一種具有免疫效果的基因的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種從半滑舌鰨中分離的，與免疫有關的新基因，并進行體外重組表達，獲得重組表達產物、鑒定重組表達產物抗病活性及功能，為半滑舌鰨病害防治及綠色飼料添加劑、抗菌劑提供基因資源和技術方法。本發明基因編碼如下的蛋白質：a)氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2的蛋白質；b)包含a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白質；c)在a)或b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有a)中蛋白質活性的蛋白質。本發明的基因與免疫抗病密切相關，其基因表達量與病原刺激相關，其體外重組蛋白能夠明顯抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌及病毒的增殖，因此，在半滑舌鰨病害防治、綠色飼料添加劑及殺菌劑方面有應用潛力。
【專利說明】一種具有免疫效果的基因
【技術領域】
[0001]本發明屬于功能基因篩選【技術領域】，具體涉及一種從半滑舌鰨中分離的，與免疫有關的新基因，命名為CsghClq基因。
【背景技術】
[0002]半滑舌鰨是我國北方及東南沿海重要的海水養殖魚類，具有較高的經濟價值。其人工養殖年產值已達15-20億元人民幣。然而,近年來隨著海水污染問題的加劇而導致陸地周邊養殖環境的不斷惡化，半滑舌鰨養殖規模的不斷擴大，長期使用具有某種優良性狀魚種進行多代近親繁殖等諸多原因導致半滑舌鰨種質發生退化，抗病力下降。海水中存在大量半滑舌鰨致病菌如鰻弧菌，發光桿菌等，病害嚴重直接導致半滑舌鰨的幼苗成熟率低，給半滑舌鰨養殖業帶來了嚴重影響，現在病害問題已經成為制約半滑舌鰨產業發展的瓶頸之一。為了治療及預防疾病，在傳統養殖實踐中通過在飼料中添加化學藥物來實現，不但大大增加了養殖成本，而且導致了藥物殘留問題嚴重，該問題直接影響了半滑舌鰨的商品質量，降低了成品價值，使養殖業遭受了更多的損失。同時大量使用抗生素類藥物提高了致病微生物的抗藥性，進而使其他的海水魚類養殖業面臨同樣嚴峻的挑戰；因此，開發高效綠色低成本的抗病方法是解決該問題的關鍵所在，對免疫基因的研究成果，可作為高抗病性半滑舌鰨家系的篩選依據。將獲取的免疫相關蛋白進行加工制作成綠色環保高效的新型抗病漁用藥物可作為半滑 舌鰨治療疾病的新突破點。
[0003]魚類是天然免疫和適應性免疫并存的脊椎動物，在魚類對外界刺激及病原生物侵襲的防御反應中，天然免疫起著重要作用。半滑舌鰨的免疫相關基因研究已獲得初步進展。現已完成了對激活免疫反應的部分基因的克隆及表達分析如主要組織相容性抗原(MHC)的IIA、IIB、Ia基因的分子克隆、基因結構及表達分析[Tian-jun Xu, Song-1inChen, Xiang-shan Ji, et al., Fish and Shellfish Immunology, 2009, (27): 192-201] ；Toll樣家族的 TLR9 的分離及表達鑒定[Yan Yu, Q1-wang Zhong, Chun-mei Li, et al.,Fishand Shellfish Immunology, 2009, (26):492-499];半滑舌鰨 TLR 信號通路中重要的信號轉導功能的接頭蛋白髓樣分化分子(MyD88)在不同病原體刺激下的表達模式[沙珍霞，王娜，王啟龍等.中國水產科學，2010，(4):659-670];半滑舌鰨IRF-7基因的克隆及表達分析[劉萬建，史成銀，宋展等.漁業科學進展，2012，(5):39-47];同樣可以直接用于清除病原菌或病原物的免疫反應下游基因如鵝型溶菌酶在不同組織的表達模式也得到了初步研究[Zhen-xia Sha, Q1-1ong Wang, Yang Liu, Fish and ShellfishImmunology, 2012, (32): 914-921]。根據相應的研究結果結合育種方法可以篩選獲得高抗病性半滑舌鰨家系，提高半滑舌鰨養殖經濟效益。然而先前進行的研究多集中于對免疫基因的克隆及表達分析，對于基因的功能性研究還極度匱乏，不利于后續綠色藥物及抗體的開發。
