保守性取代的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處，“保守性取代”指的是，在不實質性改變蛋白質活性的條件下，將I個或多個氨基酸殘基以化學上類似的其它氨基酸取代。例如可舉出，將某疏水性殘基以其它疏水性殘基取代的情形，將某極性殘基以具有相同電荷的其它極性殘基取代的情形。可進行這種保守性取代的功能類似的氨基酸，在各氨基酸相應的技術領域都是公 知的。具體而言，作為非極性(疏水性)氨基酸，可以舉出，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可以舉出，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為帶有正電荷(堿性)的氨基酸，可以舉出，精氨酸、組氨酸、賴氨酸等，此外，作為負電荷(酸性)氨基酸，可以舉出，天冬氨酸、谷氨酸等。本發明中的“同源蛋白質”指的是，包含和SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列具有至少85%，優選90%，更優選95%以上同源性(序列同一性)的氨基酸序列，并具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。此處所示同源性數值，表示的是在本領域技術人員所公知的同源性檢索程序 FASTA3 [Science, 227，1435-1441 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85，2444-2448 (1988) ；//www. ddb j. nig. ac. jp/E-mai 1/homology-j. html ]中米用默認(初期設定)參數而計算出的數值(同一‘注；identity)。作為本發明蛋白質的具體例子，可以舉出，內切葡聚糖酶STCEl或內切葡聚糖酶STCE3。本發明中，將這些統稱為“內切葡聚糖酶STCE”。本發明的內切葡聚糖酶STCE是，如后述實施例2所示，屬于家族45的內切葡聚糖酶。作為屬于家族45的公知的內切葡聚糖酶，例如可以舉出，腐質霉屬來源的內切葡聚糖酶NCE4(國際公開第98/03640號小冊子)或NCE5(國際公開第01/90375號小冊子)、或根霉屬來源的內切葡聚糖酶RCEI (國際公開第00/24879號小冊子)。圖I和圖2顯示的是，本發明的內切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列信號肽(SEQID NO. 33)和成熟蛋白質(SEQ ID NO. 3)與屬于家族45的公知內切葡聚糖酶NCE信號肽(SEQ ID NO. 34)和成熟蛋白質(SEQ ID NO. 35)以及NCE信號肽(SEQ ID NO. 36)和成熟蛋白質(SEQ ID NO. 37)的各氨基酸序列比較的結果。圖I表示的是前半部(N末端側)結果，圖2表示的是后半部(C末端側)結果。圖I和圖2中，記號“*”表示的是和STCEl共有的氨基酸。如圖I和圖2所示，屬于家族45的內切葡聚糖酶，共有區域為催化區域(catalytic domain) (I位到207位)，根據情況,有時還具有接頭(Linker) (208位-258位)以及或纖維素結合區域(cellulose-binding domain ；CBD) (259位-295位)。各區域后括號內顯示的序號，是內切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列(SEQ ID NO. 3)中的氨基酸號。上述各區域內，發現在催化區域和纖維素結合區域，有很多各內切葡聚糖酶間的保守氨基酸，而在接頭未發現顯著的保守區域。含有大量保守氨基酸的區域(例如，催化區域或纖維素結合區域，尤其是催化區域)，或者是包含在該區域中的共有氨基酸，因被認為是關系到本發明內切葡聚糖酶(例如，STCE1)的酶活性的重要區域或氨基酸，通過在其以外的區域或氨基酸中改變氨基酸(例如，缺失、取代、插入、以及/或添加，尤其是保守取代)，可高效率獲得該酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。此外，在含有大量保守氨基酸的區域，即使將各內切葡聚糖酶間非共有氨基酸變為其它氨基酸(優選可保守取代的類似氨基酸)，其酶活性的維持可能性也很高，通過進行這種氨基酸改變，可高效率得到其酶活性得到維持的修飾蛋白質或同源蛋白質，而無需過度試驗。即使是含有大量保守氨基酸的區域內的共有氨基酸，改變為其它氨基酸時，有時也可維持其酶活性，尤其是改變為可保守取代類似氨基酸的時候，其可能性增高。本發明的 修飾蛋白質或同源蛋白質，只有是具有內切葡聚糖酶活性(即，維持或提高改變前的內切葡聚糖酶活性)，可以是任意區域，例如催化區域、接頭或纖維素結合區域所含的氨基酸改變的蛋白質。本發明的蛋白質，例如可以通過如實施例I記載的從微生物中提取、純化得到。