活性提高的內切葡聚糖酶變體及其用圖
【專利摘要】本發明涉及參與木質纖維素生物質分解的酶的表達和優化。更具體地，本發明涉及里氏木霉內切葡聚酶II的變體，和性能提高的所述變體在分解纖維素和生產生物燃料的方法中的用途。
【專利說明】
活性提高的內切葡聚糖酶變體及其用途
技術領域
[0001] 由于大量原料的可利用性W及乙醇作為燃料的價值，由纖維素生產乙醇的可能性 已經得到密切關注。用于此類工藝的基于纖維素的天然原料稱為"生物質"。已經考慮將許 多類型的生物質，例如木材、農業殘余物、草本作物和城市固體廢物，作為生產生物燃料的 潛在原料。運些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。
【背景技術】
[0002] 纖維素是由0-1，4鍵連接的葡萄糖分子組成的聚合物，其對降解或解聚合非常有 抗性。一旦纖維素被轉化為葡萄糖，后者容易用酵母發酵成生物燃料，如乙醇。
[0003] 研究的用于將纖維素轉化為葡萄糖的最古老的方法基于酸水解。該方法可W在濃 酸或稀酸存在下進行。然而，一些缺點（例如當使用濃酸時酸回收很差，W及使用稀酸情況 下葡萄糖產量低)對酸水解工藝的經濟性是不利的。
[0004] 為了克服酸式水解工藝的缺點，最近的纖維素轉化工藝已經更多地與酶促水解 (使用纖維素酶類型的酶)相關。然而，運種酶促水解木質纖維素生物質（例如纖維素）的缺 點是其工業工藝較為昂貴。因此，有必要使用日益有效的分泌纖維素酶的微生物菌株。在運 方面，很多微生物包含水解纖維素的酶，例如真菌木霉（Tri Choderma)、曲霉 (Aspergillus)、腐質霉（Humi cola)或鑲刀菌（Fusarium) W及細菌高溫單抱菌屬 (Thermomonospora)、芽抱桿菌（Baci 1 Ius )、纖維單胞菌（Cel Iulomonas )和鏈霉菌 (Str邱tomyces)。運些微生物分泌的酶具有用于將纖維素轉化為葡萄糖的S種類型的活 性，且分為=組:隨機攻擊纖維素纖維內部的內切葡聚酶，攻擊纖維末端并釋放纖維二糖的 外切葡聚酶，和將運種纖維二糖水解為葡萄糖的e-葡萄糖巧酶。其他類型的酶，例如半纖維 素酶或最近發現的多糖單加氧酶類也可W在水解效率中起作用。
[0005] 降低酶促水解的成本具有強大的產業利益，運種降低設及使用減少量的酶W及更 有效的酶的混合物（cocktail)。因此，一些專利申請描述能力高于里氏木霉(Trichoderma reesei)的天然酶或通過基因工程改進的變體。可W提及與外切葡聚酶有關的專利申請 US2010304464、W0 2010/066411 和WO 2013/029176,與內切葡聚酶有關的申請WO 2007/ 10944UW0 2012/149 192和WO 2010/076388,與0-葡萄糖巧酶有關的申請WO 2010/ 029259、W0 2010/135836或WO 2010/022518,或與多糖單加氧酶有關的其他申請 W012135659和W012149344。
[0006] 主要基于結構標準，水解木質纖維素生物質的酶在CAZy系統（Cantarel，B丄.， Coutinho,P.M.,Rancurel,C.,Bernard,!.,Lombard,V.,feHenrissat,B.(2009).The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.Nucleic acids research,37,0233-8)中分類。內切葡聚酶屬于細 5、6、7、 8、9、12、16、18、19、26、44，、45、48、51、74 和 124 家族。
[0007] 為了使木質纖維素生物質的水解有效且經濟適用，酶混合物必須包含比例平衡的 具有各種酶活性的酶(尤其是，但不排除其他，外切葡聚酶、內切葡聚酶、木聚糖酶和e-葡萄 糖巧酶類）。例如，一般注意到在里氏木霉的天然混合物中存在60-70%的外切葡聚酶、15-20%的內切葡聚酶、少量百分比的半纖維素酶和約5-10%的0-葡萄糖巧酶。該混合物適于 水解大多數預處理的底物(例如在酸性條件下汽爆的小麥賴桿)且產量可接受。簡言之，內 切葡聚酶活性的增加必須不會損害其他酶的活性。運些酶的功能特異性目前仍知之甚少。 里氏木霉基因組包含至少3種主要的酶，其來自家族7化Gl，cel7b)、5化G2，cel5a)和12 化G3，cell2a)"EGl和EG2酶是主要的內切葡聚酶，按重量計可W占里氏木霉產生的全部酶 混合物的10-20 %。
[000引內切葡聚酶化C3.2.1.4)是作用于纖維素的第一個酶，已知其在水解中具有重要 作用:增加外切葡聚酶可W攻擊的位點數，同時降低被攻擊的微纖維的聚合度。最近的研究 (Szijarto,N.,Siika-aho,M.,Sontag-Strohm,T.,feViikari,L.(2011).Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes .Bioresource technology, 102(2), 1968-74)強調它們在水解第一 個小時期間降低生物質粘性的作用。運種粘性的降低對工藝的操作成本具有非常顯著的影 響。
[0009] 粘性問題在需要低溫資源的工藝的情況下加劇，例如同時糖化和發酵(SSF)，其設 及水解生物質的酶和將糖單體轉化為乙醇的微生物兩者。
[0010] 水解和發酵可W根據各種方案進行。最常見的由獨立的水解和發酵(SHF)組成。運 種方法可W通過維持最佳反應條件來優化各步驟。發酵在約28°C至約3(TC的溫度即時進 行，而水解一般在至少45°C的溫度進行。然而，在甜F中，在反應結束時釋放的糖的濃度非常 高，導致對酶的抑制，降低該方法的效率。為了避免運些缺點，可W預期另一種方法。在SSF 中，兩個步驟(己糖的水解和發酵)同時進行，防止糖積累至抑制酶的濃度。投資成本也因為 使用單個反應器而降低。由于沒有抑制，之后的水解程度更高，因為釋放的糖被立即用于發 酵成乙醇。在該方法中，反應器溫度必定構成水解和發酵的最佳溫度之間的平衡，通常在約 30°C至約35°C之間。然而，纖維素酶的活性在該溫度降低約30%。
[0011] SSF還允許在發酵糖的生物中分解纖維素的酶的表達，從而可W將資源限制，或在 極端情況下消除至單獨步驟中產生的酶。然而，用發酵生物生產大量酶從而獲得高活性證 明是有問題的，限制了運些方法的可行性。
[001^ 因此，獲得在水解和發酵的最佳溫度(例如，在30°C-5(rC之間）下保持有效的內切 葡聚酶活性同時保持混合物中所有酶的比例的酶對于將木質纖維素生物質轉化為生物燃 料的工藝而言將具有顯著收益。