[0004]魚類補體系統是天然免疫系統的關鍵組分,其中，Clq(Complementlq)是補體系統經典途徑的重要識別分子，能夠啟動經典途徑，并且在固有免疫和特異性免疫之間發揮主要的連接作用[Kishore U, Reid KB.1mmunopharmacology, 2000, 49 (1-2): 159-170]。除此以外，眾多含有與補體Clq分子類似的Clq球狀結構域(Clq domain-containingprotein, ClqDC protein)的非補體蛋白分子，共同組成了一個薪新的Clq蛋白家族[Kishore U, Reid KB.1mmunopharmacology, 1999, 42(1-3):15-21 ；Kishore U, GaboriaudC, Waters P, et al.Trends Immunol, 2004，25(10): 551-561]，ClqDC 蛋白包含一些非常重要的信號傳導分子，在適應性免疫調節、炎癥調節和維持機體平衡等方面發揮關鍵作用[Ghebrehiwet B, Hosszu KK, Valentino A, et al.Front Immunol, 2012, 3:52],有些 ClqDC 蛋白可作為藥物開發的重要靶點，具有成為新型治療藥物的潛力。ghClq蛋白是ClqDC蛋白中的一類，在物種中含量豐富，具有非常重要的功能。在魚類中，關于ClqDC蛋白的研究報道很少，關于補體分子ghClq的克隆、表達變化、重組蛋白制備及活性分析則未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種從半滑舌鰨中分離的，與免疫有關的新基因，并進行體外重組表達，獲得重組表達產物、鑒定重組表達產物抗病活性及功能，為半滑舌鰨病害防治及綠色飼料添加劑、抗菌劑提供基因資源和技術方法。
[0006]本發明涉及一種基因(命名為CsghClq),該基因編碼如下的蛋白質:
[0007]a)氨基酸序列為SEQ ID NO:2的蛋白質；
[0008]b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白質；
[0009]c)在a)或b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有a)中蛋白質活性的蛋白質。
[0010]上述的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ；
[0011]本發明還提供用于重組表達上述蛋白的重組質粒，以及轉化或轉染有重組質粒的轉化體；
[0012]本發明的基因可用于制備亞單位疫苗；
[0013]本發明的蛋白用于制備用于病害防治的制品；
[0014]本發明蛋白還用于制備飼料添加劑或抗菌劑。
[0015]本發明的基因與免疫抗病密切相關，其基因表達量與病原刺激相關，其體外重組蛋白能夠明顯抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌及病毒的增殖，因此，在半滑舌鰨病害防治、綠色飼料添加劑及殺菌劑方面有應用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:本發明基因cDNA全長序列及氨基酸序列分析圖；
[0017]圖2:感染鰻弧菌后半滑舌鰨不同免疫組織中CsghClq基因表達水平分析；
[0018]圖3:半滑舌鰨CsghClq重組蛋白的SDS-PAGE電泳、蛋白純化及純化蛋白驗證圖；
[0019]其中:A:CsghClq重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，M代表蛋白marker ；1:pET_32a空載體轉化對照；2:PET-32a-ghClq誘導前；3:pET_32a-ghClq誘導；