此夕卜，如后述利用基因重組技術，使編碼本發明的蛋白質的多核苷酸在適當宿主中表達，分離、純化產生的蛋白質，也可得到本發明的蛋白質。編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸根據本發明，提供編碼包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質、其修飾蛋白質、以及同源蛋白質的多核苷酸。若提供了蛋白質的氨基酸序列，則很容易確定其編碼堿基序列，由此，可選擇編碼本發明蛋白質的各種堿基序列。本說明書中，“多核苷酸”一詞，DNA和RNA兩者都包含，優選DNA。本發明的多核苷酸，典型而言，選自由下述的組(i)包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64_948位堿基序列的多核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO. 2所示的堿基序列的第64-948位堿基構成的序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個堿基而成的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及(iii)與包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-948位堿基的序列的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。在SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-948位堿基的序列中，可以缺失、取代、插入或添加的堿基數，優選為1-30個，更優選為1-18個，尤其優選為1-9個。此處，上述(iii)中的“嚴緊條件”指的是控制在如下條件使得包含SEQ ID NO. 2所示的堿基序列中的第64-948位堿基序列的探針，和編碼同源蛋白質的多核苷酸雜交，但該探針不和內切葡聚糖酶NCE5基因(國際公開第01/90375號小冊子)雜交。更具體而言，例如可舉出如下條件，探針使用具有編碼標記的內切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列的全長堿基序列的探針，通過ECL直接DNA/RNA水平檢測系統(Amersham公司生產)附帶的操作方法，42°C預雜交I小時后，添加上述探針，42°C雜交15分鐘后，以添加有0. 4% SDS和6mol/L尿素的0. 4倍或0. 4倍以下濃度的SSC(1倍濃度的SSC 15mmol/L枸櫞酸三鈉、150mmol/L的氯化鈉于42 °C反復清洗2次，每次20分鐘，接著，以5倍濃度的SSC于室溫清洗2次，每次10分鐘。本發明的多核苷酸，可以是天然來源的多核苷酸，也可以是全合成的多核苷酸，此夕卜，也可利用天然來源的多核苷酸的一部分，合成得到。作為本發明的多核苷酸的典型獲得方法，可以舉出，從Staphylotrichum coccosporum的基因文庫,采用基因工程學領域常用方法，例如，使用以部分氨基酸序列的信息為基礎制成的適當DNA探針，進行篩選的方法
坐寸o編碼本發明的內切葡聚糖酶STCEl的氨基酸序列的典型堿基序列，具有SEQ IDNO. 2所不的喊基序列中第64-948位喊基的序列。SEQ ID NO. 2所不的喊基序列，具有從1-3位的ATG開始，到949-951位的TAA終止的開放閱讀框。此外，64-66的核苷酸序列，對應于包含295個氨基酸殘基的內切葡聚糖酶STCEl的成熟蛋白質的N末端氨基酸。 表汰載體和轉化微牛物本發明提供一種表達載體，其可使編碼包含SEQ ID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質，其修飾蛋白質和同源蛋白質的堿基序列(以下稱為“本發明的多核苷酸”)在宿主微生物內復制，并且以可表達狀態含有其堿基序列編碼的蛋白質。本發明的載體是自我復制載體，g卩，作為獨立體存在于染色體外，其復制不依賴于染色體的復制，例如，可由此構建質粒。此外,本發明的表達載體,在導入宿主微生物時,也重組到其宿主微生物的基因組中,和重組后的染色體一起復制。本發明的載體的構建順序和方法，可使用基因工程學領域常用的方法。本發明的表達載體，為將其實際導入宿主微生物，表達具有期望活性的蛋白質，優選除含有上述本發明的多核苷酸外，還含有調控其表達的堿基序列和用于選擇轉化體的基因標記等。作為調控表達的堿基序列，包含啟動子、終止子以及編碼信號肽的堿基序列等。啟動于只要是可在宿主微生物中表現轉錄活性，就沒有特殊限制，可得到調控編碼和宿主微生物同種或異種任意蛋白質的基因表達的堿基序列。信號肽只要是在宿主微生物中提供蛋白質分泌作用即可，無特殊限制，可以由編碼與宿主微生物同種或異種的任意蛋白質的基因的堿基序列獲得。