【發明內容】

[0013] 發明人已經開發了尤其與序列SEQ ID N0:2的野生型EGl蛋白的內切葡聚酶活性 相比，內切葡聚酶活性提高的多膚。EGl對應于里氏木霉內切葡聚酶1。
[0014] 從運個角度，
【申請人】很大的功勞在于經過大量研究之后，發現了與EGl參考蛋白 (SEQ ID N0:2)的內切葡聚酶活性相比，內切葡聚酶活性提高的分離或純化多膚。
[0015] 因此，本發明設及選自W下的多膚：
[0016] 1)選自569 10顯：4、沈9 10側：6、569 10顯：8、沈9 10側：10、沈9 10側：12、 沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:16、沈Q ID NO:18、沈Q ID NO:20、沈Q ID NO:22、沈Q ID NO:24 和SEQ ID NO :26的氨基酸序列；
[0017] ii)與序列沈Q ID N0:4、SEQ ID N0:6、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 12、沈Q ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID N0:24或沈Q ID N0:26具有至少70%，優選75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一 性百分比的氨基酸序列。
[0018] 優選地，上述多膚的特征在于，其在發酵生物中的表達至少等于EGl參考蛋白（SEQ ID NO:2)的表達。
[0019] 根據本發明，給定序列相對于沈Q ID ^:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26 的同一性百分比對應于該給定序列和沈Q ID側:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26之 間相同的殘基數除W沈Q ID ^:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的殘基數。當使用 Genome如est數據庫時，所述相對于沈Q ID側:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的同 一性百分比對應于Que巧同一性百分比（％id如ery)，其中如e巧對應于序列SEQ ID N0:4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26。
[0020] 例如，本領域技術人員將能夠使用底物簇甲基纖維素(CMC)或使用顯色底物(對硝 基苯基巧)來確定酶活性的增加或換言之提高。酶活性將通過還原糖或釋放的硝基苯酪的 比色分析分別掲示。
[0021] 優選地，相對于氨基酸序列SEQ ID N0:2的EGl蛋白的內切葡聚酶活性，本發明的 多膚的酶活性提高至少10%，優選至少20%，優選至少30%。
[0022] 本領域技術人員可W用來確定根據本發明的多膚的酶活性相對于EGl參考蛋白 (SEQ ID N0:2)是否提高的方案的實例如下：
[0023] -于37°C過夜形成表達根據本發明的多膚的大腸桿菌化.COli)的原種培養物；
[0024] -于37 °C用1 %原種培養物接種LB培養基直至獲得最佳密度0.4;
[0025] -于20°C培養所述細胞1她；
[0026] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0027] -用含有Img/ml溶菌酶的抑5的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液重懸細胞沉淀(最終ODsoo為 100);
[002引-在冰上解育重懸細胞30分鐘；
[0029] -通過3個循環的冷凍/融化裂解細胞；
[0030] -通過超聲法使DNA片段化；
[0031] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[0032] -于35。(：和5(TC用IOOiil含有1%CMC的抑5的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液解育IOOiil分解 上清液化；
[0033] -移除10化1反應；
[0034] -加入 1〇化1 DNS 試劑(Miller ,1959);
[0035] -于10(TC解育5分鐘；
[0036] -在冰上解育3分鐘；
[0037] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[0038] -在540nm讀取15化1上清液的光密度。
[0039] 本發明的主題還是編碼至少一個上述多膚的純化或分離的核酸。下表1包含里氏 木霉EGI ("野生型"）、推測的球毛殼菌（Chae^mium shbosum) (C)和煙曲霉 (Aspergillus fumisatus)(A)內切葡聚酶的核酸和膚序列W及本發明的多膚和核巧酸 的鑒定。
[0040] 優選地，所述純化或分離的核酸可W選自W下序列：SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、 WQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11、WQIDN0:13、SEQIDN0:15、WQIDN0:17、 沈Q ID NO: 19、沈Q ID NO:21、沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:25。
[0041] 表1 r00421 12345 本發明還被及包含上述核酸的載體。
2 根據本發明，術語"載體"意欲是指在其中有可能插入外源核酸片段的任何DNA序 列，載體能夠將外源DNA引入宿主細胞。作為載體，非窮舉地可W提及:質粒、黏性質粒、酵母 人造染色體(YAC)、細菌人造染色體(BAC)、P1隧菌體衍生的人造染色體(PAC)或病毒衍生的 載體。 3 根據本發明，上述核酸可W與啟動子、終止子或其在宿主細胞中表達所需的任何 其他序列功能性連接。 4 根據本發明的載體還可W攜帶選擇標記。術語"選擇標記"意欲是指其表達使包含 它的細胞具有能夠選擇它們的特征。例如，它是耐抗生素的基因。 5 本發明的主題還是包含至少一種上述多膚、或至少一種上述核酸或至少一種上述 載體的分離的宿主細胞。