[0020]B = CsghClq重組蛋白在細胞破碎后的SDS-PAGE電泳圖，M代表蛋白marker ;1、2分別代表超聲波破碎后菌液沉淀和上清中的蛋白；
[0021 ] C:純化CsghClq重組蛋白SDS-PAGE電泳圖，M代表蛋白marker ； I代表純化后的蛋白；
[0022]D:CsghClq重組蛋白的western印記，右側為marker ;左側是單一條帶western印記；
[0023]E:肽指紋圖譜和基峰。
[0024]圖4 =CsghClq重組蛋白對革蘭氏陰性菌抑菌曲線圖；
[0025]圖5 =CsghClq重組蛋白對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑菌效果圖。
[0026]A:CsghClq重組蛋白濃度0.lmg/ml時抑菌效果；B:CsghClq重組蛋白濃度0.025mg/ml時抑菌效果；C:不加CsghClq重組蛋白時金黃色葡萄球菌菌落。
[0027]圖6 =CsghClq重組蛋白對病毒的抑制效果圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖實例對本發明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0029]一、半滑舌鰨免疫相關基因CsghClq的克隆及其序列
[0030]半滑舌鰨CsghClq基因cDNA部分序列來自于中國水產科學研究院黃海研究所水產基因組學及細胞工程研究室構建的半滑舌鰨混合免疫組織cDNA文庫的EST，通過對克隆進行Sanger測序，獲得其cDNA全長，其全長序列為SEQ ID NO:1 (圖1)。并對cDNA序列及其編碼的蛋白質進行了分析，CsghClq蛋白序列為SEQ ID N0:2(圖1)。半滑舌鰨CsghClq基因的cDNA全長905bp，其中包括ORF (開放閱讀框)768bp，編碼255aa (氨基酸)以及5' -UTR(非編碼區)25bp，3' -UTRl12bPo利用SMART軟件分析推測的氨基酸序列，確定信號肽的位置為l_19aa ;61_102aa的位置為復合螺旋區；117_255aa的位置為補體Clq的球端；用Swiss-Model預測了 ghClq的球狀結構域模型,預測結果表明ghClq的球狀結構域是有10個β折疊形成的β桶的結構；并用ClustalXl.83對多序列進行了比對，比對結果表明CsghClq的球狀區高度保守(圖1)。
[0031]二、半滑舌鰨免疫基因CsghClq在鰻弧菌感染后的免疫組織中的表達模式
[0032]采用適時定量PCR技術分析了鰻弧菌感染半滑舌鰨后CsghClq基因在不同免疫相關組織(血液、肝臟、脾臟、小腸、頭腎、皮膚)的表達情況，表達分析結果表明，感染了鰻弧菌后，CsghClq基因在血液、頭腎、脾臟中迅速出現上調，在感染12h后，表達量都有不同程度的升高；而在腸、肝臟中，CsghClq基因在感染12h后表現為下調，在感染24h后，在腸、肝臟中的表達出現明顯上調。以上結果表明CsghClq基因參與了免疫應答(圖2)。CsghClq基因在不同組織中表達檢測的具體步驟為:
[0033](I)半滑舌鰨不同組織總RNA的提取及反轉錄:分別對感染組和對照組的半滑舌鰨(2齡)腹腔注射等量的鰻弧菌(0.2ml，滴度5.06 X 105CFU/ml)和PBS溶液，取感染后0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h和7d八個時間點的血液、肝臟、脾臟、小腸、頭腎、皮膚組織，用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用常規方法通過M-MLV反轉錄酶(Takara)反轉錄成cDNA。
[0034](2)實時熒光定量PCR反應條件
[0035]根據半滑舌鰨CsghClq基因cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物CsghClq-RT_F(5’ ATTTTCACAGCAACCGT CAAGG3’) CsghClq-RT-R (5，AATCACTCCCTGAGGTGTCCCA3’)，對半滑舌鰨不同組織((血液、肝臟、脾臟、小腸、頭腎、皮膚))中CsghClq的表達進行分析。