此外，本發明的基因標記，可以根據轉化體的選擇方法適宜選擇，例如，可利用編碼耐藥性的基因、需要補充營養的基因。進而，根據本發明，提供經表達載體轉化的微生物。該宿主-載體系統，沒有特殊限定，例如，可采用使用了大腸菌、放線菌、酵母、絲狀菌等的系統，以及使用它們和其它蛋白質構成的融合蛋白質表達系統。這些表達載體對微生物的轉化可使用本領域慣用的方法進行。進一步，在適當的培養基種培養轉化體，可以從宿主細胞或其培養物種分離本發明的蛋白質。因而，根據本發明的其它實施方式，提供上述本發明的新蛋白質的制造方法。轉化體的培養及其條件，可以是和使用的微生物實質上等同的培養和培養條件。此外，轉化體培養后，回收目的蛋白質的方法，可以使用在該領域慣用的方法。根據本發明的優選實施方式，提供由本發明的多核苷酸堿基序列編碼，表達內切葡聚糖酶的酵母細胞。作為本發明的酵母細胞，可舉出例如，釀酒酵母屬、漢遜酵母屬、或畢赤酵母屬的微生物，例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，作為本發明種的新蛋白質的最適制造方法，提供在屬于不完全菌類的絲狀菌的表達方法。作為本發明中的較為適宜的宿主絲狀菌，可舉出腐質霉屬、木霉屬、圓孢霉屬、曲霉屬、鐮孢霉屬或頂孢霉屬的絲狀菌，更優選腐質霉屬或木霉屬。更具體而言，可舉出，Humicolainsolens、Humicola thermoidea、綠色木霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum)或纖維素分解頂抱霉(Acremonium cellulolyticus),更優選，Humicola insolens 或綠色木霉。纖維素酶的用途/纖維素酶配制物本發明還涉及含有本發明蛋白質(例如，包含序號3表不的氣基酸序列的蛋白質，或其修飾蛋白質或同源蛋白質，或培養本發明的宿主細胞而得到的蛋白質)的纖 維素酶配制物。一般而言，所說的纖維素酶配制物，除纖維素外，還可含有例如，賦形劑(例如，乳糖、氯化鈉、山梨醇等)、防腐劑、以及/或非離子表面活性劑等。此外，纖維素酶配制物的形態，可以是固態，也可以是液態，具體而言，可舉出，粉劑、粒劑、顆粒劑、非粉塵化顆粒、或液體制劑。本發明的纖維素酶配制物中，除本發明的蛋白質外，也可含有其它纖維素酶，例如，纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、P -葡萄糖苷酶、以及/或本發明的內切葡聚糖酶以外的內切葡聚糖酶。作為纖維素酶配制物的一種，非粉塵化顆粒(優選無飛散性顆粒狀)，可使用通常的干式造粒法制造。即，將粉末狀本發明蛋白質混合到選自不影響內切葡聚糖酶活性的中性無機鹽(例如，硫酸鈉、氯化鈉)、不影響內切葡聚糖酶活性的礦物質(例如，膨潤土、蒙脫石)和中性有機物(例如，淀粉或粒狀纖維素等)等的I種或多種中后，加入I種或多種非離子表面活性劑粉末，或微細懸濁的懸濁液，充分混合或混煉。根據情況，適當添加使固體粘著的合成高分子(例如，聚乙二醇等)或天然高分子(例如，淀粉等)，進而混煉后，進行圓盤造粒機(disc pelletizer)等擠出成形造粒,將成形物通過球形整粒機成形為球狀后，干燥可制得非粉塵化顆粒。I種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特殊限定，但相對于本發明的纖維素酶配制物總體，優選為0. 1-50重量％，更優選0. 1-30重量％，尤其優選1-10重量％。此外，通過以聚合物對顆粒表面包衣，也可控制氧通透和水分通透。另一方面，作為纖維素酶配制物的一種，液體制劑(優選，穩定化的液狀)，可通過在包含本發明的蛋白質的溶液中，配合內切葡聚糖酶穩定化劑(例如，合成高分子，天然高分子等)，根據需要，添加無機鹽類以及/或合成防腐劑，進行配制。此時，也可配合I種或多種非離子表面活性劑。I種或多種非離子表面活性劑的添加量沒有特殊限定，但相對于本發明的纖維素酶配合物總體，優選為0. 1-50重量％，更優選為0. 1-30重量％，尤其優選為1-10重量％。進而，本發明提供包含本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物的洗滌組合物。本發明的洗滌組合物也含有表面活性劑(可以是陰離子性、非離子性、陽離子性、兩性或雙性離子性或它們的混合物)此外，本發明的洗滌組合物，可含有本領域已知的其它洗滌成分，例如，增效組分、漂白劑、漂白活性劑、防腐劑、金屬離子封閉劑、除污聚合物、香料、其它酶(例如，蛋白酶、脂酶、淀粉酶)、酶穩定劑、制劑化助劑、熒光增白劑、以及/或發泡促進劑等。代表性的陰離子性表面活性劑有，直鏈狀烷基苯基磺酸鹽(LAS)、烷基硫酸鹽(AS)、a-烯基磺酸鹽(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽(AES)、a-磺基脂肪酸酯鹽(a-SFMe)、以及天然脂肪酸的堿金屬鹽等。