[004引本領域技術人員將能夠通過熟知的常規方法將上述的多膚之一、核酸之一或載體 之一引入宿主細胞。例如，可W提及用氯化巧處理、電穿孔或使用基因槍。
[0049]根據一個實施方案，本領域技術人員將能夠通過常規方法將編碼內切葡聚酶活性 提高的根據本發明的多膚的幾個拷貝的核酸引入宿主細胞。
[0050]根據一個實施方案，上述分離的宿主細胞選自木霉、曲霉、鏈抱霉(Neurospora)、 腐質霉、毀絲霉(Myceliophthora)、金抱霉(Qiiysosporium)、青霉(Penicilli皿）、鑲刀菌、 高溫單抱菌、芽抱桿菌、假單胞菌（Pseudomonas)、埃希氏菌（Escherichia)、梭菌 (Clostridium)、纖維單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母（Yarrowia)、畢赤醇母（Pichia)和酵母 (Saccharomyces)〇
[0051] 根據一個實施方案，上述分離的宿主細胞選自里氏木霉、綠色木霉(Trichoderma viridae)、康氏木霉（Trichoderma koningii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、文氏曲霉（Aspergi 1 Ius wentii )、米曲霉（Aspergi 1 Ius oryzae)、海要曲霉（Aspergillus phoenicis)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermopila)、Chrysosporium Iucknowense、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、灰腐質霉 (Humicola grisae)、嗜松青霉（PeniciIlium pinophiIum)、草酉《青霉（PeniciIlium oxalicum)、大腸桿菌（Escherichia coli)、丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、糖解梭菌（Clostridium saccharoIyticum)、拜氏梭菌（Clostridium benjerinckii)、下酸梭菌（Clostridium butylicum)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、解脂 耶氏酵母(化rrowia Iipolityca)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0052] 根據一個優選的實施方案，上述分離的宿主細胞選自里氏木霉和釀酒酵母。
[0053] 本發明的主題還是上述任何一種多膚用于水解纖維素的用途。
[0054] 本發明的主題還是上述任何一種多膚用于生產生物燃料的用途。
[0055] 根據本發明，術語"生物燃料"可W定義為來自生物質的轉化且可用于能源目的的 任何產物。并且，不希望被限制且通過舉例的方式可W提到的，可W納入燃料的產物-生物 氣(任選地在隨后的轉化之后)或其本身可W作為燃料，例如醇(根據使用的發酵生物的類 型，乙醇、下醇和/或異丙醇）、溶劑(丙酬）、酸(下酸）、脂質及其衍生物(短鏈或長鏈脂肪酸、 脂肪酸醋)和氨氣。
[0056] 優選的，根據本發明的生物燃料是醇，例如乙醇、下醇和/或異丙醇。更優選的，根 據本發明的生物燃料是乙醇。
[0057] 在另外一個實施方案中，生物燃料是生物氣。
[0058] 在另外一個實施方案中，產物是在化學工業中感興趣的分子，例如另一種醇(如1， 2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-下二醇、2,3-下二醇）、有機酸(如乙酸、丙酸、丙締酸、下酸、班 巧酸、蘋果酸、富馬酸、巧樣酸、或衣康酸），或徑基酸(如乙醇酸、徑基丙酸或乳酸）。
[0059] W下描述用于水解木質纖維素的酶混合物的生產的實施方案。將能夠表達根據本 發明多膚的絲狀真菌菌株，優選木霉，更優選里氏木霉，在選擇用于微生物生長的碳基底物 (如乳糖或葡萄糖）的存在下在發酵罐中培養。在一個實施方案中，將該碳基底物根據其性 質在滅菌前引入發酵罐或單獨滅菌后再引入滅菌后的發酵罐W獲得20-35g^的初始濃度。
[0060] 然后加入選擇用于生產酶的含有底物的水性溶液。最后通過過濾培養基回收真菌 產生的作用于木質纖維素生物質的酶組合物。在該組合物中，尤其有e-葡萄糖巧酶、外切葡 聚糖酶和根據本發明的內切葡聚糖酶。在一個實施方案中，該選擇用于生產酶的含有底物 的水性溶液W 200-250g/1的濃度制備。該溶液還優選包含誘導底物例如乳糖。在初始的碳 基底物耗盡后加入該水性溶液W提供35-45mg/g的最佳細胞量（"補料分批"）。在該"補料分 批"階段，培養基中糖的殘留濃度少于lg/1，且作用于木質纖維素生物質的酶由真菌分泌。 后者可W通過過濾培養基回收。
[0061] 本發明的主題是能夠作用于木質纖維素生物質的酶組合物，所述酶組合物由絲狀 真菌產生，且包含至少一種相對于EGl參考蛋白的內切葡聚酶活性，其內切葡聚酶活性提高 的多膚。術語"絲狀真菌"意欲尤其是指木霉，更優選里氏木霉。
[0062] 最后，本發明的主題是從生物質生產生物燃料的方法，包含W下連續步驟：
[0063] -將待水解的生物質懸浮于水相；
[0064] -如上所述在酶組合物存在下水解木質纖維素生物質W產生含有葡萄糖的水解 物；
[0065] -發酵水解物中的葡萄糖W產生發酵液；
[0066] -從發酵液中分離生物燃料。
[0067] 在一個實施方案中，將待水解的生物質W6%-40%的固體，優選20%-30%的比例 懸浮于水相。調節抑至4-5.5，優選4.8-5.2，并且調節溫度至40-60°C，優選45-50°C。通過加 入作用于木質纖維素生物質的酶組合物啟動水解反應，通常用量是每克預處理的底物10-SOmg分泌的蛋白或更少。反應一般持續15-48小時。通過分析釋放的糖，尤其是葡萄糖監測 反應。通過過濾或離屯、從非水解固體級分中分離主要由木質素組成的糖溶液，隨后在發酵 單元中處理。
[0068] 發酵步驟后，例如通過蒸饋從發酵液中分離生物燃料。
[0069] 本發明的另一個主題是從生物質生產生物燃料的方法，其特征在于它包含W下連 續步驟：
[0070] -將待水解的生物質懸浮于水相；
[0071] -同時添加上述酶組合物和發酵生物W產生發酵液；
[0072] -從發酵液中分離生物燃料。
