專利名稱：化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于采用免疫治療法治療腫瘤的技術領域，特別是涉及 一種蛋氨酸腦啡肽在體內注射和體外細胞培養條件下對腸癌、胰腺癌細胞進行 治療，以達到治療目的的方法。
背景技術：
1975年Hughes等人從豬腦抽提液中分離的、具有內源性嗎啡 樣活性的蛋氨酸腦啡肽(methionine enk印halin， MEK)。后來研究發現是由 腎上腺產生的前激素和前腦啡肽衍生來，釋放入血，由酪-甘-甘-苯丙-蛋氨酸 五個氨基酸構成的五肽。正常體內含量極低，每毫升血漿50-150pg。 1975年 被首次發現蛋氨酸腦啡肽具有免疫調節作用。白細胞包括有粒白細胞(中性 粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞)無粒白細胞(淋巴細胞，單核細胞). 正常的T淋巴細胞，巨噬細胞，自然殺傷細胞(NK)含有MEK受體， 一些的腫 瘤細胞如胰腺癌細胞和腸癌細胞也含有MEK受體。近年來研究證明蛋氨酸腦 啡肽對免疫系統真有如下作用增加淋巴細胞數量和活性，增加CD2， CD4， CD8 等受體分子的表達，增加T細胞玫瑰花節形成百分率，增加NK細胞數量活性， 增加有絲分裂素誘導的細胞增殖，增加Y-干擾素，白介素和腫瘤壞死因子等 多種細胞因子的產生，增加單核細胞(巨噬細胞)和中性粒細胞的趨化作用， 對樹突狀細胞的成熟和活性有明顯的促進作用，同時與癌細胞受體結合可以誘 導腫瘤細胞調亡。我們的研究也證明了上述部分結果。雖然蛋氨酸腦啡肽具有 顯著的免疫調節作用，誘導腫瘤細胞凋亡作用，但如何對胰腺癌和腸癌腫瘤 患者加以治療，卻沒有具體方法，更沒有人類治療胰腺癌和腸癌的報道。
我們采用化合物蛋氨酸腦啡肽用于治療腸癌、胰腺癌患者的方法與實際例 子及療效，目前還未見報道。

發明內容
發明目的本發明提供一種化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺 癌藥物的應用，其目的在于解決現有的臨床方法在治療腸癌、胰腺癌方面不能有效和存在的問題。
技術方案本發明是通過以下技術方案實現的
化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應用，所述的蛋氨
酸腦啡肽以0. 0001-10mg/ml制備成注射劑作為治療腸癌、胰腺癌藥物的應用
將上述濃度范圍內的蛋氨酸腦啡肽在體外T淋巴細胞的細胞培養條件中 進行剌激，體外培養的溫度25-38C°范圍、2-7天的時間，使其濃度范圍為 ]0—2 10—'6克分子/升后回輸體內。或者直接采用靜脈注射、皮下注射或肌肉注 射的劑型。
蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細胞的細胞培養條件中與一定濃度的淋巴因 子、如胸腺肽、白細胞介素、干擾素一起使用，蛋氨酸腦啡肽與白細胞介素 的重量比為1: K)0 10000;蛋氨酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1:100 10000。
蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡肽的類似物，如亮氨酸腦啡肽以相
同的方法使用。
優點及效果本發明的特點在于蛋氨酸腦啡肽在體外直接作用于培養條件 下的免疫系統細胞或體內直接注射治療。同時通過與癌細胞受體結合誘導癌細 胞凋亡。用量小，效率高。經蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統細胞具有邊普通方
法激活更高效的免疫細胞增殖數量和細胞活性， 一般應高出5-10倍，特別是T
淋巴細胞數量明顯增加。治療后癌癥患者腫瘤部位明顯縮小或消失。但是，應 當指出，蛋氨酸腦啡肽是一種對免疫系統細胞數量和活性雙向調節劑，僅僅在 一定的濃度范圍內有正向調節作用，超出此范圍及呈現負向調節作用，抑制免 疫系統細胞的生長。
具體實施例方式下面通過具體實施例詳細說明如下 實施例1:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為
0.0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml注射劑。實施例2:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為
0. 0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml的凍干粉針制劑。
給藥方式為通過皮下、靜脈或腹腔注射的方式直接施用于患者。 實施例3:
取正常人靜脈血30毫升，放入含有肝素抗凝劑的試管內(每毫升血液加 入O. 1毫升125-205U)，領取含有淋巴細胞分離液20毫升的試管，將血液輕 輕加到淋巴細胞分離液上，2000轉/分，離心20分鐘，用吸管吸取淋巴細胞 層，用1640培養液洗滌兩次，每次加入30毫升，1500轉/分，5分鐘。調整 細胞濃度為106個/毫升，按下列設計分組培養
(1) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
(2) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—2克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(3) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—5克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(4) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—6克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(5) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(6) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—8克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(7) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(8) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10,克分子/升蛋氨酸腦啡肽的細胞培養液；
