專利名稱：從植物生物質提取、純化和轉化類黃酮化合物的制作方法
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從植物生物質提取、純化和轉化類黃酮化合物發明領域本發明涉及從植物生物質制備的類黃酮化合物，尤其涉及富集蕓香苷的組合物，它們可以被酶促轉化成更有價值的類黃酮化合物異槲皮苷和櫟精。
背景技術：
植物類黃酮化合物通常在植物中以糖苷形式存在，但在一些情況中，它們作為自由的糖苷配基存在。多數糖苷為O-糖苷，最通常單糖苷在7-位。二糖苷通常在-7位和-3位及偶然地在-7和-4’位具有糖。存在其他組合和單-O-糖苷但是不多。C-糖苷以更嚴格的分布存在，C-6和C-8糖苷是最普遍的(Harbone，1994)。
植物類黃酮化合物具有抗氧化性質(Bors等人，1990)、腫瘤發生中的細胞抑制作用，并且能夠抑制寬范圍的酶，如血管緊張肽轉化酶(ACE)、蛋白質激酶C、酪氨酸蛋白激酶，和拓撲異構酶II。它們被認為是潛在的癌預防劑和心臟保護劑(Manach等人，1996；Skibola和Smith，2000)。還研究了它們作為消炎或抗病毒劑的潛在用途(Middleton和Kandaswami，1993)。Backhaus(1995a)聲稱生物類黃酮化合物，特別是蕓香苷、檸檬素、櫟精、桔皮苷或者衍生物是蛋白質切割酶(如透明質酸酶和/或膠原酶)失活的原因，這些蛋白質切割酶促進皮膚老化過程。這些化合物可用于一般的皮膚護理或者美容手術。據報導蕓香苷、櫟精、異槲皮苷、兒茶素和其他化合物也防止和改善皮膚的老化現象(Arata，1992)。Midori(1994)聲稱，櫟精糖苷、二價金屬離子，和甘草提取物一起通過促進人肝臟中的酒精代謝而防止中毒。
蕓香苷是由櫟精和蕓香糖組成的類黃酮化合物糖苷。已經闡明了蕓香苷的許多有益的健康效果。這些效果歸因于蕓香苷的消炎、抗突變、抗腫瘤、抗致癌、平滑肌松弛，和雌激素受體結合活性(Pisha和Pezzuto，1994)。蕓香苷也正在被用于治療毛細血管脆性、腦血栓、視網膜炎和風濕熱-相關的出血狀況(Griffith等人，1944；Matsubara等人，1985；Iwata等人，1990；Yildzogle-Ari等人，1991)。在低膳食脂肪攝入的情況下，已經報導蕓香苷和櫟精顯著抑制結腸腫瘤的發生(Agullo等人，1994；Deschner，1992)。Backhaus(1995b)聲稱口服劑量形式和注射液或輸注液或者栓劑形式的蕓香苷及其衍生物將使逆轉錄病毒(例如，HIV)失活。蕓香苷可用作天然著色劑、氧化抑制劑、維生素、化妝品中的防曬物(蕓香苷將吸收紫外線)，和作為功能性食品應用中的成分(匿名，1990a，b)。
可在許多植物中發現蕓香苷，這些植物包括蕎麥(葉子、花、莖、稈、殼和去殼麥粒)、日本槐樹(Sophora japonica)、番茄、三色堇(堇菜科，堇菜屬種，Viola sp.，Violaceae)、煙草、連翹、繡球、fava d′anta(Dimorphandragardnerina和Dimorphandra mollis)和桉樹(Humphreys，1964)。蕎麥被認為能夠提供蕓香苷的主要膳食來源。Kitabayashi等人(1995)報導蕎麥種子的蕓香苷含量為0.126到0.359mg/g干重。Oomah和Mazza(1996)報導完整種子和麥殼中蕓香苷含量分別為0.47和0.77mg/g干重。他們還報導類黃酮化合物在麥殼中高度濃縮；蕎麥種子和麥殼的平均類黃酮化合物含量分別為3.87和13.14mg/g。Prochazka(1985)報導在小心干燥的、處于花期的Czechish蕎麥葉子中發現6％蕓香苷(wt/wt)。干草產率為600到1000kg/ha，其以4％(wt/wt)蕓香苷濃度，達到24-40kg蕓香苷/ha。
盡管蕓香苷的工業生產的多數細節是專利的并且不在公開文獻中描述，但是我們知道Merck GmbH為了商業目的從fava d′anta提取蕓香苷。德國Merck GmbH的Heywang和Basedow(1992)用1，4-二噁烷在回流下從fava d′anta(Dimorphandra)的嫩枝(shoot)提取蕓香苷。通過室溫下結晶回收蕓香苷。然而，二噁烷被認為是致癌的。
Huo(中國專利1217329，1999)描述了通過將苦蕎麥(tartary buckwheat)種子用水洗滌，粗磨，粗篩，浸入水中，空氣中干燥，細磨，浸入可食用醇，60℃以下提取，并過濾來提取蕓香苷。Balandina等人(1982)用熱水從蕎麥種子提取蕓香苷以便取出所希望的產物并將其結晶。
Zhai(中國專利CN 1160048，1997)描述了通過用含有1-10％硼砂的飽和石灰水浸泡，并通過加入HCl在pH 1-6下沉淀從槐米(Flos sophorae)提取蕓香苷。
Matsumoto和Hamamoto(1990)用甲醇提取，活性炭吸附，然后去吸附，用40％乙醇中的1％氨洗脫，并從20％乙醇重結晶，從Sophoraaugustifolia芽回收蕓香苷。
Liu(1991)描述了通過磨粉，石灰水中蒸煮，中和上清液，冷卻，過濾，洗滌，并干燥沉淀物從日本槐樹(Sophora japonica)芽提取蕓香苷的方法。產率為14.2％(wt/wt)，產物含有95.1％(wt/wt)蕓香苷。
Sloley等人(2000)報導，盡管金絲桃蒽酮被認為是貫葉金絲桃(Hypericum perforatum)(St.John′s wort，金絲桃)的葉子和花的提取物的標志性化學物，但是其他化合物如貫葉金絲桃素、金絲桃苷、蕓香苷和櫟精以高得多的濃度存在。他們還發現不同提取物的化學組分譜變化很大。然而，自由基清除能力與櫟精含量正相關。16個金絲桃提取物中平均蕓香苷和櫟精含量分別為2.0和0.3％(wt/wt)。
1克蕓香苷可溶解于室溫下約8L水中或者200ml沸水中。Zirlin(美國專利3,822,475，1974)公開了防止難溶的類黃酮化合物在酸性軟飲料中結晶的方法。將類黃酮化合物與蔗糖混合并加熱到焦糖熔化階段(140-185℃)，溶于水性系統中，并蒸發掉水以得到干燥混合物。
用α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20)、環麥芽糊精葡聚糖基轉移酶(E.C.2.4.1.19)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)，和半乳糖-轉移酶(β-半乳糖苷酶)將櫟精苷改性成水可溶的黃酮醇苷，參見San-Ei化學工業公司(Chemical Industries Ltd.)和Hayashihara生物化學實驗室公司(Biochemical Laboratory Inc.)(Nishimura等人，1992；Suzuki等人，1992a，b；Suzuki等人，1995；Suzuki等人，1996；Washino 1992；Yoneyama等人，1996)所描述的。Hayashihara生物化學實驗室公司聲稱他們成功地產生了水可溶的蕓香苷，其水溶解度增加了5000倍以上(匿名，1990a)。
1990年前，櫟精被認為是致突變的和致癌的(Manach等人，1996)。代謝動物研究已經表明櫟精可被快速轉化成非-誘變性的3’-O-甲基櫟精代謝物(Morand等人，1998；Skibola和Smith 2000)。更重要地，已報導櫟精具有抗細菌、抗病毒、抗氧化、抗增殖、消炎，和抗致癌效果(Crespy等人，1999；Skibola和Smith，2000)。
櫟精還對各種腫瘤細胞(Middleton和Kandaswami，1993；Caltagirone等人，2000)、結腸癌細胞(Agullo等人，1994；Deschner，1992)和潰瘍(Borrelli和Izzo，2000)表現出強抑制活性。櫟精已經被鑒定為低濃度下強拓撲異構酶II抑制劑，類似于癌癥治療中廣泛使用的表鬼臼毒素的活性(Skibula和Smith，2000)。