[0073] 優選地，同時添加酶組合物和發酵生物，然后在30°C-35°C的溫度解育W產生發酵 液。
[0074] 根據運個實施方案，根據本領域技術人員已知的SSF(同時糖化和發酵)方法，將生 物質中存在的纖維素轉化為葡萄糖，同時在同一反應器中，發酵微生物(例如酵母)將葡萄 糖轉化為最終產物。取決于發酵生物的代謝和水解能力，正確進行該操作可能需要添加或 多或少量的外源分解纖維素的混合物。
[0075] 在另一個實施方案中，發酵生物通過分泌或在其細胞表面產生作為本發明主題的 多膚，任選地與作用于木質纖維素生物質的其他酶一起，從而限制或消除對由絲狀真菌產 生的酶的需求。優選地，發酵生物是上述宿主細胞。
[0076] 因此，優選地，本發明的主題是從生物質生產生物燃料的方法，包含W下連續步 驟：
[0077] -將待水解的生物質懸浮于水相；
[0078] -添加一種或多種上述宿主細胞W及上述發酵生物和/或酶組合物W產生發酵液；
[0079] -從發酵液中分離生物燃料。
[0080] 優選地，添加宿主細胞W及酶組合物和/或發酵生物，然后在30°C-35 °C的溫度解 育W產生發酵液。
[0081] 因此，使用根據本發明的內切葡聚酶活性提高的多膚具有獲得更好葡萄糖生產產 量、同時使用比之前更少的酶的優勢，運具有經濟優勢。
[0082] 本發明的其他方面、主題、優勢和特征將通過閱讀W實施例和圖的方式給出的W 下描述本發明優選實施方案的非限制性描述展示。
【附圖說明】
[0083] 圖1是表示分別由菌株Sca-EGl和154E4分泌到培養基的參考內切葡聚酶化Gl)及 其突變體(154E4)水解1%CMC的圖。
[0084] 圖2是表示^下混合物的甜。結果的圖：衍生自菌株15464/8(569 10^:10)的混 合物、由添加有e-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGU A EGl)產生的參考混合物、W及由添加有 e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉化的化847 A EGl ( A EGIcEGI )產生的另一種參 考混合物。
[0085] 圖3是表示W下混合物的SHF結果的圖：衍生自菌株11G8/10(SEQ ID N0:22)的混 合物、由補充有e-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EG1( A EG1)產生的參考混合物、W及由補充有 e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉化的化847 A EGl ( A EGIcEGI )產生的另一種參 考混合物。
[0086] 圖4是表示W下混合物的SSF結果的圖：衍生自菌株154E4/2和154E4/8(SEQ ID NO: 10)的兩種混合物、由補充有(6-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGl ( A EGl)產生的參考混合 物、W及由補充有e-葡萄糖巧酶的菌株并用EGl參考基因再轉化的化847 A EGU A EGIcEGI ) 產生的另一種參考混合物。
[0087] 圖5是表示W下混合物的SSF結果的圖：衍生自菌株11G8/10、11G8/12和11G8/13 (SEQ ID NO:22)的巧巾混合物、衍生自菌株225C7/7(SEQ ID NO:26)的混合物、由補充有0-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGU AEGl)產生的參考混合物、W及由補充有0-葡萄糖巧酶的 菌株并用EGl參考基因再轉化的化847 A EGU A EGIcEGI )產生的另一種參考混合物。
【具體實施方式】
[008引實施例1:第一輪k洗牌
[0089] 將里氏木霉EGl參考基因 （SEQ ID NI0:1)用各自與參考基因 SEQ ID NO: 1具有約 60%同一性的推測的球毛殼菌內切葡聚酶(SEQ ID NO: 29)和煙曲霉內切葡聚酶（SEQ ID NO: 27)的基因根據EPl 104457B11中所述的方法進行第一輪k洗牌。
[0090] 1-高通量篩選
[0091] 開發高通量篩選試驗W選擇由レ洗牌產生的最佳克隆，例如，相對于參考酶SEQ ID NO:2其內切葡聚酶活性顯示至少20%提高的那些。
[0092] 高通量篩選試驗根據W下步驟進行：
[0093] -在瓊脂上分離表達根據本發明的重組酶的レ洗牌變體的大腸桿菌克隆，并將所 述克隆于37 °C在LB培養基中預培養過夜；
[0094] -用所述預培養接種6%的LB培養基，然后于37°C解育5小時，然后于20°C解育17小 時；
[00巧]-在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0096]-添加 SOiil P冊含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液溶液裂解細胞；
[0097] -在室溫下解育4小時；
[0098] -添加 SOiil P冊含有1%簇甲基纖維素的0.IM巧樣酸鹽緩沖液；
[0099] -于35°C解育17小時；
[0100] -在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0101] -移除IOOiil上清液；
[0102] -添加10化1 DNS試劑；
[0103] -于100°C解育10分鐘，然后在冰上解育5分鐘；
[0104] -在 540nm 讀取 12化1 的 0D。
[0105] 在運些高通量篩選條件下，在幾個克隆中發現其內切葡聚酶活性相對于EGl參考 酶（SEQ ID N0:2)提高（在540nm的OD增加），尤其包括克隆76B4、105F11、107H12、154E4、 202(：12、27249、278尸10、29382和309八11。
[0酒]2-測定內切葡聚酶活性的提高 [0…7] 2-1/在簇甲基纖維素(CMC)底物上
[0108] 為了評估在第一輪k洗牌中選擇的變體與參考酶(SEQ ID N0:2)相比的Kcat,進 行W下過程：
[0109] -于37°C過夜制備表達根據本發明的重組酶的大腸桿菌的原種培養液；
[0110] -于37 °C用1 %原種培養物接種LB培養基直至獲得600nm的光學密度為0.4;
[0111] -于20°C培養所述細胞1她；