作為非離子表面活性劑的例子，可以舉出，聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙氧基化合物、蔗糖以及葡萄糖的脂肪酸酯、烷基糖苷、聚乙氧基化烷基糖苷的酯等。本發明的含有纖維素的纖維的處理方法，通過使本發明的蛋白質、本發明的纖維素酶配制物或本發明的洗滌組合物與含有纖維素的纖維接觸來進行。由本發明的纖維處理方法改善的含有纖維素的纖維的性質，包含以下(I)絨毛被除去(起毛速度降低、起毛減少)(2)減量而帶來的纖維肌膚觸感和外觀的改善(3)染色的含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化(4)染色的含有纖維素的纖維的色彩產生局部變化，即，使染色的含有纖維素的纖 維，更具代表性地，使斜紋布具有石磨樣外觀和風格。(5)柔軟化(開始出現硬化的速度降低、硬化減少)本發明的纖維處理方法，具體而言，可通過將浸泡有纖維或纖維能夠被浸泡的水中，添加本發明的蛋白質、本發明的纖維素酶配制物或本發明的洗滌組合物來進行，例如，可通過纖維浸泡步驟、洗滌步驟或洗涮步驟進行。接觸溫度或本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物的添加量等條件，可參考其它各種條件適當確定，例如，在降低含有纖維素的纖維的起毛速度或減少含有纖維素的纖維的起毛時，優選使用溫度在10-60°C左右，蛋白質濃度為0. 01-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。在用于改善纖維肌膚觸感和外觀的減量加工時，優選使用溫度在10-60°C左右，蛋白質濃度為0. l-50mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。此外，在用于提供染色后的含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化作用時，優選使用溫度在10-60°C左右，蛋白質濃度為0. l-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。此外，在用于提供染色后的含有纖維素的纖維的色彩局部變化的時候，優選使用溫度在20-60°C左右，蛋白質濃度為0. l-100mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。此外，上述方法，在用于降低含有纖維素的纖維硬化開始出現的速度或減少含有纖維素的纖維的硬化時，優選使用溫度在10_60°C左右，蛋白質濃度為0. 01-20mg/L的本發明的蛋白質、纖維素酶配制物、或洗滌組合物。進而，本發明關于舊紙脫墨的方法，其特征在于，在由脫墨化學品處理舊紙來脫墨的步驟中，使用本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物。本發明的蛋白質或纖維素酶配制物，由于當作用于舊紙時，可提高脫墨效率，因而，在從舊紙制造再生紙的過程中是有用的。根據上述脫墨方法，因殘留有墨的纖維大量減少，可提高舊紙的白色度。上述脫墨化學品，只要是舊紙脫墨中常使用的化學品就可以，其它沒有特殊限定，例如可以舉出，氫氧化鈉、碳酸鈉等堿，硅酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽、陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或油酸等捕獲劑等，作為助劑，可以舉出，PH穩定劑、絡合劑或分散劑等。
可適用于上述脫墨方法的舊紙，只有是通常被稱為舊紙的紙就可以，其它沒有特殊限定，例如可以舉出，配合有機械漿和化學漿的新聞舊紙、雜志舊紙、低等-中等印刷舊紙、由化學漿構成的上等舊紙、它們的涂工紙等印刷舊紙。進而，也可以是通常被稱為舊紙的紙以外的紙，只要是帶有墨的紙，上述脫墨方法就可適用。進而，本發明關于紙漿的透水性的改善方法，上述方法包含以本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。根據上述方法，在沒有伴隨出現強度顯著降低的情況下，紙漿的透水性顯著得到改善。可適用上述方法的紙漿沒有特殊限定，例如可舉出，舊紙漿、再循環板紙漿、工藝紙漿(craft pulp)、亞硫酸紙衆、加工熱處理的其它高收率衆等。進而，本發明關于改善動物飼料消化能力的方法，包含以本發明的蛋白質或本發明的纖維素酶配制物處理動物飼料的步驟。根據上述方法，因動物飼料中的葡聚糖被適度低分子化，可改善動物飼料的消化 能力。進而,通過在動物飼料中使用本發明的蛋白質,可改善飼料中的葡聚糖的消化能力。因而，根據本發明，提供改善動物飼料消化能力的方法，其包含以本發明的蛋白質或纖維素酶配制物處理動物飼料的步驟。微生物的保藏本發明的內切葡聚糖酶STCE 來源的 Staphylotrichum coccosporumIFO 31817株，于1985年保藏于日本國內的財團法人發酵研究所，國內保藏號是IFO 31817。