Ishige等人(2001)表明許多類黃酮化合物和相關多酚化合物保護小鼠海馬細胞系HT-22和大鼠原代神經元不受谷氨酸鹽導致的氧化應激協迫。該發現是重要的，因為氧化應激造成的神經細胞死亡與各種病理相關，包括中風、動脈硬化癥、創傷和阿爾茨海默氏和帕金森病。他們的數據表明一些類黃酮化合物(櫟精、山奈素和黃顏木素)具有相當的保護性，而其他的(蕓香苷、白楊素，和芹菜配基)無活性。在氧化應激的細胞培養物模型中櫟精改變谷胱甘肽(GSH)代謝并抑制活性氧種類(ROS)。其作用機理類似于沒食子酸丙酯和咖啡酸甲酯的作用機理，但是與維生素E的不同。Noroozi等人(1998)報導櫟精在抵抗氧化性DNA損傷方面比蕓香苷和維生素C更強。
Ashida等人(2000)報導飲食黃酮醇(櫟精和蕓香苷)和黃酮拮抗地抑制二氧芑誘導的芳基烴受體(AhR)的轉化。櫟精在抵消該環境污染物的毒性方面比蕓香苷更強。在抗致癌性方面，I期酶氧化、還原或水解致癌物，II期酶綴合或者影響致癌物。Valerio等人(2001)闡明櫟精是一種II期酶誘導劑，其刺激II期解毒活性。II期酶還可以清除強氧化劑，并且科學興趣指向應用它們的活性作為降低癌癥危險的方法。使用II期酶誘導劑(許多這些誘導劑在通常的食物中被發現)是增加身體組織中II期酶活性的一種方法。
Agullo等人(1997)報導櫟精是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶；與細胞增殖和轉化有關的一種酶)的有效抑制劑。毛地黃黃酮、芹菜配基和楊梅樹皮素也顯示出這種活性。PI 3-激酶的抑制可能與這些類黃酮化合物的抗腫瘤性質有關。而且，據報導，櫟精抑制淋巴細胞酪氨酸激酶活性，并且在I期臨床試驗中表現出抗腫瘤性質(Ferry等人1996)。
Watanabe等人(1997)報導櫟精負責杜仲(Eucommia ulmoides)葉的α-葡糖苷酶抑制劑活性。因為α-葡糖苷酶是催化糖類消化過程中最后一步的酶，所以，上面發現意味著櫟精可以抑制飯后高血糖并且可用于糖尿病的治療，潛在應用于晚期糖尿病并發癥、肥胖和相關的失調。櫟精還阻斷導致山梨糖醇積累的酶，山梨糖醇與糖尿病患者中的神經、眼睛和腎臟損傷有關。然而，還沒有人類研究以評估櫟精對糖尿病的可能的有益效果(Wang，2000)。
Kato等人(1983)證明在膳食中接受0.5％櫟精的小鼠或大鼠，其血清甘油三酯顯著降低。櫟精的補充也表現出可以有效地減弱食用高膽固醇食物的大鼠中血清和干臟膽固醇的上升(Basarkar，1981)。
從Alpinia urarensis Hay的葉子提取和純化的櫟精及其糖苷表現出血小板凝集-抑制活性。其活性大于作為對照血小板凝集抑制劑的阿司匹林和人參皂甙的活性(Okuyama等人，1996)。
在日本專利公開號06248267中，Nakayama(1994)聲稱櫟精、山奈素、兒茶素或黃杉素可用于食品中或作為藥物以預防或治療由功能失常或清除活動導致的疾病、局部缺血性疾病、風濕癥、糖尿病等。
Lutterodt和Abu Raihan(1993)報導櫟精具有類似麻醉劑的抗傷害活性，其干擾疼痛傳遞。50mg櫟精/kg體重的劑量將和2.5mg硫酸嗎啡/kg具有相同的效果。
可以從草棉(Gossypium herbaceum)、Waldsteinia fragarioides(Michx)、Tratt(薔薇科，Rosaceae)、鷹爪豆(Spartium junceum L.)(Fabaceae)(Yesilada等人，2000)和歐洲七葉樹(Aesculus hippocastanum)的花提取天然異槲皮苷(櫟精-3-O-β糖苷)。其還在芹菜種子、茴香種子、木賊、紅三葉草和金絲桃(St.John’s wort)中發現。異槲皮苷已經被證明具有幾種生物學活性，包括抑制血管緊張肽轉化酶(ACE)、抑制前列腺素合成，和抗病毒活性(Abou-Karam和Shier，1992)。
類黃酮化合物的消化吸收中細菌酶的作用是重要的，因為哺乳動物組織不能合成這些水解酶。Griffiths和Barrow(1972)已經證明被無菌大鼠攝入的類黃酮化合物糖苷在糞便中以未被水解的形式回收。糖-糖苷配基鍵的水解在遠端回腸和盲腸中發生。
在跨腸膜的吸收過程中，類黃酮化合物以糖苷配基和/或糖苷形式被吸收并被部分轉化成葡糖苷酸、硫酸鹽或甲氧基化物(Manach等人，1998)。在血漿中不能檢測到游離的櫟精。被吸收的小部分類黃酮化合物被肝臟酶代謝，導致極性綴合物在尿中被排泄或者通過膽囊返回到十二指腸。最大部分的被攝入的類黃酮化合物未被吸收，而是被腸內微生物菌群降解。細菌的酶催化一些反應，包括水解、雜環含氧環的切割、脫羥基作用和脫羧基作用。根據所涉及的類黃酮化合物的結構，產生一些酚酸。然后酚酸可被吸收并在肝臟中綴合和O-甲基化，然后可以進入循環(Manach等人，1996)。
Crespy等人(1999)闡明櫟精和異槲皮苷的生物利用度比蕓香苷的高得多。蕓香苷比櫟精、異槲皮苷和異鼠李黃素吸收得更慢，因為其必須被盲腸微生物菌群水解，而櫟精、異槲皮苷和異鼠李黃素從小腸被吸收(Manach等人，1997)。Morand等人(2000)還證明異槲皮苷比其他櫟精形式(櫟精、蕓香苷和槲皮苷)被更好地吸收。飯后四小時，不管消費的是櫟精的哪種形式，在水解的血漿中鑒定到的代謝物都是3’-和4’-甲基櫟精。然而，血漿中代謝物的總濃度顯著不同對于異槲皮苷、櫟精和蕓香苷分別是33.2、11.2和2.5μM。槲皮苷(櫟精3-鼠李糖苷)消費后，它們在血清中不能檢測到任何代謝物。Gee等，2000表明異槲皮苷比游離的櫟精糖苷配基更快地穿過小腸上皮。這些數據建立了類黃酮化合物的生物利用度分級情況，即異槲皮苷＞櫟精＞蕓香苷。
柚苷酶是一種酶制品，其可以從Penicillium aspergillus、白腐墊殼孢(Coniella diplodiella)、宮部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)、立枯絲核菌(Rhizoctoyaia solanii)、柑桔擬莖點霉(Phomopsis citri)、和斜臥青霉(Penicillium decumbens)的培養物生產。多數商業化柚苷酶制品從斜臥青霉生產。Narikawa等人(1998)推斷，斜臥青霉降解蕓香苷，但是他們的工作是定性的，并且他們沒有指出該降解的結果是什么。
柚苷酶被用于將柚皮苷(narigin)——4’，5，7-三羥基黃烷酮(flavonone)的7-(2-鼠李糖苷-β-葡糖苷)水解成柚皮素(narigenin)。柚苷酶在商業上被用于減弱柑橘果實或果汁中的苦味。Uyeta等人(1981)在茶浸液的研究中使用了柚苷酶。柚苷酶處理對茶浸液的致突變活性的影響類似于用酸或桔皮苷酶處理的效果。然而，他們既沒有表征也沒有鑒定水解產物。他們鑒定了山奈素、櫟精和楊梅樹皮素是用人糞便細菌處理的茶浸液中的主要致突變成分。
盡管異槲皮苷似乎是最希望的櫟精衍生物，但是市場上還沒有該化合物的濃縮或純的形式——除了非常小的量被用作分析標準。以前沒有公開處理蕎麥葉材料以回收類黃酮化合物和進一步將這些類黃酮化合物生物轉化成高生物可利用度的、性能增強的、高價值產物如異槲皮苷和櫟精的方法。以前公開的僅僅是提取和純化蕓香苷的經典實驗室方法。
通常，生物體系中發現的天然異槲皮苷和櫟精的濃度比蕓香苷的低得多。從生物體系提取的異槲皮苷和櫟精由于它們的稀有性和生物利用度而要求高得多的價格。現今沒有商業上可行的技術將蕓香苷(不管來源)生物轉化成高生物可利用度的、性能增強的高價值產物如異槲皮苷和櫟精。
發明概述本發明的一個目的是提供自蕓香苷衍生的富含異槲皮苷的組合物，以及經濟地提供商業上足夠量的該組合物以允許將它們用于功能食品、營養藥(nutraceutical)、天然健康產品、化妝品和藥物應用。