(9) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—"克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(10) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10"6克分子/升蛋氨 酸腦啡肽的細胞培養液；
將上述培養放入37。C細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120、 168小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試 驗，檢測陽性百分率(百分率越高，表示T細胞活性越高)，并將120小時的 結果作為最終結果，通過靜脈或腹腔注射的方法回輸患者體內。通過實驗證明， 蛋氨酸腦啡肽在體外培養再回輸體內的方法，只有在此濃度下(10—2 10—16克 分子/升)及這種培養條件(體外培養的溫度25-38C。范圍、2-7天的時間) 才有治療和免疫的效果，其它情況均為無效。
實施例4:
1， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
2， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細胞培養液+ 1毫克小牛胸腺肽；胸腺肽的濃度為1毫克/毫升。
將上述培養放入37'C細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試驗，并 將120小時的結果作為最終結果，將細胞處理后回輸體內。
實施例5:
1， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
2， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細胞培養液+ l毫克白細胞介素；白細胞介素的濃度為2毫克/毫升。
將上述培養放入37t細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試驗，并將120小時的結果作為最終結果，將細胞處理后回輸體內。
在以上實施例的研究基礎上，做以下實驗
蛋氨酸腦啡肽治療腸癌和胰腺癌的試驗 一，腸癌的治療實驗
1. 方法在裸鼠身上移植人HT-29結腸癌細胞制備癌癥模型，每日給蛋氨
酸腦啡肽，劑量20mg/kg。連續21天。
2. 結果85%的小鼠在三周內顯示出腫瘤細胞生長抑制現象，相比之下， 對照組有93%腫瘤發生。
二，胰腺癌的治療實驗
1. 方法接種了人胰腺癌BXPC-3細胞的裸鼠，給蛋氨酸腦啡肽20mg/kg， 每日一次，連續21天。
2. 結果與對照組相比，所有裸鼠出現明顯的腫瘤生長抑制。
三，對胰腺癌患者的治療實驗
白XX:男，45歲，經診斷為急性胰腺癌，未接受任何治療，給蛋氨 酸腦啡肽20mg/kg，每天一次，連續30天。經CT檢查，前后比較，腫瘤 消失，患者自覺癥狀恢復正常。
趙XX:男，54歲，晚期結腸癌肝轉移，目前所有對癥治療都已經無 效，生命垂危，給蛋氨酸腦啡肽20mg/kg，每天一次，連續90天。經CT .檢査，前后比較，腫瘤消失，患者自覺癥狀恢復正常。
實驗結論上述病例，在特定濃度范圍的蛋氨酸腦啡肽加在體內注射 和體外淋巴細胞細胞培養條件下對胰腺癌和腸癌均有明顯的治療作用，有 效率極高。
權利要求
1、化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應用，所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑。
2、 根據權利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結腸癌、胰 腺癌藥物的應用，其特征在于將權利要求l濃度范圍內的蛋氨酸腦啡肽在 體外對培養的T淋巴細胞進行剌激，體外培養的溫度25-38C°范圍、2-7天 的時間，使其濃度范圍為10一2 10—'6'克分子/升后回輸。
3、 根據權利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結腸癌、胰 腺癌藥物的應用，其特征在于將權利要求l濃度范圍內的蛋氨酸腦啡肽， 以靜脈注射、皮下注射或肌肉注射的劑型。
4、 根據權利要求2所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結腸癌、胰腺癌藥物的應用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細胞的細胞培養條 件中單獨或與一定濃度的淋巴因子、如胸腺肽、白細胞介素、干擾素一起使 用，蛋氨酸腦啡肽與白細胞介素的重量比為1: 100 10000;蛋氨酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1: 100 10000。
5、 根據權利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結腸癌、胰腺癌藥物的應用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡肽的類似 物，如亮氨酸腦啡肽以相同的方法使用。
全文摘要
本發明屬于采用免疫治療法治療腫瘤的技術領域，特別是涉及一種蛋氨酸腦啡肽在體內注射和體外細胞培養條件下對腸癌、胰腺癌細胞進行治療，以達到治療目的的方法。所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑或在體外T淋巴細胞的細胞培養條件中進行刺激，使其濃度范圍為10^-2～10^-16克分子/升后回輸體內，或者直接經靜脈、皮下、肌肉注射。本發明的特點在于蛋氨酸腦啡肽在體內或體外直接作用于培養條件下的免疫系統細胞，或癌細胞，用量小，效率高。經蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統細胞具有比普通方法激活更高效的免疫細胞增殖數量和細胞活性，一般應高出5-10倍，特別是T淋巴細胞數量明顯增加。蛋氨酸腦啡肽直接通過受體結合殺傷胰腺癌和腸癌細胞。
文檔編號A61K38/08GK101411865SQ20081022908
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月26日 優先權日2008年11月26日
發明者單風平, 呂昌龍 申請人:單風平