[0036]實時熒光定量PCR反應體系以及反應條件(20 μ I反應體系):
[0037]10 μ I SYBR Taq
[0038]0.4 μ I primer F
[0039]0.4 μ I Primer R
[0040]0.4μ I Rox RD II[0041 ] I μ I cDNA (lOOng/ μ I)
[0042]7.8 μ I H2O
[0043]反應條件如下:
[0044]95°C IOs ；95°C 5s, 60°C 34s, 40 個循環
[0045]感染了鰻弧菌后，CsghClq基因在血液、頭腎、脾臟中迅速出現上調，在感染12h后，表達量都有不同程度的升高；而在腸、肝臟中，CsghClq基因在感染12h后表現為下調，在感染24h后，在腸、肝臟中的表達出現明顯上調。以上結果表明CsghClq基因參與了半滑舌鰨的免疫應答(圖2)。
[0046]三、半滑舌鰨CsghClq基因原核表達載體的構建及其在大腸桿菌的重組表達和表達產物的分離純化
[0047]采用常規PCR技術，擴增了 CsghClq基因的開放閱讀框ORF區域，并將其克隆到pET-32a(+)表達載體上，構建了 CsghClq原核表達載體，將該表達載體轉化大腸桿菌BL21中，進行了 CsghClq基因的體外重組表達，獲得了重組表達產物，重組表達產物經過GE公司His-tag親和層析柱純化后，獲得了純化的CsghClq重組蛋白，重組蛋白分子量為46kD左右(圖3)。實現上述目標的具體方案如下:
[0048]1.CsghClq重組表達載體的構建方法:
[0049]對PET_32a (+)載體序列和CsghClq基因ORF區序列進行酶切位點分析，設計了含有酶切位點 BamH 1.Hind III 的特異引物 PET-32-CsghClq-F 和 PET-32-CsghClq-R，序列如下:
[0050](PET-32-CsghClq-F:CGCGGATCCATGGCGAGGTTGTCAGGGG, PET-32-CsghClq-R:CCAAGCTTTTAGATTGGAAAGACCAAAAAACCAC)
[0051 ] 以肝組織cDNA為模板進行PCR反應，擴增CsghClq編碼區。將PCR產物純化后與克隆載體PMD18-T連接，將陽性克隆進行測序。將測序正確的克隆質粒與PET-32a(+)同時用BamH I和Hind III進行雙酶切，瓊脂糖電泳回收CsghClq片段與表達載體質粒，按照連接酶說明書，用T4DNA連接酶連接，構建重組表達質粒PET-32a_CshClq，轉化大腸桿菌TOPlO感受態，將檢測陽性克隆進行測序，測序正確的克隆提取質粒。再將PET-32a-CsghClq質粒轉化表達感受態BL21 (DE3) pLysS細菌。
[0052]2.重組蛋白的誘導表達與表達產物的分析
[0053]將pet-32 a-CsghClq轉化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態中，挑取陽性單克隆到Iml含有終濃度50 μ g/mL氨芐青霉素的液體LB培養基中，37°C 200rpm搖動培養8h到對數生長期，按1:100擴大培養，37°C、200rpm振蕩培養至0D600為0.4-0.6，加IPTG至終濃度lmM，28°C、200rpm誘導表達6h。取Iml表達后菌液與對照組空載體和未誘導的菌液進行蛋白表達的SDS-PAGE電泳初步檢測，蛋白在46kDa有表達(圖3A)。菌液于4°C，8000r/min離心5min，收集菌體，濕菌體中加入裂解液(裂解液:每Ig濕菌體中加入結合緩沖液10ml，DNAase I20U，MgCl220U，PMSF400 μ I (50mM)，溶菌酶 400 μ I (10mg/ml)。其中，結合緩沖液配制方法如下:每1000ml水中加入磷酸鈉3.8g，氯化鈉14.61g，咪唑1.02g)，室溫裂解半個小時，然后冰浴中超聲破碎20min，破碎條件為超聲0.5s，暫停2s，功率為200W。在微量上清和破碎后的沉淀中分別加入等體積2 X SDS上樣Buffer，煮沸5min ;進行SDS-PAGE電泳，結果表明沉淀中蛋白含量明顯高于上清，CsghClq重組蛋白主要以包涵體的形式存在，結果見圖3B。