本發明的另一個目的是提供衍生自蕓香苷的組合物，其富含比例受控的異槲皮苷和櫟精，和提供商業上足夠量的這種組合物以允許將它們用于功能食品、營養藥、天然健康產品、化妝品和藥物應用。
本發明的另一個目的是提供一種方法，在該方法中通過抑制異槲皮苷向櫟精的轉化而最大化異槲皮苷的產率。在本發明中，這通過加入存在于柚苷酶制品中的β-D-葡糖苷酶活性的抑制劑而實現。
本發明的另一個目的是提供從蕎麥得到蕓香苷的方法，尤其是提供從蕎麥種子收獲后殘留在大田中的蕎麥植物殘余物得到蕓香苷，從而將廉價的廢品轉化成更有價值的產品的這種方法。
在第一方面，本發明提供了從含有蕓香苷的生物質制備富含蕓香苷的組合物的方法，該方法包括使用水性溶液對生物質實施類黃酮化合物提取；過濾溶液得到提取液；讓提取液靜置以便形成沉淀；收集并干燥沉淀以形成富含蕓香苷的組合物。
提取過程中水性溶液優選保持在高于30℃的溫度。水性溶液優選為水性醇溶液，醇濃度按體積計大于20％醇，對于最佳結果，其為按體積計50％到100％醇。提取溶液優選被濃縮到其原始體積的約1/5到1/10，然后靜置冷卻以促進沉淀。
使用本發明的方法，通過相對簡單的濕化學手段，無需層析，可以制備具有按重量計70％蕓香苷含量的富含蕓香苷的組合物。最經濟地，使用種子從蕎麥地里收獲后剩下的作物殘余物提供含有蕓香苷的生物質。該殘余物以前幾乎沒有任何價值。使用該作物殘余物比現有技術中使用處于花期的蕎麥具有優勢，因為可以收獲種子，從而從蕎麥作物得到第一級回報。在現有技術中，從蕎麥作物獲得的總回報來自購買處于花期或者其他成熟前階段的蕎麥作為蕓香苷生產的原料。
在另一方面，本發明提供了通過如下方法制備的富含異槲皮苷的組合物，該方法包括提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶的酶制品加入該溶液；在溫育期間保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變成不適于酶活性的條件結束溫育期。這些改變包括降低pH和增加溶液的溫度。調節溫育期的持續時間以控制組合物中異槲皮苷的比例。
在本發明的第三方面提供了通過如下方法制備的富含異槲皮苷的組合物，該方法包括提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶或者α-L-鼠李糖苷酶的酶制品加到溶液中；在溫育期間保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變為不適于酶溫育的條件終止溫育期。為了得到最佳產率，溫度應該為50-55℃并且應該不超過65℃。調節溫育期的持續時間以控制組合物中異槲皮苷的比例。溫育期最佳為1-48小時。降低pH和增加溶液的溫度可以通過使酶制品變性而終止溫育期。
組合物中異槲皮苷的比例可以高達約95％。使用含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的酶制品進行酶溫育也將蕓香苷轉化成櫟精。可以調節溫育期以提供富含不同比例的異槲皮苷和櫟精的組合物。
方便地且經濟地，該酶制品可以是柚苷酶，其可通過商業途徑得到并且是經濟的。出售的柚苷酶中有保證含量的β-D-葡糖苷酶用于各種商業用途。與Narikawa等人(1998)揭示的現有技術相反，發現來自斜臥青霉的柚苷酶能夠從蕓香苷切割糖。
酶α-L-鼠李糖苷酶與蕓香苷的溫育將蕓香苷轉化成異槲皮苷。酶β-D-葡糖苷酶與異槲皮苷的溫育將異槲皮苷轉化成櫟精。柚苷酶含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶兩者，并且可以以經濟的量通過商業途徑得到。
可以實現有效的、經濟的和商業上可行的生物轉化而不使用α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的純化的或其他昂貴的形式。通過操縱生物轉化條件可以定制具有不同比例的蕓香苷/異槲皮苷/櫟精的組合物。本發明的方法產生具有高度濃縮的蕓香苷、異槲皮苷、櫟精或它們的混合物的產物，隨后可以使用標準生化純化技術純化該產物。
在本發明的第四方面，在加入柚苷酶之前向蕓香苷溶液加入β-D-葡糖苷酶抑制劑。在優選的實施方案中，β-D-葡糖苷酶抑制劑為D-Δ-葡糖酸內酯。通過抑制柚苷酶制品中的β-D-葡糖苷酶組分，異槲皮苷將不被轉化為櫟精；結果以高產率和大于80％的純度得到異槲皮苷。
本發明的方法可用于從各種植物生物質來源產生具有高度濃縮的蕓香苷、異槲皮苷、櫟精或它們的混合物的產物，這些生物質來源包括，但不限于蕎麥屬(Fargopyrum)成員，金絲桃的葉、銀杏(ginkgo)、biloba紫花苜蓿、桑樹、藻類、蘋果皮、梨子皮、洋蔥皮、蘆筍尖頭、薔薇果果皮。
通過本發明的方法產生的富含異槲皮苷的產物具有生物活性性質，該生物活性性質包括血管緊張肽-轉化酶抑制、消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、自由基清除、癌癥預防、心臟保護、蛋白酶抑制、蛋白激酶C抑制、酪氨酸蛋白激酶抑制、拓撲異構酶II抑制和蛋白切割酶抑制性質。
通過本發明的方法產生的富含異槲皮苷的產物的生物活性性質將用作健康食品、藥品、營養藥和化妝品中的添加劑。當加到產品中時，這些生物活性性質將可用于預防和治療疾病和健康問題，其包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化癥、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
本發明還提供了使得能夠經濟生產和滿足市場偏好的工藝和產品靈活性。
在本發明下面的詳細描述中，本發明的這些和其他目的、特征和優點將變得更加明顯，該詳述通過實施例闡明了本發明的原理。
附圖簡述盡管所要求的發明列于本發明的結論部分，但是在相伴的詳細描述中提供了優選實施方案，它們可以參考附圖獲得最佳的理解，其中這些附圖的每一個圖中相似部分被相似數字標記，并且其中

圖1A說明蕓香苷的化學結構式；圖1B說明異槲皮苷的化學結構式；圖1C說明櫟精的化學結構式；圖2A-2C顯示了如下各項的HPLC分析結果(2A)蕎麥葉的甲醇提取物(RT14.862＝蕓香苷，RT20.947＝櫟精)；(2B)從已經被濃縮到水相并冷藏的蕎麥葉水性醇提取物得到的沉淀(RT14.785＝蕓香苷)。(2C)與柚苷酶溫育24小時后蕓香苷向異槲皮苷(RT15.181)和櫟精(RT20.372)的轉化。所有樣品都在C-18對稱柱上層析，用含有0.05％三氟乙酸的水∶乙腈梯度洗脫。在280nm監視柱流出液并通過ELSD定量溶解的固體。
圖3A-3C顯示了如下蕓香苷樣品的HPLC分析結果(3A)商業蕓香苷樣品(Street Chemicals)(RT14.875＝蕓香苷，RT15.442＝異槲皮苷)；(3B)用柚苷酶處理蕓香苷后回收的沉淀(RT15.487＝異槲皮苷，RT20.843＝櫟精)；(3C)通過制備HPLC得到的純化的異槲皮苷(RT15.436＝異槲皮苷)。所有樣品都在C-18對稱柱上層析，用含有0.05％三氟乙酸的水∶乙腈梯度洗脫。在280nm監視柱流出液并通過ELSD定量溶解的固體。
圖4為實施本發明的兩種方法的概述性流程圖。使用方法A，從植物生物質回收蕓香苷，然后將其轉化成蕓香苷、異槲皮苷和櫟精的混合物。使用方法B，加入β-D-葡糖苷酶的抑制劑以防止異槲皮苷向櫟精的轉化。使用方法B，增加了本發明方法的異槲皮苷產率和純度。
具體實施方案的描述本發明提供了從植物生物質產生高價值的生物可利用的類黃酮化合物的方法。如上述，類黃酮化合物已被證明具有一系列有用的生物活性性質。類黃酮化合物用于治療性應用中的問題之一是它們在自然中通常以低濃度存在。為了將類黃酮化合物用作藥物、營養藥或和其他健康產品的添加劑，需要純化類黃酮化合物的方法。