[0112] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0113] -用pH5含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液重懸細胞沉淀（最終ODsoo為 100);
[0114] -在冰上解育重懸細胞30分鐘；
[0115] -通過3個循環的冷凍/融化裂解細胞；
[0116] -通過在能量5超聲3秒使DNA片段化；
[0117] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[011引-于35°C和50°C用10化1含有1%CMC的P冊的0.1M巧樣酸鹽緩沖液解育10化1分解 上清液6小時；
[0119] -移除10化1反應；
[0120] -添加10化1 DNS試劑；
[0121] -于100°C解育5分鐘；
[0122] -在冰上解育3分鐘；
[0123] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[0124] -在540nm讀取15化1的光密度。
[0125] 根據本發明，按照W下方式計算Kcat值：
[0126] -將540nm的OD表達為目標蛋白量（WnM表示)的函數；
[0127] -減去陰性對照的值；
[0128] -除W葡萄糖標準范圍的系數(用DNS掲示各種葡萄糖含量）；
[0129] -除W反應時間（360分鐘）。
[0130] 表2表示在CMC上的活性試驗的實驗條件下，克隆76B4、105F11、107H12、154E4、 202(：12、27249、278。10、29382和309411相對于661參考蛋白（569 10側:2)的1(。曰1值^及提 高倍數。
[0131] 表2:在CMC上的內切葡聚酶活性
[0132]
[i
[0134] 結果表明運些克隆的酶活性相對于參考酶SEQ ID N0:2顯著提高。
[0。引 2-2/在憐酸溶脹纖維素(PASC)底物上
[0136] 然后在第二種底物：憐酸溶脹纖維素（PASC)上確認克隆76B4、105F11、107H12、 15464、202(：12、27249、278尸10、29382和309411活性的提高。
[0137] 根據上述相同的方案進行該底物上的Kcat測定。用相同濃度的PASC底物替換CMC 底物。
[0138] 表3表示在PASC上的活性試驗的實驗條件下，克隆76B4、
[0139] 105。11、107刖2、15464、202(：12、27249、278。10、29382和309411相對于661參考蛋 白（SEQ ID NO:2)的Kcat值W及提高倍數。
[0140] 表3:在PASC上的內切葡聚酶活性
[0141]
[
[0143] 結果表明酶活性相對于EGl參考酶(SEQ ID N0:2)提高。
[0144] 實施例2:第二輪k洗牌
[0145] 在第一輪進化中獲得的改進基因105。11、15464、202(：12、27249、278。10和309八10 (分別為沈Q ID ^:5、9、11、13、15、19)隨后進行第二輪心洗牌(仍然根據6?110445781所述 的專利方法）。為了促進木霉序列骨架的重構，在第二輪心洗牌中將EGl參考基因 （SEQ ID N0:1)作為親本基因再次引入。
[014引 1-高通量篩選
[0147] 對該第二輪レ洗牌后所得的克隆進行如上所述的高通量篩選試驗W選擇最佳克 隆。活性試驗縮短到2小時（與篩選來自第一輪進化的克隆的17個小時相比）W將第一輪心 洗牌所得的提高考慮在內。
[0148] 將制備的克隆的活性與克隆154E4所得的活性相比。由第一輪洗牌產生的該克隆 能夠獲得活性的最大提高。
[0149] 在運些篩選條件下，在幾個克隆中發現其內切葡聚酶活性相對于154E4參考克隆 (沈Q ID ^:10)提高，尤其包括克隆1168和240化2。
[01加]2-測定內切葡聚酶活性的提高 [0巧1] 2-1/在簇甲基纖維素(CMC)底物上
[0152] 為了測定Kcat,用如上所述的活性試驗測量克隆11G8、92A12和240H12的活性。活 性試驗的持續時間縮短到用底物解育1小時W將運些克隆的提高考慮在內。
[0153] 表4表示在運些實驗條件下，克隆11G8、92A12和240H12相對于154E4克隆（SEQ ID NO: 10)的Kcat值W及提高倍數。
[0154] 表4:在CMC上的內切葡聚酶活性
[0155]
[
[0157] 結果表明，克隆11G8和240H12的活性相對于154E4參考克隆提高。
[015引 2-2/在憐酸溶脹纖維素(PASC)底物上
[0159] 然后在第二種底物:憐酸溶脹纖維素(PASC)上確認克隆11G8、92A12和240H12活性 的提局。
[0160] 為了測定Kcat,用PASC作為底物通過如上所述的活性試驗測量運些克隆在35和50 °C的活性。
[0161] 表5表示在運些實驗條件下，克隆11G8、92A12和240H12相對于154E4克隆（SEQ ID NO: 10)的Kcat值W及提高倍數。
[0162] 表5:在PASC上的內切葡聚酶活性
[0163]
[0164] 在該底物上，克隆11G8的活性在35°C相對于參考克隆154E4沒有提高。另一方面， 克隆11G8的活性在50°C提高。克隆240H12的活性在35 °C和50°C提高。
[01化]實施例3:在里氏木霉菌株化847 A EGl中克隆由第一輪心洗牌產生的內切葡聚酶1 變體
[0166] 通過PCR融合構建待插入里氏木霉的DNA片段，所述片段包含由第一輪心洗牌產生 的克隆154E4。該片段長度為約5.4kb，由腐草霉素耐藥基因和在Cbhl啟動子W及之后的 Cbhl終止子控制下的克隆154E4的編碼序列組成。W相同的方式，擴增里氏木霉EGl參考基 因 （SEQ ID N0:1)并將其融合至Cbhl啟動子和終止子之間，形成第二個構建體。
[0167] 用扣g的各構建體（即包含154E4基因或EGl基因的DNA片段)通過巧和陽G沖擊按照 本領域技術人員已知的常規方法轉化里氏木霉菌株化847 A EGl的原生質體。在含有30yg^ 腐草霉素的PDA/薦糖選擇培養基上選擇轉化體。將每次轉化的14個克隆繼代培養。在為獲 得分離的純克隆的=次繼代培養后，最終獲得7個整合天然基因的克隆和5個整合154E4變 體且分泌的蛋白水平與菌株化847相當的克隆。
[01側 1-在簇甲基纖維素(CMC)上用活性試驗篩選