[0054]3.半滑舌鰨CsghClq重組蛋白的純化和驗證
[0055]重組蛋白的分離純化
[0056]將上述沉淀用7M尿素變性到基本溶解后，高速離心分離得到上清液，上清液用0.45 μ m微孔濾膜過濾后,經GE公司的HisTrap FF crude的純化柱過柱,具體操作如下:
[0057]首先，用5mL蒸餾水洗ImL柱子一次，隨后5ml結合緩沖液(20mM/L Na3P04,0.5MNaCl，20mM/L咪唑)洗柱子，再將收集的預處理的上清過柱子，流速為l_2mL/min，用5mL結合緩沖液洗柱子，再用5mL的洗脫緩沖液(20mM/L Na3P04,0.5M NaCl,500mM/L咪唑)洗脫一次，最后用5mL的結合緩沖液再生柱子。收集經過親和層析后純化的重組蛋白樣品進行12% SDS-PAGE電泳檢測，觀察到重組蛋白分子量為46kD左右，純化后的蛋白采用尿素透析液的濃度逐漸降低的方法復性蛋白，通過考馬斯亮藍方法檢測濃度，采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋 白定量試劑盒對純化后的蛋白進行定量分析，具體操作按照說明書進7TT。結果見圖3C。
[0058]重組蛋白的驗證
[0059](I)western-blotting
[0060]SDS-PAGE不連續電泳結束后，利用電轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，轉移至膜上時應注意膜對著正極、凝膠對著負極，轉膜時參數設置為200mA、lh ;轉膜結束后用5% (5g脫脂奶粉溶解在100mLl XTBST緩沖液中)脫脂奶粉封閉，封閉時間為3個小時；以ant1-His為一抗(過夜結合)，稀釋比例為1:7000、HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗(結合為2h)稀釋比例為1:5000，依次與PVDF膜結合，注意兩次結合前后都應該用I X TBST緩沖液洗滌目的膜；最后用北京中衫金橋公司的DAB顯色試劑盒進行顯色，操作按照試劑盒說明書進行。結果顯示純化蛋白條帶單一，且符合預測大小(46KD)，結果見圖3D。
[0061](2)質譜分析
[0062]考馬斯亮藍染色的目的蛋白切割下來后放在一個96孔板上，切割下來的膠首先要用60ul50mM的碳酸氫銨和50%氰化甲燒脫色兩次；然后,干的page膠在12.5ng/ μ I的胰蛋白酶和20mM碳酸氫銨消化液中低溫消化20分鐘，之后在37°過夜消化；最后，用提取液(5%的甲酸溶解在50的氰化甲烷)提取兩次，收集上清中的多肽。收集的上清多肽需要在氮氣保護的環境下干燥，用8ul的基質溶液(5mg/ml α -cyano-4-hydroxy-cinnamic aciddiluted in0.1%TFA, 50%ACN)重新溶解，然后在基質復制激光電離目的板上點樣，進行激光電解。使用ABSCIEX5800T0F/T0F質譜儀進行質譜分析。紫外激光設在400Hz的重復率，波長為355nm,加速電壓設定在20kv,蛋白質質量的分辨率最大設定在1600Da,質譜儀器的內部校準模式是采用胰蛋白酶消化的肌紅蛋白來進行校對的。所有獲得的樣品光譜是采用TOF/TOF ExplorerTM軟件的默認模式處理的。得到的數據在MASCOT網上進行搜索比對，搜索的參數如下:數據庫為表達理論序列，胰酶消化，允許最多一個錯誤斷裂，質譜允許偏差設定在百分之一，檢索的設置的容差范圍為0.6Da。結果顯示與預測氨基酸序列比對得分為202，大于16，說明此得分可靠；表達蛋白大小為28158Da，等電點6.49，測序結果覆蓋率為40%，說明該序列正確。肽指紋圖譜和Mascot檢測結果分別見圖3E、圖3F。