在本發明中，通過標準生物化學方法回收類黃酮化合物蕓香苷。然后通過酶制品柚苷酶將蕓香苷轉化成異槲皮苷和櫟精。本發明的進一步改進表明通過使用食品添加劑d-Δ-葡糖酸內酯選擇性抑制柚苷酶制品中存在的β-D-葡糖苷酶活性，可以增加中間產物異槲皮苷的產率。
下面的實施例和附圖闡明了本發明的一些實施方案的操作，從而使其可以更容易地被理解。
雖然現在詳細地具體參考附圖，但是應強調所顯示的細節僅作為實例并且僅僅用于本發明的優選實施方案的舉例說明性討論的目的，并且是提供其是因為這被認為是最有用的并且容易理解本發明的原理和概念的描述。在這點上，如果對于本發明的基本理解無必要，則不再更詳細地說明本發明的結構細節，說明書以及附圖將使得本領域技術人員明白本發明的幾種形式可以怎樣在實踐中實施。應強調的是，所顯示的這些細節是實例并且用于舉例說明性討論目的。
從植物生物質提取蕓香苷下面的實施例1和2論證了通過涉及水溶液中提取、濃縮和沉淀的方法可以回收植物生物質中的蕓香苷。可以考慮省略濃縮提取液的步驟，然而，該相對簡單和經濟的步驟可以增加該方法的效率。
如實施例1中所示，所述的熱水中提取從葉子回收了36％可利用的蕓香苷。
如實施例2中所示，如所述的通過在含有50％(體積)甲醇的水性醇溶液中提取，從葉子回收了65％可利用的蕓香苷。
如實施例3中所示，通過簡單的濕化學手段而不使用層析就可以將富含蕓香苷的組合物中蕓香苷的含量增加到約70％。
如實施例4中所示，本發明方法的提取效率隨著醇濃度、水性溶液的溫度、固體與溶劑的比，和提取時間而變。對于經濟的商業方法，可以基于提供這些變量的經濟性確定這些變量的適宜組合。
預期可以以序貫分批或者連續補料模式實施提取。通過將提取過的生物質加入新鮮量的溶劑中并進行第二次或額外的提取也可以提高該方法的提取回收比。
本領域的現有技術多數集中在類黃酮化合物的分析方法學、來自生物質的類黃酮化合物的濃度和量。以前還沒有將來自沉淀的富含蕓香苷的級分描述為終產物。以前從未認識到富含蕓香苷的組合物的價值。
實施例1從蕎麥葉材料水性提取、濃縮和沉淀蕓香苷收獲并干燥后，將蕎麥葉在Wiley磨機上碾磨以通過2mm篩，由此制備用于提取的蕎麥葉。將1kg磨過的蕎麥葉(蕓香苷含量3.74％，基于干重)在10L水中在90℃下連續攪拌1小時，進行提取。過濾所得懸浮物，并將濾餅用300ml熱(95℃)水洗滌2次。將洗滌的濾液與提取物混合得到體積為8.6L的合并提取物。該水性提取方法從葉子回收了36％可利用的蕓香苷。
將提取物在減壓下濃縮到原來體積的約1/5和1/10。濃縮提取物保存在冰箱(4℃)中過夜，此時類黃酮化合物從溶液中沉淀出來。以7,000×g離心并過濾上清液后收集沉淀的物質。將沉淀隨后冰凍干燥。通過將干燥產物的等分試樣溶于甲醇并通過RP-HPLC分析確定沉淀物中蕓香苷含量。從HPLC結果，我們得出結論在沉淀中可以回收濃縮的水性提取物(減小到其原始體積的1/5和1/10)中60％可得到的蕓香苷。
實施例2從蕎麥葉材料水性醇提取、濃縮和沉淀蕓香苷收獲并干燥后，將蕎麥葉在Wiley磨機上碾磨以通過2mm篩，由此制備用于提取的蕎麥葉。將1kg磨過的蕎麥葉(蕓香苷含量3.74％，基于干重)在10L 50％(v/v)水性甲醇中提取，具體地在40℃下連續攪拌3小時。過濾所得懸浮物，并將濾餅用溫(40％)50％(v/v)水性甲醇洗滌。將洗滌的濾液與提取物合并。該提取方法從葉子回收了65％可利用的蕓香苷。圖2A說明了甲醇提取物中蕓香苷的濃度。將提取物在減壓下濃縮到原來體積的約1/5。濃縮提取物保存在冰箱(4℃)中過夜，此時類黃酮化合物從溶液中沉淀出來。以7,000×g離心并傾析上清液后收集沉淀的物質。將沉淀隨后冰凍干燥。通過將干燥產物的等分試樣溶于甲醇并通過RP-HPLC分析確定沉淀物中蕓香苷含量。圖2B說明了沉淀中類黃酮化合物的濃度。發現富含類黃酮化合物的產物含有64％蕓香苷和6.88％蛋白質。在來自濃縮提取物的沉淀中證明了93-100％的蕓香苷回收。
實施例3從分離自蕎麥葉的富含類黃酮化合物的中間產物純化蕓香苷將來自實施例2的富含蕓香苷的產物溶于溫甲醇中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌以促進蕓香苷的完全溶解。使用真空過濾，從溶液除去任何不溶的物質。將溶液在40℃減壓下蒸發至干。然后將殘渣懸浮在熱(90℃)水中，持續攪拌直到大多數沉淀已經溶解。讓懸浮物在冰箱中沉淀過夜。通過真空過濾取出沉淀，并將其冰凍干燥。純化的蕓香苷沉淀溶于甲醇，通過0.45μm尼龍注射濾器過濾，然后用RP-HPLC分析確定產物純度。重復溶解/結晶而不使用層析后，蕓香苷含量增加到約70％和更高。
實施例4從蕎麥葉材料提取蕓香苷的優化將如實施例2中所述得到的蕎麥葉用下面溶劑以固體∶溶劑比為1∶20在60℃提取4小時水、30％(v/v)甲醇/70％(v/v)水、50％(v/v)甲醇、70％(v/v)甲醇/30％(v/v)水、85％(v/v)甲醇/15％(v/v)水、和100％甲醇。過濾所得提取物并通過RP-HPLC分析。提取溶劑中的甲醇含量對從蕎麥葉提取蕓香苷的效率有顯著影響(表1)。從一系列提取優化研究確定了從蕎麥葉回收蕓香苷的最佳提取條件。改變提取溶劑的醇含量以及提取溫度、提取時間和固體與溶劑的比有顯著的影響。表1-3總結了這些結果中的一些。
表1使用1∶20固體∶溶劑比，并在60℃提取4小時的條件下，提取溶劑中甲醇的濃度對蕓香苷提取效率的影響

表2使用1∶10固體∶溶劑比、70％(v/v)甲醇提取溶劑、提取4小時的條件下提取溫度對蕓香苷提取效率的影響
表3使用70％(v/v)甲醇提取溶劑50℃條件下，提取時間和固體∶溶劑比對蕓香苷提取效率的影響
蕓香苷向異槲皮苷和櫟精的轉化圖1A說明了蕓香苷的分子組成。酶α-L-鼠李糖苷酶的反應通過除去底部右手邊的第一個糖導致蕓香苷向圖1B的異槲皮苷的生物轉化。為了說明，α-L-鼠李糖苷酶基本上沿著圖1A中線A-A’進行概念上的切割。
酶β-D-葡糖苷酶的反應通過除去圖1B中底部右手邊上的糖導致圖1B的異槲皮苷向圖1C的櫟精的生物轉化。為了說明，β-D-葡糖苷酶基本上沿著圖1B中線B-B’進行概念上的切割。
如實施例5中所示，從上面的實施例2的富含蕓香苷的組合物制備富含異槲皮苷的組合物。該制備方法包括提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液。實施例5中的這些條件包括升高溶液的溫度到80℃，調節pH到4。向溶液中加入含有酶α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的酶制品，即食品級柚苷酶粉末。在溫育期間，該溶液的條件保持在適于酶溫育的條件下，溶液的溫度為50℃，并且持續攪拌。
將溶液的條件改變為不適于酶溫育的條件，終止溫育期。在實施例5中該改變包括持續攪拌下調節pH至2.5，然后加熱到80℃保持10分鐘。
如表4中所見，調節溫育期的持續時間可以控制富含異槲皮苷的組合物中異槲皮苷的比例。異槲皮苷的比例隨著溫育期的延長而增加，8小時后蕓香苷/異槲皮苷/櫟精的重量比為1.71∶1∶0.06；16小時后為0.33∶1∶0.07；24小時后為痕量∶1∶0.46。
從而24小時后，基本上所有蕓香苷都已經被轉化成異槲皮苷和櫟精。然而，24小時后，組合物含有的異槲皮苷僅為櫟精的約2倍。之前，例如16小時時，組合物中異槲皮苷為櫟精的約14倍，異槲皮苷為蕓香苷的約3倍。
隨著溫育期進一步增加，可以看到異槲皮苷被進一步轉化成櫟精，櫟精與異槲皮苷的比例一直增加直到96小時，組合物中蕓香苷/異槲皮苷/櫟精的重量比為痕量∶1∶3.38，組合物含有的櫟精為異槲皮苷的三倍以上。
容易看出，通過調節溫育期可以調節蕓香苷、異槲皮苷和櫟精的比例。以小時測量溫育時間，從而可以得到相當大的時間范圍以容許大規模地以商業上顯著的量實現轉化。
如實施例6中所示，一天的酶促轉化后，商業來源的蕓香苷(按重量計純度為95％)被轉化成富含異槲皮苷的組合物，其蕓香苷/異槲皮苷/櫟精的重量比為0.1∶1.0∶0.2。