[0169] 在含有W下培養基的24孔板中培養11個克隆：每升培養基中SOOiil 85%出P〇4、 4.2g(NH4)2S〇4、0.3g MgS〇4.7出0、1.5g玉米漿、Iml Oligo Ferment、11.6g馬來酸、IOg So化a-Floc和20g乳糖。將抑調節至5.8-6.0。于30°C培養5天后，移除上清液，將1〇111肖八蛋白 當量（用Lowry方法測量）用于CMC上的活性試驗。將15化1在抑4.8、50mM巧樣酸緩沖液中的 2 % CMC溶液與15化1含有lOmg/1蛋白的巧樣酸緩沖液混合。于50°C或35 °C解育反應10分鐘， 然后在沸水浴中失活。離屯、5分鐘后，移除20iU上清液W用3,5-二硝基水楊酸(DNS)分析還 原糖。通過在540nm讀取吸光度來監測DNS的還原和3-氨基-5-硝基水楊酸的形成，用葡萄糖 范圍定量還原糖。
[0170] 表6總結了與參考菌株化847、菌株化847 A EGl和用EGl參考基因再轉化的菌株 CL847 A EGl ( A EGIcEGI，用最佳的4個轉化體獲得平均值)相比，含有154E4變體的克隆的活 性。
[0171] 表6:在CMC上的內切葡聚酶活性
[0172]
[
1234 結果表明，154E4變體的活性比用EGl參考基因 （SEQ ID NO: 1)再轉化的克隆高 1.2-1.4倍。可在35 °C和50 °C觀察到提高。 2
[01巧]2-在里氏木霉菌株化847 A EGl中克隆第二輪k洗牌后所得的11G8變體并篩選轉 化體： 3 通過BamHl/趾Ol雙消化，將11G8變體克隆入含有腐草霉素耐藥基因作為標記的 PUT1040質粒的Cbhl啟動子和終止子之間。用扣g的該載體轉化里氏木霉菌株化847 AEGl。 在于154E4變體相同的條件下進行原生質體轉化。在轉化方法和目的是獲得純克隆的S次 連續繼代培養結束時，獲得蛋白產量與化847菌株相似的13個克隆，并通過測量CMCase活性 進行篩選。活性試驗與篩選來自第一輪心洗牌的含有154E4變體的克隆相同。表達11G8變體 的6個克隆顯示高于A EGlcEG菌株的CMCase活性。最佳的兩個轉化體的活性與表達EGl參考 基因 （SEQ ID NO: 1)的菌株相比增加70%。 4 表7總結了與化847參考菌株、化847 A EGl菌株和用EGl參考基因再轉化的化847 A EGl菌株（AEGlcEGl，用最佳的4個轉化體獲得平均值)相比，含有llG8變體的克隆的活性。
[017引表7:在CMC上的內切葡聚酶活性
[0179]
[0180] 結果表明，11G8變體的活性比用參考基因 SEQ ID NO: 1再轉化的克隆高1.1-1.7 倍。可在35 °C和50°C觀察到提高。
[0181] 實施例4: EGl參考內切葡聚酶W及154E4改進變體在釀酒酵母中的重組表達 [01劇 1-在胞外培養基中參考EGl和154E4蛋白的產生
[0183] 將里氏木霉的內切葡聚酶基因化Gl)和154E4變體的內切葡聚酶基因不存在其信 號膚的情況下克隆入祀SC-Leua A myc載體(CNRS-CERMAV)。該構建體允許在釀酒酵母菌株 EBYlOO的培養基中表達蛋白質，所述菌株是亮氨酸和色氨酸營養缺陷型（Boder ET和 Withup KD,Biotechnol Prog, 1998,14:55-62)。該質粒能夠將基因表達置于半乳糖誘導 的GALl啟動子的控制下，且具有允許轉化體選擇的營養缺陷型可選自標記基因化eu2)。
[0184] 根據本領域技術人員已知的常規方法(通過熱休克和乙酸裡轉化酵母)進行釀酒 酵母邸Y100的轉化。在0.67%YNB-2%Glc-0.01%T巧培養基上選擇轉化體。
[0185] 用每個基因的一個轉化體（Sca-EGl 和 Sca-154E4)接種15ml0.67%YNB-2%Glc-SD-O.Ol%T巧的基本培養基。SD是氨基酸的混合物(40mg/l硫酸腺嚷嶺、20mg/l心精氨酸、 lOOmg/1天冬氨酸、lOOmg/1心谷氨酸、20mg/l心組氨酸、30mg/l心賴氨酸、20mg/l心甲 硫氨酸、50mg/lレ苯丙氨酸、375mg/lレ絲氨酸、200mg/lレ蘇氨酸、30mg/l心酪氨酸、 ISOmg^心鄉氨酸和20mg^尿喀晚）。于30°C W22化pm振搖預培養24小時后，用兩個菌株Sc Q-EGl和Sca-154E4接種（00600 = 0.5) 150ml 0.67%YNB-2%Gal-SD-0.0 l %!'巧培養基。于 25°C W22化pm振搖解育該培養物。解育8小時后，向各培養物中添加6ml P冊.6的巧樣酸鋼 W將抑穩定在5。
[0186] 解育4天后，移除20ml培養物。于4°C在3000g離屯、5分鐘獲得培養物上清液。
[0187] 2-在對硝基苯基-0-乳糖巧上測定內切葡聚酶活性
[018引通過在W下條件下，在70化1體積中水解對硝基苯基-0-乳糖巧(pNPL)底物測量培 養物上清液的內切葡聚酶活性：
[0189] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0190] -2mM pNPL
[0191] -來自Sca-154E4菌株的60化I和90iil培養物上清液；
[0192] -將Sca-EGl菌株于35°C或50°C解育30分鐘。
[0193] 向10化1反應基質中添加10化1 IM碳酸鋼停止反應。通過測量415nm的吸光度并與 對硝基苯酪的標準范圍（0.36-360咖是線性)進行比較來測定由pN化水解釋放的對硝基苯 酪(pNP)的濃度。
[0194] 表8表示Sca-EG巧日Sca-154E4菌株的培養基在35°C和50°C在pNPL上的內切葡聚酶 活性結果（Wnmol .min-i .mL-i培養物表示EA)。
[01巧]表8:5。日-661和5。日-15464菌株的培養基在35°(：和50°(：在9肥1上的內切葡聚酶活 性
[0196]
Lmw」所得結呆表明，相對十表皮里氏木霉EGl參考生日（SEQ ID N0:2)的面巧，Sca-154E4菌株在35°C的酶活性提高接近40倍。與大腸桿菌和里氏木霉相比注意到的活性提高 的量級表明，所述酶不僅提高特定活性，還過表達和/或更好地分泌。
[0刪 3-在簇甲基纖維素上測定內切葡聚酶活性
[0199] 通過在W下條件下，在70化1體積中水解簇甲基纖維素 (CMC)測量培養物上清液的 內切葡聚酶活性：
[0200] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0201] -1%CMC;
[0202] -Sca-EGl和Sca-154E4菌株的21化1培養物上清液，所述上清液分別在IOkDa膜上 用P冊的50mM巧樣酸緩沖液透析并濃縮兩倍；
[0203] -于35°C解育48小時。