此外，于2004年(平成16年)9月28日國際保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(地址〒305-8566日本國茨城縣筑波東I 丁目I番地I中央第6)，國際保藏號為FERM BP-10135。進而，IFO 31817株現在保藏于獨立行政法人配制品評價技術基礎機構生物技術總部(〒292-0818千葉縣木更津市如f芒鐮足2-5-8如f芒學術園內)，保藏號為NBRC 31817。該菌株向第三者公開，處于可獲得的狀態的情況，依據與本說明書同時提交的證明文件平成15年(2003年)11月19日付是清楚的。以在質粒pUC118的BamHI部位插入STCEl基因得到的質粒pUC118_STCEex轉化得到的本發明的大腸菌(Esherichia coli)DH5 a/pUCl 18-STCEex株，于2003年(平成15年)12月I日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自2004年(平成16年)9月15日轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-101FERM P-19602。可作為本發明的表達載體的宿主的Humicola insolens麗200-1株，于1996年(平成8年)7月15日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)6月13日起轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-59FERMP-I5736。可作為本發明的表達載體的宿主的Humicola viride MC300-1株,于1996年(平成8年)9月9日國內保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)8月11日起轉為國際保藏。國際保藏號(國際保藏號緊接的內是國內保藏號)是FERM BP-60FERM P-15842]0實施例
以下，采用實施例更為具體地說明本發明，但本發明并不局限于這些實施例。《實施例I:從Staphylotrichum coccosporum分離純化具有脫脂棉纖維游離活性的成分》將Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 菌株在(T)培養基(2. 0%微晶纖維素、2. 0%酵母提取物、2. 0%玉米漿、I. 0%葡萄糖、0. 2%磷酸二氫鉀)中，28°C振蕩培養。培養10天后，去除菌體后，得到粗制纖維素酶配制液。將該粗制纖維素酶配制液配制成最終濃度為I. 5mol/L的硫酸銨溶液后，將其上樣于事先以I. 5mol/L硫酸銨液平衡的HiTrap PhenylHP柱(Amersham生物科學社生產)，在去離子水中，以濃度分別為 I. 5mol/L、0. 9mol/L、0. 75mol/L、0. 6mol/L、0. 15mol/L、0mol/L的硫酸銨溶液梯度洗脫，分離。其中，當硫酸銨濃度為0. 75mol/L和Omol/L時，發現洗脫的部分中脫脂棉纖維游離活性強。接著，以Ultrafree/Biomax_5K(Milipore公司生產)將硫酸銨Omol/L洗脫部分 脫鹽后，調整使其成為50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)，再上樣于事先以50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科學社生產)。接著，相對于lmol/L氯化鈉的從50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)到的50mmol/L醋酸緩沖液(pH5. 0)線性梯度洗脫法洗脫，分離。其結果是，當氯化鈉濃度約為0. 05mol/L時，發現得到的部分中的脫脂棉纖維游離活性強。將該部分作為STCEl分離。此外，硫酸銨0. 75mol/L的洗脫部分，也同樣，使用Ultrafree/Biomax-5K (MiIipore公司生產)脫鹽后，將其調整成為50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)，再上樣于事先以50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科學社生產)。接著，相對于lmol/L氯化鈉的從50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)到的50mmol/L醋酸緩沖液(PH5.0)線性梯度洗脫法洗脫，分離。其結果是，當氯化鈉濃度約為0. 05mol/L時，發現得到的部分中的脫脂棉纖維游離活性強。將該部分作為STCE3分離。這些STCEl部分、STCE3部分，通過上述柱子數遍分離純化，獲得大量純化樣品。