[0063]5.純化的CsghClq重組蛋白抑菌活性分析
[0064]采用打孔器打孔并測量抑菌圈的方法檢測CsghClq重組蛋白對革蘭氏陰性菌:哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、獲弧菌(Vibrioanguillarum)、的抑菌活活性，培養以上菌種至對數期，用PBS溶液稀釋菌液至濃度為IO7~IO8個/ml，取稀釋 后的菌液150 μ I涂平板，用6mm打孔器在每個平板上打五個孔，孔中分別加入2倍梯度稀釋的蛋白，以及10mg/ml的氨芐做對照，各20 μ 1，每次三個重復，28°C或者35°C (細菌最適生長溫度)培養箱培養12h后觀察并測量抑菌圈。抑菌的最小濃度視為最低抑菌濃度。半滑舌鰨CsghClq重組蛋白對革蘭氏陰性菌哈維氏弧菌、假單胞菌和鰻弧菌均有抑菌活性，都觀察到了明顯的抑菌圈。相同濃度的CsghClq重組蛋白對哈維氏弧菌的抑制作用最強，對鰻弧菌的抑制作用次之，對假單胞菌的抑制作用最低。對哈維氏弧菌、鰻弧菌、假單胞菌最小抑菌濃度分別為0.043mg/ml、0.087mg/ml、0.174mg/ml (圖4)。
[0065]用菌落計數法測量抑菌效果的方法檢測CsghClq重組蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活活性,培養金黃色葡萄球菌至對數期,用PBS溶液稀釋菌液至濃度為IO7~IO8個/ml，取稀釋后的菌液80 μ 1，加入20 μ I不同濃度的CsghClq重組蛋白涂平板，以及10mg/ml的卡那霉素做對照，各100 μ 1，每次三個重復，370C (細菌最適生長溫度)培養箱培養12h后觀察并測量抑菌圈。抑菌的最小濃度視為最低抑菌濃度。結果顯示CsghClq重組蛋白對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，最小抑菌濃度為
0.025mg/mlo 見圖 5。
[0066]6.純化的CsghClq重組蛋白對病毒的抑制作用分析
[0067]神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)通過勻衆方法從半滑舌鰨病魚組織獲得，將含病毒的勻漿上清液分別稀釋10倍和100倍感染半滑舌鰨頭腎細胞(第28代)，細胞在25cm2的培養瓶中培養，細胞接種密度為2X IO5個/ml，實驗組分為3組:一組為不同稀釋倍數的病毒感染組，一組為添加終濃度分別為0.06mg/ml和0.012mg/ml半滑舌鰨CsghClq重組蛋白的病毒感染組，另一組為正常培養細胞。每組設兩個平行樣。將細胞置于24°C培養。感染高濃度病毒(稀釋10倍)的細胞在19h開始出現CPE，兩個加入蛋白組的細胞都生長正常，CPE出現的時間有明顯推遲，圖6(a-c)。在44h比較各組細胞CPE程度，0.06mg/ml重組蛋白組的細胞CPE程度稍稍減輕，而加入0.012mg/ml重組蛋白組對病毒無明顯抑制作用，結果見圖6(d-f)。
[0068]對于感染低濃度病毒(稀釋100倍)的細胞，加入0.012mg/ml的蛋白，其CPE程度降低；而0.06mg/ml的重組蛋白對此濃度病毒抑制作用極顯著，基本沒有細胞病變圖6(g-1)。可見，半滑舌鰨CsghClq重組蛋白對病毒在體外培養細胞中的增殖有抑制作用。
[0069]四、CsghClq基因的應用
[0070]1.CSghClq基因可作為一個鑒定高抗病性半滑舌鰨個體的標記基因，取半滑舌鰨一小部分組織如抽取少量血液，剪取少量魚鰭等，提取RNA通過實時定量PCR技術，篩選同一時期本基因表達量顯著高于其他個體的半滑舌鰨進行家系培養，借此篩選獲得高抗病家系的半滑舌鰨品種；
[0071]2.將本蛋白進行加工改造，做成抗體，通過直接注射到半滑舌鰨的幼魚體內的方式提高半滑舌鰨的抗病能力，減少半滑舌鰨染病的幾率該蛋白來自半滑舌鰨物種本身，并且是小分子蛋白，基本不會產生排異反應；