如實施例7中所示，商業蕓香苷從圖3A的高蕓香苷組合物被轉化成圖3B的高異槲皮苷和櫟精組合物。
如實施例8所示，通過Deltaprep C-18層析進一步純化實施例7中產生的高異槲皮苷和櫟精組合物，得到高純度(95％+)異槲皮苷，產率為起始材料中75％的異槲皮苷。
如實施例10中所示，通過加入D-Δ-葡糖酸內酯，或者其他食品助劑可以抑制柚苷酶中β-葡糖苷酶，而不影響α-鼠李糖苷酶的活性。D-Δ-葡糖酸內酯已經被多年用作食品添加劑，例如作為豆腐生產中的凝結劑。在本發明中D-Δ-葡糖酸內酯增加了靈活性并進一步確保該方法將產生高異槲皮苷產率。為了產生異槲皮苷，選擇性抑制β-糖苷酶，或者從柚苷酶選擇性分離α-鼠李糖苷酶在本發明的范圍內。
如實施例11所示，中等規模的方法能夠從蕎麥葉產生高度富含異槲皮苷的產物。從而，可以從低價值的植物生物質產生新產品。
這樣，一種商業可得到的酶混合物——柚苷酶可用于將蕓香苷轉化成有用的高價值類黃酮化合物櫟精和異槲皮苷。此處公開的酶轉化是有效的并且比現有技術更廉價，并且不使用有毒和可能有害的溶劑。在從該研究產生的生物轉化產物之一中蕓香苷/異槲皮苷/櫟精重量比為痕量∶22.8∶7.3。其組成類似于銀杏(Ginkgo Biloba)提取物，該提取物典型地含有24.5％黃酮糖苷和6.3％櫟精。
連同混合在不同條件下加工的產物，可以定制具有不同化學譜的產物。該技術為制備“設計的營養藥”提供了一定彈性。此外，使用層析或其他技術可將所轉化的混合物分級分離和純化成高純度化合物。
盡管在文獻中描述了分離類黃酮化合物的層析方法，但是它們主要為了分析目的而設計。以前還不知道使用Stack Pack柱純化酶-轉化的類黃酮化合物(蕓香苷、異槲皮苷和櫟精混合物)，該Stack Pack柱將處理5-50升提取物。
如實施例9中所示，本發明公開的生物轉化技術還可以將金絲桃中的蕓香苷轉化成異槲皮苷和櫟精。各種其他生物質如銀杏、苜蓿、桑樹葉等以及其他富含蕓香苷的農業生物質如薔薇果、蘋果皮、梨子皮、洋蔥皮和蘆筍尖也含有蕓香苷并且可用于產生富含異槲皮苷的組合物。
櫟精和異槲皮苷由于稀有性和生物利用度/生物效能而要求更高價格。心血管疾病和癌癥預防中櫟精和異槲皮苷增加的生物利用度暗示著轉化的類黃酮化合物產品在營養藥和藥物市場中的光明前景。
實施例5使用酶水解將蕓香苷轉化成異槲皮苷和櫟精通過操縱生物轉化條件，我們能夠將富含類黃酮化合物的中間產物轉化成含有不同組成的蕓香苷/異槲皮苷/櫟精的產物。
實施例2中產生的冷凍干燥的蕓香苷產物(約60％蕓香苷)被用于酶轉化實驗。將5g干燥蕓香苷產物分散于500ml水中(固體∶液體比＝1∶100)。將分散體加熱到80℃并調節pH至4。然后將分散體在50℃平衡，接著加入食品級柚苷酶粉(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd；日本)。
如供應商的說明書中描述的，柚苷酶制品含有150單位β-葡糖苷酶或柚苷酶活性。在該試驗中使用每克蕓香苷66mg Amano柚苷酶的劑量。酶溫育保持在50℃，持續攪拌適當的時間長度。一旦溫育時間完成，通過調節溶液的pH至2.5然后持續攪拌下將溫度加熱到80℃10分鐘使酶失活。80℃10分鐘后，將溶液冷卻到室溫，并調節pH至7。通過噴霧干燥、冷凍干燥或其他適宜的方法將酶轉化的產物干燥。
表4總結了制備含有各種蕓香苷/異槲皮苷/櫟精組成的產物所需的實驗條件。為了方便的原因，此處描述的起始材料先前被冷凍干燥。實施例2中干燥步驟前回收的沉淀(小丸)也適于作為實施例5的起始材料。可在不同階段，即，在類黃酮化合物提取前，水性提取后，預濃縮后，或者沉淀后，應用酶轉化。實施與常規酶處理相同的方法之后，對照(沒有酶)中類黃酮化合物組成(蕓香苷/異槲皮苷/櫟精)保持不變。這表明轉化由柚苷酶的作用導致。
表4使用柚苷酶對類黃酮化合物的酶轉化

實施例6高純度商業蕓香苷轉化成異槲皮苷使用從Sigma化學公司購買的商業蕓香苷(95％純度)，實施類似于實施例5中描述的酶溫育，以將蕓香苷轉化成異槲皮苷。將10.90g蕓香苷分散于1000ml水中。將該分散體加熱到80℃并調節pH到4。然后將分散體在55℃平衡，接著加入2.42g柚苷酶粉。酶溫育保持在55℃，持續攪拌24小時。一旦溫育時間完成，通過調節溶液的pH至2.5然后持續攪拌下將溫度加熱到80℃10分鐘使酶失活。80℃10分鐘后，將溶液冷卻到室溫，并調節pH至7。取出1.0ml提取物等分試樣用于終產物組成的RP-HPLC分析。冷凍干燥剩余的提取物。HPLC結果表明純蕓香苷標準已經被轉化成含有0.12∶1∶0.21(重量比)的蕓香苷/異槲皮苷/櫟精組成的產物。
實施例7擴大轉化從Street Chemicals購買的商業蕓香苷用于類似于實施例6中描述的酶轉化。商業蕓香苷中蕓香苷和異槲皮苷的濃度在圖3A中顯示。將109克蕓香苷分散于4000ml水中。將該分散體加熱到80℃并調節pH到4。然后將分散體在55℃平衡，接著加入24.2g柚苷酶粉。酶溫育保持在55℃，持續攪拌24小時。一旦溫育時間完成，通過調節溶液的pH至2.5然后持續攪拌下將溫度加熱到80℃10分鐘使酶失活。80℃10分鐘后，將溶液冷卻到室溫，并調節pH至7。溶液保存在冰箱(4℃)過夜。將離心回收的固體冷凍干燥。得到61.8g干物質。該產物的層析圖在圖3B中顯示。
實施例8異槲皮苷和櫟精的制備級分離將從實施例7的方法得到的固體(50gm)溶于70％甲醇中并過濾。所得提取物在Waters反相Bondapak C-18，40×310mm(15-20 125)柱上進行制備級層析，柱子用甲醇1％乙酸梯度洗脫，流速為50ml/min，其中使用裝備有Millennium V 2.15軟件控制的486可變波長UV-Vis檢測器的Waters Delta-Prep 4000系統。在280nm檢測目標化合物。用實施例A中描述的分析型HPLC方法評價所收集的級分的純度。異槲皮苷的產率為起始材料的75％，純度為95％(圖3C)。還從一個制備性HPLC級分回收了少量純櫟精。可以通過從熱甲醇重結晶進一步提高制備性HPLC級分的純度。
實施例9從金絲桃提取物轉化蕓香苷將幾個金絲桃朔果的內容物合并，分散在水中，并實施類似于實施例5中描述的酶溫育。已知金絲桃含有蕓香苷。該實驗的目的在于將金絲桃提取物中的蕓香苷轉化成異槲皮苷。將5.52g金絲桃提取物分散在500ml水中。加熱分散體到80℃并調節pH到4。然后將分散體在55℃平衡，接著加入0.60g柚苷酶粉。酶溫育保持在55℃，持續攪拌24小時。一旦溫育時間完成，通過調節溶液的pH至2.5然后持續攪拌下將溫度加熱到80℃10分鐘使酶失活。80℃10分鐘后，將溶液冷卻到室溫，并調節pH至7。然后冷凍干燥提取物。將干燥產物溶于甲醇，過濾并通過RP-HPLC分析以確定蕓香苷向異槲皮苷轉化的程度。初始金絲桃提取物的HPLC結果表明蕓香苷/異槲皮苷/櫟精組成為0.47∶1∶0.21(重量比)。發現酶轉化的產物含有的蕓香苷/異槲皮苷/櫟精組成為痕量∶1∶0.18(重量比)，這表明初始提取物中存在的所有蕓香苷已經被轉化成異槲皮苷和櫟精。
實施例10使用柚苷酶和D-Δ-葡糖酸內酯將蕓香苷大規模轉化成異槲皮苷將來自ICN的藥物級蕓香苷(38.15g)分散在3.5L去離子水中。制備柚苷酶(8.47g溶于100ml水)和D-Δ-葡糖酸內酯(6.23g溶于100ml水)溶液。將D-Δ-葡糖酸內酯溶液加到蕓香苷∶水混合物中。該混合物的pH為4.0。然后加熱混合物到80℃并溫育2小時。降溫到55℃并加入柚苷酶溶液。攪拌下55℃溫育混合物24小時。為了終止反應，降低pH到2.5并加熱混合物到80℃10分鐘。讓混合物冷卻到室溫然后調節pH至7.0。然后過夜冷藏混合物以誘導沉淀形成，并讓沉淀沉降。離心收集沉淀并將其冷凍干燥(PPT1級分)。將上清液濃縮然后再次離心。所得沉淀也被冷凍干燥(PPT2級分)。以該方式制備三批。通過HPLC分析來自每批的不同級分中的蕓香苷、異槲皮苷和櫟精。數據在表5中給出。