該STCEl部分和STCE3部分，在SDS-PAGE中分別顯示單一點，其平均分子量(MW)依次約為 49kD 和 45kD。SDS-PAGE，使用 Safety Cell Mini STC-808 電泳槽(TEFC0 公司生產)和預制膠10% -SDS-PAGEmini、膠厚I. 0mm(TEFC0公司生產)，依據產品使用說明書進行電泳和染色。分子量標記使用精確(Precision)蛋白標準(Bio-Rad Laboratories公司生產)。此外，STCEl部分和STCE3部分都具有CMC酶活性。脫脂棉纖維游離活性，采用依據Neena Din等的方法(Neena Din等人，“Biotechnology”，9 (1991)，p. 1096-1099)的方法進行。即，使用洗滌牢固度測試儀，以下述條件反應后，在600nm吸光度下測定從脫脂棉游離出的絨毛量。試驗儀器洗滌牢固度測試儀L_12(大榮科學精器制作所公司生產)溫度40°C時間120分鐘反應pH :pH7 (50mmol/L 磷酸緩沖液)處理液中，除洗脫液外，還適當添加不銹鋼珠和脫脂棉。《實施例2 Staphylotrichum coccosporum 來源的內切葡聚糖酶 STCEl 和 STCE3的部分氨基酸序列確定》
(I) STCEl和STCE3的N末端氨基酸序列的確定將實施例I得到的STCEl部分和STCE3部分上樣于SDS-PAGE后，電轉移于PVDF膜problot (Apraid生物系統公司生產)。接著，以CBS染色液(0. I %考馬斯亮蘭G250、30%甲醇、10%醋酸)染色后，脫色、干燥。從該膜分別切下分子量和STCEl部分和STCE3部分相當的約49kD和45kD的蛋白質(STCE1和STCE3)印跡的部分，以極少量甲醇潤濕，再以還原用緩沖液(8mol/L胍鹽酸鹽、0. 5mol/L tris、0. 3% EDTA-二鈉、5%乙腈)輕輕清洗該膜片，分別將膜片在微管中浸潰于IOOy L左右的還原用緩沖液。在其中添加二硫蘇糖醇lmg，封入氮氣后封閉，靜置I小時以上。再添加4-乙烯基吡啶(Aldrich公司生產)1.5 yL，避光，不停攪拌20分鐘以上，進行蛋白質的半胱氨酸殘基的吡啶乙基化。其后，以蒸餾水、2%乙腈水的順序，清洗STCE1、STCE3膜片，然后供于蛋白測序儀Procise491(Apraid生物系統公司生產)，分別確定N末端氨基酸序列的25個殘基。STCE1、STCE3的N末端25個殘基的氨基酸序列相同，得到的序列如下。STCEl和STCE3的N末端氨基酸序列
Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn (25 個殘基)(SEQ ID NO: I)(2) STCEl和STCE3內部氨基酸的確定將實施例I 得到的 STCEl 和 STCE3 以 Ultrafree/Biomax_5K (Milipore 公司生產)脫鹽，冷凍干燥。將冷凍干燥后的STCEl和STCE3約40 y g加入到I. 5mL容量的微管中，再加入500 u L還原用緩沖液，溶解。在其中添加二硫蘇糖醇I. 4mg，封入氮氣密閉，靜置5小時。再添加碘代乙酸2. 7mg，避光靜置30分鐘，進行蛋白質的半胱氨酸殘基的吡啶乙基化。其后，使用Ultrafree/Biomax-5K (Milipore公司生產)脫鹽濃縮。分別相對于約10 y g的該還原羧甲基化的STCEl和STCE3，添加約1/lOOmol量的賴氨酸內肽酶(和光純藥公司生產)，在50 ii L 50mmol/L tris緩沖液(pH9. 0)中，于37°C反應72小時。將該消化液供于173A Micro-blotter系統(Apraid生物系統公司生產)，STCE1、STCE3分別分離出7種肽，印跡到PVDF(poly(vinyllidene difluoride))膜。得到的肽片段的氨基酸序列通過上述蛋白測序儀確定。其結果是，STCEl內部氨基酸序列如下所示。LE-1 =Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 個殘基)(SEQ ID NO 4)LE-2 =Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 個殘基)(SEQ ID NO 5)LE-3 =Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 個殘基)(SEQ ID NO 6)LE-4 =Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys (10 個殘基)(SEQ ID NO 7)LE-5 =Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe (7 個殘基)(SEQ ID NO 8)LE-6 =Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr (7 個殘基)(SEQ ID NO 9)LE-7 :Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu (9 個殘基)(SEQ ID NO 10)由這些N末端氨基酸序列和肽圖譜得到的內部氨基酸序列的同源性檢索顯示，STCEl是屬于家族45的新的內切葡聚糖酶。