用于免疫療法的組合物和方法
【專利說明】用于免疫療法的組合物和方法
[0001 ]優先權
[0002] 本申請要求2013年6月24日提交的美國臨時申請No. 61/838,547和2014年3月6日 提交的美國臨時申請No. 61 /948，916的權益和優先權，其在此通過引用整體并入。 發明領域
[0003] 本發明涉及用于免疫療法的組合物(包括藥物組合物)及方法。
【背景技術】
[0004] 抗原呈遞細胞（APC)是一種加工和呈現在其表面上與主要組織相容性復合物 (MHC)蛋白復合的抗原肽的細胞。效應細胞，諸如T細胞，可使用受體諸如T細胞受體(TCR)識 別這些肽-MHC (pMHC)復合物。
[0005] 樹突細胞(DC)是一種抗原呈遞細胞的實例，其可被刺激以有效呈遞抗原并支持免 疫效應細胞擴增，從而激活對抗原的細胞毒反應。在一些免疫療法中，DC是從患者收集到的 并用抗原脈沖或用病毒載體轉染。在輸回所述患者后，這些激活的細胞呈遞腫瘤抗原至效 應淋巴細胞(如CD4+T細胞、CD8+T細胞和B細胞）。如果適當進行，該療法可起始針對表達抗原 (包括腫瘤抗原)細胞的細胞毒反應。
[0006] 然而，DC免疫療法，如許多免疫療法面臨顯著的限制。例如，接種的癌癥患者中離 體可檢測的強且抗原特異性T細胞反應與僅較弱的臨床反應存在差異。JanikashviIi N等， Personalized dendritic cell-based tumor immunotherapy.Immunotherapy 2010年I月 I 日；2(1):57。
[0007] 仍然需要有效用于包括抗原特異性免疫療法的免疫療法的組合物(包括貨架穩定 的藥物組合物)和方法。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明提供用于免疫療法的組合物和方法，其包括用于在患者中誘導抗原特異性 T細胞的貨架穩定的藥物組合物。此類組合物用于治療例如，癌癥和傳染病。在一些方面，所 述組合物是人工抗原呈遞細胞(aAPC)，其包括在其表面上具有抗原呈遞復合物和任選的T 細胞共刺激信號的藥學上可接受的珠粒或顆粒，以向患者提供在適當的情況下呈遞一種或 多種抗原(如，一種或多種腫瘤抗原）的分子復合物以激活抗原特異性T細胞。所述珠粒或顆 粒經設計提供藥效動力學優勢，包括循環特性、生物分布和降解動力學，以及活性。此類參 數包括尺寸、表面電荷、聚合物組成、配體綴合化學、配體密度等。
[0010]在一些實施方案中，T細胞共刺激信號是抗-CD28抗體或其部分，其可包含人重鏈 氨基酸序列，包括選自IgG、IgD、IgA或IgM同種型的序列。在一些實施方案中，免疫球蛋白序 列包括人IgG恒定和可變序列。框架(FW)序列可經修飾含有重要或所需的鼠科框架殘基以 維持一個或多個抗原結合位點的完整性。互補決定區（CDR)可基于鼠科抗體氨基酸序列 (如，9.3mAb)，或其它⑶28結合序列，其中許多是已知的。在一些實施方案中，所述抗體重鏈 是人IGHV4(如，IGHV4-59)種系FW的變體。在一些實施方案中，所述抗體包含輕鏈且所述輕 鏈是人IGKV4-01FW的變體。所述抗體可包含恒定區，且所述恒定區可為人IgG4或其變體。 [0011]所述共刺激分子可綴合至具有抗原呈遞分子復合物的固體支撐物，以誘導抗原特 異性T細胞。抗原呈遞分子復合物可包括I類MHC和/或II類復合物，或其包含抗原結合槽的 部分。在一些實施方案中，所述分子復合物包含一個或多個HLA氨基酸序列（如，包含HLA的 胞外結構域或其抗原呈遞部分），其可包含另外的序列，諸如免疫球蛋白序列，或其它二聚 化序列或穩定序列。在一些實施方案中，HLA-Ig二聚化融合物提供穩定性和/或結合親和力 方面的優勢。
[0012]因此，在一些實施方案中，本發明提供用于呈遞抗原至T細胞的珠粒-或顆粒-綴合 的分子復合物，其中所述復合物包含形成I類或II類抗原結合槽的氨基酸序列或其部分。所 述抗原呈遞復合物的氨基酸序列可包括與異源序列的融合物，以提供例如穩定性、親和力 和空間優勢。在一些實施方案中，所述異源序列包括免疫球蛋白序列。在一些實施方案中， 所述分子復合物包括融合至異源序列諸如免疫球蛋白序列的HLA(如，HLA-A2)氨基酸序列。 在一些實施方案中，所述免疫球蛋白包含人重鏈免疫球蛋白序列（如，IGVH4)，其可包括免 疫球蛋白恒定序列以提供二聚體HLA，和可任選地包含可變區序列。所述可變序列如果存在 可被任選地修飾以減少或消除潛在的抗原結合并且任選地無鼠科FW殘基。所述HLA氨基酸 序列可為HLA-A*02:01 aMGT登記號HLA00005)或其衍生物。