表5中的數據表明蕓香苷和櫟精表現為次要組分，而異槲皮苷是酶轉化后所觀察到的主要產物。例如，從通過實施例10的方法處理的三批產生了共77.72g異槲皮苷和0.53g櫟精。異槲皮苷的大部分(61.8g)出現在PPT1級分中。該轉化方法非常有效，因為通過該方法僅剩下0.2009g蕓香苷未被轉化。該數據還表明將抑制劑D-Δ-葡糖酸內酯包含在反應混合物中可以選擇性地導致主要產生一種類型的類黃酮化合物，即異槲皮苷。
PPT1級分中異槲皮苷濃度的平均值為85.2％(范圍為81.1-88.8％)。因此，該實施例還表明使用簡單的生化純化技術可以得到高純度(＞80％)生物可利用的類黃酮化合物，而不需層析方法。上清液(SUP)級分也是有價值的，因為它們每101.66g干物質含有14.42g異槲皮苷。
表5使用柚苷酶和作為選擇性抑制劑的D-Δ-葡糖酸內酯對類黃酮化合物的酶轉化

實施例11從蕎麥葉材料提取、轉化和純化蕓香苷將1kg ManCan葉材料在10L 70％甲醇中50℃下提取3小時。3小時后，過濾混合物并用約4L熱70％甲醇洗滌植物材料。合并濾液并用旋轉蒸發器減小體積直到體積為原來體積的1/5。冷藏濃縮的提取物并讓其過夜沉淀。攪拌混合物，然后將其離心以收集蕓香苷。
基于前面的分析，估計1kg起始葉材料中蕓香苷含量為33.66g。所用的酶和抑制劑的量基于這些估計，并且類似于前面的轉化(7.36g柚苷酶；6.23g D-Δ-葡糖酸內酯；3.5L水)。
將蕓香苷沉淀加入3.5L水，并加入D-Δ-葡糖酸內酯溶液。混合物的pH為4.0。然后將混合物加熱到80℃并溫育2小時。將混合物冷卻到55℃并加入柚苷酶溶液。然后在55℃溫育混合物24小時。降低pH到2.5并之后80℃溫育10分鐘以終止反應。讓混合物冷卻到室溫然后調節pH至7.0。然后將混合物置于4℃過夜以容許沉淀形成。通過如實施例10中的離心收集沉淀。
攪拌下將沉淀溶于55℃甲醇。過濾溶液除去不溶物質。然后盡可能地濃縮濾液，但不讓混合物在濃縮容器中產生氣泡。此時，將1.5L熱水加入混合物，通過在4℃溫育2天重新沉淀物質，通過離心收集沉淀。然后將重新沉淀的物質用熱水洗滌并第三次沉淀。將最終的沉淀物冷凍干燥形成終產物。
方法和實施例的注釋在Waters對稱C-18柱(3.0.×.150mm，5微米)上通過反相高效液相層析(RP-HPLC)，用水性0.05％v/v三氟乙酸(TFA)∶乙腈(T＝0min，％乙腈＝10；T＝20min，％乙腈＝40；T＝30min，％乙腈＝10)的線性梯度洗脫，流速0.4mL/min，使用光電二極管陣列(PDA)檢測器在350nm確定蕎麥類黃酮化合物含量。通過使用商業途徑購買的蕓香苷、異槲皮苷和櫟精標準制作外標準曲線以定量類黃酮化合物。
通過Minami等人(1998)描述的方法，通過溶劑提取出生物質中的蕓香苷并以HPLC方法測定蕓香苷。將1g生物質(通過100目篩)用40ml甲醇在70℃下在Soxhelt提取裝置中提取60分鐘。離心后的上清液用于測定。
如圖4中概述，本發明提供了從含有蕓香苷的植物生物質提取、濃縮和沉淀富含蕓香苷的組合物，和使用方法A將蕓香苷酶轉化成富含異槲皮苷/櫟精的組合物，或者備選地，產生富含異槲皮苷的產物。本發明的方法A和B的兩種產物都可以用作健康食品、營養藥、藥物、化妝品和其他市場的添加劑。
前面的描述被考慮為僅用于舉例闡明本發明的原理。此外，由于本領域技術人員將容易實施許多改變和修改，故不打算將本發明限制在所顯示和描述的精確結構和實施方法中，因此，結構或實施方法中可以采取的所有這些適宜的改變和修改都將落在所要求的本發明的范圍內。
權利要求
1.富含異槲皮苷的組合物，其通過包括如下步驟的方法制備提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶的酶制品加入溶液；在溫育期保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變為不適于所述酶溫育的條件而終止溫育期；其中通過調節溫育期的持續時間控制組合物中的異槲皮苷的比例。
2.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中作為酶溫育的結果，該組合物還富含櫟精。
3.權利要求2的富含異槲皮苷的組合物，其中通過調節溫育期的持續時間控制櫟精和異槲皮苷的相對比例。
4.權利要求2的富含異槲皮苷的組合物，其中溫育期的持續時間取決于酶制品的活性。
5.權利要求2的富含異槲皮苷的組合物，其中溫育期的持續時間為1到48小時。
6.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中酶溫育過程中溶液的條件包括溫度和pH水平。
7.權利要求6的富含異槲皮苷的組合物，其中溫度為50-55℃。
8.權利要求6的富含異槲皮苷的組合物，其中pH為4-8。
9.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中溶液的條件為酸性pH和基本上80℃的溫度。
10.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中蕓香苷與異槲皮苷的比例按重量計小于20∶1。
11.權利要求2的富含異槲皮苷的組合物，其中櫟精與異槲皮苷的比例按重量計大于0.003∶1。
12.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中所述方法還包括在所述溫育期終止后純化所述溶液。
13.權利要求12的富含異槲皮苷的組合物，其中所述溫育期終止后所述溶液的純化使用常規生物化學純化法實施。
14.利用常規生物化學純化方法處理權利要求1的富含異槲皮苷的組合物制備的含有按重量計至少90％異槲皮苷的純化的異槲皮苷組合物。
15.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中從商業來源得到富集或純化形式的蕓香苷。
16.權利要求1的富含異槲皮苷的組合物，其中通過權利要求53的方法得到蕓香苷。
17.含有根據權利要求1的方法制備的異槲皮苷的富含異槲皮苷的組合物，所述組合物具有包括血管緊張肽-轉化酶抑制性質、消炎性質、抗腫瘤性質、抗病毒性質、抗氧化性質、自由基清除性質、癌癥預防性質、心臟保護性質、蛋白酶抑制性質、蛋白激酶C抑制性質、酪氨酸蛋白激酶抑制性質、拓撲異構酶II抑制性質和蛋白切割酶抑制性質的生物活性性質。
18.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物的生物活性性質用于預防和治療疾病和健康問題，所述疾病和健康問題包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化癥、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
19.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于功能食品。
20.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于天然健康產品。
21.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于營養藥產品。
22.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于藥品。
23.權利要求17的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于化妝品。