另一方面，STCE3的內部氨基酸序列如下所示。LE-8 =Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 個殘基)(SEQ ID NO 11)LE-9 : Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 個殘基)(SEQ ID NO 12)
LE-IO Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 個殘基)(SEQ ID NO 13)LE-II Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg(16 個殘基)(SEQ ID NO 14)LE-12 Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-AIa-Val-Asn-Asp-Asn (22 個殘基)(SEQ ID NO :15)LE-13 Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys (11 個殘基)(序列 16)LE-14 Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn(16個殘基)(序列17) 由這些N末端氨基酸序列和肽圖譜得到的內部氨基酸序列的同源性檢索顯示，STCE也是屬于家族45的內切葡聚糖酶。然而，因STCEl和STCE3對應的內部氨基酸序列完全一致，暗示STCE3可能是由STCEl生成的部分分解物。《實施例3:純化內切葡聚糖酶STCEl除去含有纖維素的纖維的毛羽的活性評價》使用實施例I得到的粗制纖維素酶配制液和純化內切葡聚糖酶STCEl，如下評價對綿織布料的絨毛去除活性。將預先染色的藍色綿織布料與表面活性劑和膠球一起置于大型洗衣機中，使其產生毛羽。其后，通過在下述條件下進行該已起毛的藍色綿織布料的毛羽去除處理，計算當起的毛經目視評價大約有50%被除去所需的粗制纖維素酶配制液，和純化內切葡聚糖酶STCEl的蛋白質濃度。試驗儀器洗滌牢固度測試儀L-12 (大榮科學精器制作所公司生產)溫度40°C時間60分鐘反應pH pH6 (5mmol/L磷酸緩沖液)處理液中，除內切葡聚糖酶液外，還適當添加膠球。蛋白質濃度的定量是使用蛋白質分析試劑盒)(Bio-Rad Laboratory公司生產),以牛血清白蛋白為標準進行定量的。該結果示于表I。[表 I]
權利要求
1.選自下述的蛋白質 (a)包含SEQID NO. 3表示的氨基酸序列并且具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質， (b)由在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中I個或多個氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列組成，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質， (c)由在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸所得的氨基酸序列組成，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質， (d)由與含有SEQID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質至少85%同源的氨基酸序列組成，并且具有內切葡聚糖酶活性的同源蛋白質， (e)包含在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中I個或多個氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質。
(f)包含在SEQID NO. 3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的改變的蛋白質，以及 (g)包含與含有SEQID NO. 3表示的氨基酸序列的蛋白質至少85%同源的氨基酸序列，并且具有內切葡聚糖酶活性的同源蛋白質。
2.編碼權利要求I的蛋白質的多核苷酸。