[0013] T細胞共刺激配體和/或抗原呈遞復合物（以及本文所述的其它配體，包括靶向配 體)可綴合至固體支撐物用于離體或體內抗原呈遞和抗原特異性T細胞激活。在一些實施方 案中，所述固體支撐物是具有用于偶聯配體的表面官能團的珠粒或顆粒(如，PLGA或PLGA-PEG顆粒）。所述顆粒經設計提供藥效動力學優勢，包括循環特性、生物分布和降解動力學以 及活性。此類參數包括尺寸、表面電荷、聚合物組成、配體綴合化學、配體密度等。
[0014] 在各個實施方案中，所述藥物組合物可另外包含用于呈遞至T細胞且可與配體綴 合的珠粒或顆粒共同配制的抗原肽。在各個實施方案中，所述藥物組合物是貨架穩定的，并 且可以在施用前復溶的凍干形式提供，或替代地以另一種施用給患者的便利形式(如，通過 腸胃外施用)提供。
[0015] 本文所述的藥物組合物通過向有需要的患者施用有效量的組組合物用于免疫療 法，例如，用于誘導抗原特異性細胞毒性T細胞形成的方法。具體而言，抗原呈遞平臺可用于 治療傳染病、癌癥或自身免疫性疾病患者，或者向免疫抑制患者提供預防性保護。
[0016] 本發明還提供編碼本文所述的氨基酸序列的多核苷酸，以及表達本文所述的氨基 酸序列的宿主細胞。
[0017]本發明通過以下非限制性實例進一步說明。
[0018] 本發明的細節示于以下隨附的說明書和權利要求書中。盡管與本文所述那些方法 和材料類似的方法和材料可用于本發明的實踐或測試中，但現在描述說明性方法和材料。 本發明的其它特征、目標和優勢將通過說明書和權利要求書變得顯而易見。除非上下文另 外明確說明，否則在說明書和隨附權力要求書中，單數形式還包括復數形式。除非另外定 義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬的領域普通技術人員通常所理 解相同的含義。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1-3顯示了抗-⑶28的三條人源化可變重序列。
[0021]圖4-6顯示了抗-⑶28的三條人源化可變輕序列。
[0022]圖7顯示了經修飾的恒定重序列。
[0023] 圖8顯示了恒定κ輕序列。
[0024]圖9顯示了用于構建HLA融合物的人源化非⑶28-結合可變區。
[0025] 圖10顯示了人源化HLA-IgG4HC的氨基酸序列。
[0026]圖11顯示了輕鏈3 (LC3或Vk3 )的氨基酸序列。
[0027]圖12顯示了重鏈I(HCl)的氨基酸序列。
[0028]圖13顯示了重鏈2(HC2)的氨基酸序列。
[0029] 圖14-16顯示了用于在STABLEFAST-NSO細胞系中表達的表達構建體。
[0030] 圖17顯示了人源化抗-⑶28mAb不是超激動劑。
[0031]圖18顯示了人源化抗-CD28克隆特異性染色人T-細胞系上的⑶28。圖18(A):用鼠 科抗-人〇)811^13(克隆9.3，同種型1862&)染色；圖18(8) :用人源化抗-0028(同種型1864)染 色。
[0032] 發明詳述
[0033]以下縮寫可在全文中使用:BLAST-基本局部比對搜索工具，CDR-互補決定區，Ck-k 輕鏈恒定區，Fc-抗體片段可結晶區，Fw-(可變區的）框架區，HLA-人白細胞抗原，MHC-主要 組織相容性復合物，VH-可變重鏈，Vk-可變κ輕鏈及V區-抗體可變區，VH或Vk。
[0034]本發明提供用于免疫療法的組合物和方法，其包括用于在患者中誘導抗原特異性 T細胞的貨架穩定的藥物組合物。在一些實施方案中，所述組合物包含二聚體HLA抗原呈遞 復合物。在一些實施方案中，所述組合物包含人源化免疫球蛋白序列或其部分，其可用作人 工抗原呈遞細胞(aAPC)上配體的組分，以向患者提供二聚體分子復合物用于呈遞一種或多 種抗原（如，一種或多種腫瘤抗原）和任選的一種或多種共刺激信號。如下更詳述的抗原呈 遞平臺可基于人工固體支撐物，諸如藥學上可接受的支撐物(包括膠乳或聚合物珠粒或顆 粒)。