24.富含異槲皮苷的組合物，其通過包括如下步驟的方法制備提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶的酶制品加入溶液；在溫育期保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變為不適于酶溫育的條件終止溫育期；其中通過調節溫育期的持續時間控制組合物中的異槲皮苷的比例。
24.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中通過調節溫育期的持續時間控制異槲皮苷的產率。
25.權利要求24的方法，其中溫育期的持續時間為1-48小時。
26.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中通過向溶液中加入β-D-葡糖苷酶抑制劑控制蕓香苷、櫟精和異槲皮苷的相對比例。
27.權利要求26的富含異槲皮苷的組合物，其中在將所述酶制品加入溶液之前將所述β-D-葡糖苷酶抑制劑加入溶液。
28.權利要求26的富含異槲皮苷的組合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑具有D-Δ-葡糖酸內酯的性質。
29.權利要求28的富含異槲皮苷的組合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑為D-Δ-葡糖酸內酯。
30.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中酶制品含有α-L-鼠李糖苷酶。
31.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中酶溫育過程中溶液的條件包括溫度和pH水平。
32.權利要求31的富含異槲皮苷的組合物，其中溫度為50-55℃。
33.權利要求31的富含異槲皮苷的組合物，其中pH為4-8。
34.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中酶溫育過程中溶液的條件包括加入β-D-葡糖苷酶抑制劑。
35.權利要求34的富含異槲皮苷的組合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑具有D-Δ-葡糖酸內酯的性質。
36.權利要求25的富含異槲皮苷的組合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑為D-Δ-葡糖酸內酯。
37.權利要求35的方法，其中D-Δ-葡糖酸內酯的濃度大于1mM。
38.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其還包括通過變性酶α-L-鼠李糖苷酶終止溫育期。
39.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中從商業來源得到富集的或純化形式的蕓香苷。
40.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中通過權利要求53的方法得到蕓香苷。
41.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中蕓香苷與異槲皮苷的比例按重量計小于20∶1。
42.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中櫟精與異槲皮苷的比例按重量計大于0.003∶1。
43.權利要求24的富含異槲皮苷的組合物，其中所述方法還包括所述溫育期終止后純化所述溶液。
44.權利要求43的富含異槲皮苷的組合物，其中所述溫育期終止后所述溶液的純化使用常規生物化學純化法實施。
45.利用常規生物化學純化方法處理權利要求24的富含異槲皮苷的組合物制備的含有按重量計至少90％異槲皮苷的純化的異槲皮苷組合物。
47.含有根據權利要求1的方法制備的異槲皮苷的富含異槲皮苷的組合物，所述組合物具有包括血管緊張肽-轉化酶抑制性質、消炎性質、抗腫瘤性質、抗病毒性質、抗氧化性質、自由基清除性質、癌癥預防性質、心臟保護性質、蛋白酶抑制性質、蛋白激酶C抑制性質、酪氨酸蛋白激酶抑制性質、拓撲異構酶II抑制性質和蛋白切割酶抑制性質的生物活性性質。
47.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物的生物活性性質用于預防和治療疾病和健康問題，所述疾病和健康問題包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
48.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于功能食品。
49.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于天然健康產品。
50.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于營養藥產品。
51.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于藥品。
52.權利要求46的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于化妝品。
53.從含有蕓香苷的生物質制備富含蕓香苷的組合物的方法，該方法包括使用含有水或醇的水性溶液對生物質實施類黃酮化合物提取步驟；過濾該溶液以產生提取溶液；容許提取溶液靜置從而形成沉淀；收集并干燥沉淀以形成富含蕓香苷的組合物。
54.權利要求53的方法，其中類黃酮化合物提取步驟包括打碎生物質并在水性溶液中攪拌。
55.權利要求53的方法，其還包括在靜置提取溶液之前濃縮提取溶液以形成體積小于其原始體積的1/5的濃縮提取溶液。
56.權利要求55的方法，其中使濃縮的提取溶液在低于10℃的溫度下靜置。
57.權利要求53的方法，其中水性溶液含有水并且保持在高于30℃的溫度。
58.權利要求53的方法，其中水性溶液含有醇。
59.權利要求58的方法，其中水性溶液具有按體積計濃度大于20％的醇，并且溶液的其余部分為水。
60.權利要求59的方法，其中水性溶液具有按體積計濃度50％到100％的醇，并且溶液的其余部分為水。
61.權利要求59的方法，其中提取過程中水性溶液的溫度保持在30℃到99℃。
62.權利要求53的方法，其中植物生物質含有來自蕎麥屬成員的生物質。
63.權利要求53的方法，其中生物質含有金絲桃葉、銀杏、bilola、苜蓿、桑樹、藻類、蘋果皮、梨子皮、洋蔥皮、蘆筍尖及薔薇果果皮中的至少一種。
64.含有根據權利要求53的方法制備的蕓香苷的富含類黃酮化合物的組合物，所述組合物具有包括血管緊張肽-轉化酶抑制性質、消炎性質、抗腫瘤性質、抗病毒性質、抗氧化性質、自由基清除性質、癌癥預防性質、心臟保護性質、蛋白酶抑制性質、蛋白激酶C抑制性質、酪氨酸蛋白激酶抑制性質、拓撲異構酶II抑制性質和蛋白切割酶抑制性質的生物活性性質。
65.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物的生物活性性質用于預防和治療疾病和健康問題，所述疾病和健康問題包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
66.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物用于功能食品。
67.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物用于天然健康產品。
68.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物用于營養藥產品。
69.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物用于藥品。