3.選自下述的多核苷酸 (i)包含SEQID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列并且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸， (ii)由在SEQID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列缺失、取代、插入或添加I個或多個堿基而得的堿基序列組成，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸， (iii)包含在SEQID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列缺失、取代、插入或添加I個或多個堿基而得的堿基序列，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸，以及 (iv)與由SEQID NO. 2所示的堿基序列中的第64-第948位堿基的序列組成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交，并編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的多核苷酸。
4.包含權利要求2或3中記載的多核苷酸的表達載體。
5.權利要求4中記載的表達載體轉化的宿主細胞。
6.權利要求5中記載的宿主細胞，其中所述的宿主是酵母或絲狀菌。
7.如權利要求6所記載的宿主細胞,其中,所述酵母為釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物。
8.如權利要求7所記載的宿主細胞，其中，絲狀菌為腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、圓孢霉屬、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢霉屬(Fusarium)或頂孢霉屬(Acremonium)的微生物。
9.如權利要求8所記載的宿主細胞,其中，絲狀菌為Humicolainsolens或綠色木霉(Trichoderma viride)。
10.蛋白質的制造方法，其包含培養權利要求5的宿主細胞的步驟，以及從前述培養所得的宿主細胞或其培養物收集權利要求I的蛋白質的步驟。
11.以權利要求10中記載的方法生產的蛋白質。
12.纖維素酶配制物，其包含權利要求I的蛋白質。
13.洗滌組合物，其包含權利要求I的蛋白質、或權利要求12中記載的纖維素酶配制物。
14.含有纖維素的纖維的處理方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
15.降低含有纖維素的纖維起毛速度或者減少含有纖維素的纖維的起毛的方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
16.為改善含有纖維素的纖維的肌膚觸感和外觀的減量加工方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
17.使染色后的含有纖維素的纖維的色澤澄澈化的方法，其包含使染色后的含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
18.使染色后的含有纖維素的纖維的色澤具有局部性變化的方法，其包括使染色后的含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
19.降低含有纖維素的纖維開始變硬的速度或減少含有纖維素的纖維的硬度的方法，其包含使含有纖維素的纖維和權利要求I的蛋白質、權利要求12中記載的纖維素酶配制物、或權利要求13中記載的洗滌組合物接觸的步驟。
20.權利要求14的方法，其中所述的纖維處理是通過將纖維浸潰、清滌或洗涮進行的。
21.舊紙脫墨的方法，其特征在于，在通過舊紙脫墨化學品處理來脫墨的步驟中使用權利要求I的蛋白質、或權利要求12中記載的纖維素酶配制物。
22.改善紙漿的濾水性的方法，其包含以權利要求I的蛋白質、或權利要求12中記載的纖維素酶配制物處理紙漿的步驟。
23.改善動物飼料的消化能力的方法，其包含以權利要求I的蛋白質、或權利要求12中記載的纖維素酶配制物處理含有纖維素的纖維的步驟。
全文摘要
公開Staphylotrichum coccosporum來源的新的內切葡聚糖酶、編碼上述內切葡聚糖酶的多核苷酸、以及含有上述內切葡聚糖酶的纖維素酶配制物。上述內切葡聚糖酶或纖維素酶配制物可用于含有纖維素的纖維的色彩的澄澈化、起毛的減少、肌膚觸感和外觀的改善、色彩的局部性變化、以降低硬化等為目的的洗滌用，以及纖維加工用途。
文檔編號D21H25/18GK102766614SQ201210035
公開日2012年11月7日 申請日期2004年10月22日 優先權日2003年12月3日
發明者中根公隆, 五味修一, 古賀仁一郎, 河野敏明, 洼田英俊, 花村聰, 西村智子, 馬場裕子 申請人:明治制果藥業株式會社