[0204] 向10化1反應介質中添加15化1 DNS試劑停止反應。于100°C加熱5分鐘并在并上冷 卻后，通過測量550nm的吸光度并與用葡萄糖制備的標準范圍進行比較來測定釋放的還原 糖的量。
[02化]圖1表示分別由Sca-EGl和Sca-154E4菌株分泌到培養基的EGl參考內切葡聚酶 (沈Q ID N0:2)及其突變體154E4(沈Q ID N0:10)水解1%CMC的結果。
[0206] 圖1的結果表明，在反應的第一個小時內，每1ml Sca-154E4菌株的培養物釋放的 還原糖的量比Iml Sca-EGl高約10倍。與大腸桿菌和里氏木霉相比注意到的活性提高的量 級表明，所述酶不僅提高特定活性，還過表達和/或更好地分泌。
[0207] 實施例5:在補料瓶中通過里氏木霉生產酶
[020引在250ml化Ienmeyer瓶中培養參考菌株和在CMC上具有最佳活性的那些（CL847、 AEG1、A EGIcEGI、154E4/2、154E4/8、11G8/10、11G8/12、11G8/13)。接種55ml F45培養基 (lOg/1 鄰苯二甲酸鐘緩沖液、pH 6,4.2g/l(NH4)2S04、300mg/l MgS04.7H20、150mg/l CaCl2.2此0、1.5g/l玉米漿、0.07%正憐酸、5mg/l FeS04、1.4mg/l MnS04、1.4mg/l ZnS04、 3.7mg/l CoCb和12.5g/l葡萄糖），于30°CW15化pm振搖。酶的生產在兩個階段進行:在葡 萄糖上的分批階段和在乳糖上的補料-分批階段。規律取樣可W測定葡萄糖濃度低于3g/l 的時刻。在運個階段，開始使用注射累(6路）的補料-分批進料。W40mg糖/g生物質/小時的 流速用50g/l乳糖和0.3%N出為培養進料。每天取樣W測定pH、干重和上清液中的蛋白濃 度。補料-分批培養5天后，用0.45WI1過濾器過濾培養物并將上清液冷凍。
[0209] 最終的蛋白濃度為約3-4g/l。如果濃度低于3g/l，在柱（Vivaspin MWC05, Sador ius)上濃縮上清液。
[0210] 實施例6:k洗牌產生的酶根據SHF方法水解木質纖維素生物質的效率
[0211] 所使用的參考底物是小麥賴桿，所述小麥賴桿用0.0 l %出S化酸浸潰10小時，洗涂， 在P冊中和，壓制并干燥后，進行汽爆預處理（19己-3分鐘）。表9表示參考底物的組成。 rn9i9i
[0213]表9:用于水解試驗的賴桿組成
[0214] 水解在10 %固體w/w進行，即相當于5.4 %纖維素 w/w。
[0215]將蛋白含量固定在lOmg/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA作為參考用Low巧方法 巧慢酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶(Novozymes)向各混合物Wl20±2IU/g 纖維素的量補充e-葡萄糖巧酶活性。
[0216]在具有2ml工作量(Ig反應量)的含有W下的Elppendorf管中進行試驗：
[0217] -0.11 ±0.0 Olg洗涂的賴桿底物；
[0218] -0.9±0.02ml由PH4.8的50mM醋酸鹽緩沖液和氯霉素(0.05g/l)組成的水解反應 基質；
[0219] -取決于其蛋白含量，0.1-0.2 ±0.02g的酶混合物。
[0220] 在Elppendorf Thermomixer Comfort中，于45±2°C W900轉/分鐘的滿流攬拌進行 酶促水解。
[0221] 所有試驗重復進行，取樣時間固定在t24/48和96小時，一些在t72小時取樣。
[0222] 在各取樣時間，在滅菌的化pendorf管里將水解物煮沸5分鐘。然后冷卻并離屯、運 些管。用HPLC進行葡萄糖分析。平行地，將各化pendorf管中的固體殘留物洗涂，離屯、3次，并 于105 °C干燥24小時，從而評估WIS(水溶性固體）。將WIS考慮在內計算水解產量。
[0223] 評估由實施例5產生的混合物。用同樣添加有0-葡萄糖巧酶的參考混合物進行對 照試驗用于比較：由菌株化847 AEGU AEGl)產生的混合物，和由用EGl參考基因再轉化的 菌株化847 A EGl ( A EGIcEGI )產生的混合物。
[0224] 圖2表示由表達154E4變體(SEQ ID NO: 10)的菌株154/8產生的混合物的SHF結果。 [02巧]圖2的結果表明，154E4變體產生的混合物的初始水解速率高于A EGl和A EGIcEGI 參考混合物。其最終水解產量也高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。
[0226] 圖3表示由表達11G8變體的菌株11G8/10(SEQ ID N0:22)產生的混合物的細F結 果。
[0227] 圖3所示的結果表明，11G8變體產生的混合物的初始水解速率高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。其最終水解產量也高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。 帷引實施例7:酶根據SSF方法水解木質纖維素生物質的效率
[0229] 使用的底物與表9所述的底物(實施例6)相同。
[0230] 在實驗室反應器中進行=次SSF。所述反應器由W下元件組成：
[0231] -具有30ml工作量的玻璃瓶；
[0232] -聚酸酸酬(陽邸)安全塞；
[0233] -通過塞相連的Vaplock公司出售的DV-118單向閥。當瓶中的相對壓力高于70m己 時，該閥設置為在出口打開；
[0234] -中空的聚丙締管，在一秒中固定，其通過所述塞，且用隔板將其配備于所述管的 下端；
[0235] -置于瓶頸和塞之間的平面密封。
[0236] 操作生物反應器的原理如下：在乙醇發酵期間產生的C〇2積聚在位于反應基質上 方的頂部空間，通過積累造成生物反應器內壓力增加(Pc)。當Pc高于打開單向閥的壓力(Ps) 時，所述閥打開W允許一定量的氣體排出，所述量例如通過稱重測定。當化<Ps，閥再次關閉 直至化大于Ps。因此，運行中的生物反應器總是在壓力下，從而確保發酵的穩定厭氧培養基。 通過C〇2的產生評估產生的乙醇量，所述C〇2的產生基于W下用于將葡萄糖發酵成乙醇的化 學計量方程通過重量損失來估計：
[0237] 仿化2〇6(葡萄糖）一 2C02巧C出C出OH(乙醇）+能量
[0238] 用于SSF的培養基是包含W下的水性培養基：
[0239] -P冊的50mM醋酸鹽緩沖液；