[0035]在一些實施方案中，所述T細胞共刺激信號是抗-CD28抗體或其部分。在一些實施 方案中，所述抗-CD28抗體包含選自1861、1862、1863、1864、18〇、以4或181的至少一種人免 疫球蛋白同種型的序列。例如，所述抗-CD28抗體可為IgG同種型，并且可含有一種或多種 IgG種系框架序列的序列。例如，所述抗-CD28可含有人IGHV4重鏈氨基酸序列，其可被修飾 以具有一至十五個氨基酸修飾。所述修飾可包括鼠科框架殘基以支持一個或多個抗原結合 位點的完整性。
[0036]在一些實施方案中，互補決定區（⑶R)基于鼠科抗體氨基酸序列，其可任意地包含 一至十個、諸如一至五個氨基酸修飾。在一些實施方案中，一個、兩個、三個或多個⑶R基于 小鼠9.3mAb(Tan等.J.Exp.Med. 1993177:165)，其可公開獲得。示例性CDR示于圖1-6中。在 一些實施方案中，所述抗體具有全套的重鏈和/或全套的輕鏈⑶R(9.3mAb)。例如，在一些實 施方案中，所述重鏈可變區含有一個、兩個或三個以下CDR，其可各自任選地被一個、兩個或 三個氨基酸取代、缺失或添加修飾<01?1(0￥6￥!1)、001?2(￥1'^666了階-41^3)和001?3 (DKGYSYYYSMDY)。在一些實施方案中，所述輕鏈可變區含有一個、兩個或三個以下CDR，其各 自可被一個、兩個或三個氨基酸取代、缺失或添加修飾：CDR1(RASESVEYYVTSLMQ)、CDR2 (AASNVES)和CDR3(QQSRKVPYT)。
[0037]可替代的CDR序列、可變區或CD28-結合配體可用于各種實施方案中。可替代的配 體和抗體描述于美國專利7,612,170、美國專利6,987,171和美國專利6,887,466中，例如， 并且這些公開內容在此通過引用整體并入。
[0038]在一些實施方案中，所述抗體重鏈包含人IGHV4-59種系框架(FW)的變體，其經修 飾包括5至15個鼠科FW殘基。在一些實施方案中，所述抗體包含輕鏈氨基酸序列，并且所述 輕鏈序列可為人IGKV4-01FW序列的變體，并且其可經修飾包括3至15個鼠科FW殘基。
[0039] 所述抗-CD28人重鏈序列可經修飾，例如，以在位置1、3、6、37、48、67、71、73、76、 78、82、82a和82c(基于Kabat編號）處包含一個或多個(如，2個或更多個、3個或更多個、4個 或更多個、5個或更多個或所有）鼠科Fw殘基。在這些位置處的鼠科Fw殘基可如9.3mAb中一 樣。所述輕鏈可經修飾以在位置3、4、49、70、85、87和80包含一個或多個(如，2個或更多個、3 個或更多個、4個或更多個、5個或更多個或所有）鼠科Fw殘基。所選的鼠科Fw殘基可支持抗 原-結合位點的完整性。人源化抗-CD28抗體維持對CD28的親和力和9.3mAb的T細胞共刺激 活性，并且為至少40%、50%、75%、80%、90%，并且在一些實施方案中，與9.3mAb相比，對 于CD28結合100%或更有效。在各個實施方案中，所述抗-CD28mAb不是超激動劑。
[0040]所述抗體可包含恒定區并且所述恒定區可為任何同種型。在一些實施方案中，所 述抗體恒定區是人IgG4或其變體。在一些實施方案中，所述恒定區包含一個或多個鉸鏈穩 定突變，其可被引入至CH鏈中（如，S241，其可被P取代）。在一些實施方案中，所述抗體包含 恒定區，并且所述恒定區包含一個或多個適于化學偶聯所述抗體至固體支撐物的突變。所 述一個或多個適于偶聯的突變可產生氨基酸側鏈官能團（如，硫醇、胺或羥基），諸如未配對 的半胱氨酸（如，在S473處）。對恒定區的其它變化包括那些減少Fc γ受體結合的修飾。例 如，所述CH鏈可在L248處修飾，如，L248E。
[0041 ]在一些實施方案中，所述抗體是抗體片段，諸如F(ab '）2或Fab，或者為單鏈抗體或 其它抗原-結合抗體片段。例如，所述抗體片段可為本文所述的人源化mAb或其它抗-CD28的 單鏈可變片段。
[0042] 在一些實施方案中，所述共刺激分子是單鏈可變片段(scFv)，其包含由抗CD28mAb 諸如本文所述的抗體的VH和VL鏈形成的抗原結合環，或基本上由由抗CD28mAb諸如本文所 述的抗體的VH和VL鏈形成的抗原結合環組成。scFv抗體構建體可包含通過短肽連接子以 頭-頭或頭-尾構象連接在一起的一條或若干條(2、