70.權利要求64的富含類黃酮化合物的組合物，其中所述組合物用于化妝品。
71.產生富含異槲皮苷的組合物的方法，所述方法包括提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶的酶制品加入溶液；在溫育期保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變為不適于所述酶溫育的條件終止溫育期，所述溶液在此時為富含異槲皮苷的組合物；其中通過調節溫育期的持續時間控制組合物中異槲皮苷的比例。
72.權利要求71的方法，其中作為所述酶溫育的結果，所述組合物還含有櫟精。
73.權利要求72的方法，其中通過調節溫育期的持續時間控制櫟精和異槲皮苷的相對比例。
74.權利要求71的方法，其中溫育期的持續時間取決于酶制品的活性。
75.權利要求71的方法，其中溫育期的持續時間為1-48小時。
76.權利要求71的方法，其中酶溫育過程中溶液的條件包括溫度和pH水平。
77.權利要求76的方法，其中溫度為50-55℃。
78.權利要求76的方法，其中pH為4-8。
79.權利要求71的方法，其中溶液的條件為酸性pH和基本上80℃的溫度。
80.權利要求71的方法，其中蕓香苷與異槲皮苷的比例按重量計小于20∶1。
81.權利要求80的方法，其中櫟精與異槲皮苷的比例按重量計大于0.003∶1。
82.權利要求71的方法，其還包括終止所述溫育期后純化所述溶液。
83.權利要求82的方法，其中終止所述溫育期后所述溶液的純化使用常規生物化學純化法實施。
84.通過權利要求83的方法生產的產品，其為純化的異槲皮苷。
85.含有根據權利要求71的方法產生的異槲皮苷的富含異槲皮苷的組合物，所述組合物具有包括血管緊張肽-轉化酶抑制性質、消炎性質、抗腫瘤性質、抗病毒性質、抗氧化性質、自由基清除性質、癌癥預防性質、心臟保護性質、蛋白酶抑制性質、蛋白激酶C抑制性質、酪氨酸蛋白激酶抑制性質、拓撲異構酶II抑制性質和蛋白切割酶抑制性質的生物活性性質。
86.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物的生物活性性質用于預防和治療疾病和健康問題，所述疾病和健康問題包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化癥、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
87.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于功能食品。
88.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于天然健康產品。
89.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于營養藥產品。
90.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于藥品。
91.權利要求85的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于化妝品。
92.產生富含異槲皮苷的組合物的方法，所述方法包括提供處于適于酶溫育的條件下的其中懸浮有蕓香苷的溶液；將含有柚苷酶的酶制品加入溶液；在溫育期保持適于酶溫育的溶液條件；通過將溶液的條件改變為不適于酶溫育的條件終止溫育期；其中通過調節溫育期的持續時間控制組合物中的異槲皮苷的比例。
93.權利要求92的方法，其中通過調節溫育期的持續時間控制異槲皮苷的產率。
94.權利要求92的方法，其中溫育期的持續時間為1到48小時。
95.權利要求92的方法，其還包括向溶液中加入β-D-葡糖苷酶抑制劑以控制溶液中蕓香苷、櫟精和異槲皮苷的相對比例。
96.權利要求95的方法，其中在將所述酶制品加入溶液之前將所述β-D-葡糖苷酶抑制劑加入溶液。
97.權利要求95的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑具有D-Δ-葡糖酸內酯的性質。
98.權利要求97的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑為D-Δ-葡糖酸內酯。
99.權利要求92的方法，其中酶制品含有α-L-鼠李糖苷酶。
100.權利要求92的方法，其中酶溫育過程中溶液的條件包括溫度和pH水平。
101.權利要求100的方法，其中溫度為50-55℃。
102.權利要求100的方法，其中pH為4-8。
103.權利要求92的方法，其中酶溫育過程中溶液的條件包括加入β-D-葡糖苷酶抑制劑。
104.權利要求103的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑具有D-Δ-葡糖酸內酯的性質。
105.權利要求104的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制劑為D-Δ-葡糖酸內酯。
106.權利要求105的方法，其中D-Δ-葡糖酸內酯的濃度大于1mM。
107.權利要求92的方法，其還包括通過變性酶α-L-鼠李糖苷酶終止溫育期。
108.權利要求92的方法，其中蕓香苷與異槲皮苷的比例按重量計小于20∶1。
109.權利要求92的方法，其中櫟精與異槲皮苷的比例按重量計大于0.003∶1。
110.權利要求92的方法，其還包括終止所述溫育期后純化所述溶液。
111.權利要求110的方法，其中終止所述溫育期后所述溶液的純化使用常規生物化學純化法實施。
112.按照權利要求111的方法生產的產品，其為純化的異槲皮苷。
113.含有按照權利要求92的方法產生的異槲皮苷的富含異槲皮苷的組合物，所述組合物具有包括血管緊張肽-轉化酶抑制性質、消炎性質、抗腫瘤性質、抗病毒性質、抗氧化性質、自由基清除性質、癌癥預防性質、心臟保護性質、蛋白酶抑制性質、蛋白激酶C抑制性質、酪氨酸蛋白激酶抑制性質、拓撲異構酶II抑制性質和蛋白切割酶抑制性質的生物活性性質。
114.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物的生物活性性質用于預防和治療疾病和健康問題，這些疾病和健康問題包括，但不限于心血管疾病、中風、毛細血管脆性、動脈硬化、創傷、氧化應激、高血壓、升高的膽固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相關失調、阿爾茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌癥。
115.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于功能食品。
116.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于天然健康產品。
117.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于營養藥產品。
118.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于藥品。
119.權利要求113的富含異槲皮苷的組合物，其中所述組合物用于化妝品。
全文摘要
從植物生物質制備富含蕓香苷的組合物的方法包括用水性溶液提取，和沉淀。酶制品如柚苷酶被用于將蕓香苷轉化成具有更高價值的組合物，該組合物含有增加比例的異槲皮苷和櫟精。
文檔編號A61Q19/08GK1685053SQ03822616
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月23日 優先權日2002年9月23日
發明者P·R·昌, A·繆爾 申請人:加拿大農業部