[0240] -O.lg/1 的氯霉素；
[0241] -含有3旨/11(此?〇4、2旨/1(畑4)25〇4、0.4旨/11旨5〇4.7出0和1旨/1酵母提取物的營養 培養基。
[0242] SSF在10±0.0 l %w/w固體進行，即相當于15±0.003g的總反應質量使用5.4%纖 維素 w/w。將蛋白含量固定在10±0.01mg纖維素酶/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA(牛血 清白蛋白）作為參考用Low巧方法測量酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶 (Novozymes)向各混合物W120 ± 2IU/g纖維素的量補充0-葡萄糖巧酶活性。
[0243] 向培養基中添加糖發酵酵母(釀酒酵母，Ethano 1 Red菌株，Ferment i S, France) W 獲得2 + 0.1 g/kg的含量。
[0244] 將已經于35°C用緩沖液、氯霉素和培養基預處理過的小麥賴桿調節(condition)l 小時后，向生物反應器中添加酶和酵母。
[0245] 在約35°C的溫度，通過將實驗室生物反應器置于軌道旋轉速度為150轉/分鐘的 Infors HT Multitron標準解育器中進行SSF反應。
[0246] 通過稱重生物反應器監測重量隨時間的損失。在反應結束時，將發酵液于IOCTC加 熱5分鐘，冷卻并離屯、W分離未水解固體和發酵液體。然后用氣相色譜分析后者W測定其乙 醇濃度。
[0247] 評估由實施例5產生的混合物。用同樣添加有(6-葡萄糖巧酶的參考混合物進行對 照試驗用于比較：由菌株化847 AEGU AEGl)產生的混合物，和由用EGl參考基因再轉化的 菌株化847 A EGl ( A EGIcEGI )產生的混合物。
[0248] 圖4表示表達154E4內切葡聚酶的兩種混合物的SSF結果（用2個變體獲得平均結 果)。
[0249] 圖4所示的結果表明，在100小時的過程中，表達154E4內切葡聚酶的兩種混合物的 SSF進展(相同劑量的酶的乙醇產量)高于A EGl和A EGlCEGl參考混合物。
[0250] 圖5表示表達11G8內切葡聚酶的巧巾混合物的SSF結果（用兩個變體獲得的平均結 果)。
[0251] 圖5的結果表明，在100小時的過程中，表達11G8內切葡聚酶的S種混合物的SSF進 展(平均)高于A EG1和A EG1 cEG 1參考混合物。
【主權項】
1. 一種分離或純化的多肽，其特征在于，與EG1參考蛋白的內切葡聚酶活性相比它的內 切葡聚酶活性提高，所述多肽選自： i) 選自 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:24和 SEQ ID NO :26的氨基酸序列； ii) 與序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、 SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22和SEQ ID NO: 24或SEQ ID N0:26具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同 一性百分比的氨基酸序列。2. -種純化或分離的核酸，其特征在于，它編碼至少一種如權利要求1所述的多肽。3. 如權利要求2所述的純化或分離的核酸，選自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25。4. 一種載體，其特征在于它包含如權利要求2或3所述的核酸。5. -種分離的宿主細胞，其特征在于它包含如權利要求2或3所述的核酸或如權利要求 4所述的載體。6. 如權利要求5所述的分離的宿主細胞，其特征在于，它選自木霉、曲霉、鏈孢霉、腐質 霉、毀絲霉、金孢霉、青霉、鐮刀菌、高溫單孢菌、芽孢桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、梭菌、纖維 單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母、畢赤醇母和酵母。7. 如權利要求5或6所述的分離的宿主細胞，其特征在于，它選自里氏木霉、綠色木霉、 康氏木霉、黑曲霉、構巢曲霉、文氏曲霉、米曲霉、海棗曲霉、嗜熱毀絲霉、Chrysosporium lucknowense、粗糙脈孢菌、灰腐質霉、嗜松青霉、草酸青霉、大腸桿菌、丙酮丁醇梭菌、糖解 梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母和釀酒酵母。8. 如權利要求1所述的多肽用于水解纖維素的用途。9. 如權利要求1所述的多肽用于生產生物燃料的用途。10. -種能夠作用于木質纖維素生物質的酶組合物，所述酶組合物由絲狀真菌產生且 包含至少一種如權利要求1所述的多肽。11. 一種用于從生物質生產生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續步驟： -將待水解的生物質懸浮于水相； -在如權利要求10所述的酶組合物存在下水解木質纖維素生物質以產生含有葡萄糖的 水解物； -發酵水解物中的葡萄糖以產生發酵液； -從發酵液中分離生物燃料。12. -種用于從生物質生產生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續步驟： -將待水解的生物質懸浮于水相； -同時加入如權利要求10所述的酶組合物和發酵生物以產生發酵液； -從發酵液中分離生物燃料。13. 如權利要求12所述的方法，其中發酵生物選自如權利要求5或6所述的宿主細胞。14. 一種用于從生物質生產生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續步驟： -將待水解的生物質懸浮于水相； -加入一種或多種如權利要求5-7任一項所述的宿主細胞以及發酵生物和/或如權利要 求10所述的酶組合物以產生發酵液； -從發酵液中分離生物燃料。
【文檔編號】C12N15/56GK105874065SQ201480063413
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】A·馬爾若, Y·貝諾伊特, C·佩爾西永, C·艾林哈克, C·于爾曼, O·邦宗, S·福爾, S·阿爾芒, M·佩蒂, M·勒農
【申請人】Ifp新能源公司, 普魯泰斯公司, 國家科學研究中心