[0072]3由于本蛋白具有抗菌活性，可以作為藥物釋放到半滑舌鰨的養殖環境中，降低環境中病原數量，而且可以對蛋白進行改造后，作為一種治療性的藥物，用來治療因病菌導致患病的魚體，借此部分替代抗生素的使用，減少抗生素使用產生的不良影響；
[0073]4.實驗中發現該蛋白具有較好的穩定性，可以在低溫下保存較長時間，并且具有較好的抗菌作用，可以通過發酵工程大量制備后，作為一種食品添加劑使用加入到食品如魚加工制品及其他熟食類食品，通過本蛋白的抑菌抗菌作用，減少腐敗菌在食物中的繁殖，借此防止食品的快速腐敗，實驗表明，本蛋白在低溫下可擁有數月的穩定性，足以滿足大部分食品的保險工作，本蛋白人體可消化吸收，小分子無抗原性，對人體無影響，綠色環保，大量使用可部分替代現有的防腐劑，減少對人體的損害。
[0074]五、CsghClq基因的衍生序列及功能分析
[0075]在構建CsghClq重組蛋白時，使用保真性最差的taq酶去擴增目的基因，獲得的序列存在堿基變化，借此獲得了多種差異序列，通過重組蛋白活性檢測發現只要gClq功能域中的關鍵氨基酸不發生替換，蛋白功能就不會發生變化這個實驗證明氨基酸的變化對蛋白的功能影響較小，說明即使在本發明的CsghClq蛋白的基礎上進行適當的改造并不會影響本發明蛋白的功能。 蛋白的功能在于擁有相應的功能域，本實驗通過使用氨基酸替代后，進行抑菌活性、抑病毒活性分析(參照本說明書三、半滑舌鰨CsghClq基因原核表達載體的構建及其在大腸桿菌的重組表達和表達產物的分離純化中記載的方法及檢測標準)，發現作出如下改變并不影響結構域的形成，進而不會影響蛋白功能:
[0076]1、N端19個信號肽氨基酸的缺失及任意改變，并不影響本蛋白的功能。
[0077]2、1_116號氨基酸屬于非功能域，其對應的基因進行定點突變導致的部分堿基的替換、添加、缺失不影響該基因表達出的蛋白具有本發明中蛋白的功能。將氨基酸序列為SEQ ID NO: 2的蛋白的前116個氨基酸進行相應改造后，還具有與氨基酸序列為SEQ ID NO: 2的蛋白相近的功能。
[0078]3、本發明基因編碼的蛋白具有一個疏水性內核，該內核由多個疏水殘基構成，主要包括 126 (F)、128 (A、V、M)、145 (L、I)、150 (V、I)、165 (F)、169 (V、I)、172 (V、A、L)、175 (F)、217(V、A、M)、219(L、I)、221 (L)、227 (V、1、M、L)、247 (F)、251 (L、I)、252(V、L、I)等氨基酸
殘基位點，通過對相應位點中的氨基酸使用不同氨基酸替換發現，仍可形成疏水性內核，故在本蛋白的基礎上對部分氨基酸進行替換不影響本蛋白功能。
[0079]幾個進行改造后的序列范例:SEQ ID NO:3的蛋白，相比于SEQ ID NO:2的蛋白，其在 123、124、164、172、221、223、261 位置的氨基酸分別由 k、1、T、K、Ι、Τ、I 變為 Q、V、A、Q、V、M、M后，抑菌活性、抑病毒活性沒有變化(P < 0.05);序列為SEQ ID NO:4的蛋白，相比于SEQ ID NO:2 的蛋白，其在 161、162、220、260、261 位置的氨基酸由 S、P、A、P、I 變為 D、S、V、Q、V后，原245和249位氨基酸之間增加N、D、Q氨基酸之后，抑菌活性、抑病毒活性沒有變化(P < 0.05)。序列為SEQ ID NO:5的蛋白，相比于SEQ ID NO:2的蛋白，原1-19位氨基酸存在缺失，原132-134位之間增加E、S氨基酸，在161、162、220、260、261位置的氨基酸由S、P、A、P、I變為D、S、V、Q、V后，原187、188位氨基酸G、E缺失，原213和214位氨基酸D、E缺失，抑菌活性、抑病毒活性沒有變化(P < 0.05)。序列為SEQ ID NO:6的蛋白，相比于SEQID NO:2的蛋白，原1-43位氨基酸存在缺失，原81-83位氨基酸存在缺失，原112-117位氨基酸存在缺失，原132-134位之間增加E、S氨基酸，在161、162、220、260、261位置的氨基酸由S、P、A、P、I變為D、S、V、Q、V后，抑菌活性、抑病毒活性沒有變化(P < 0.05)。序列為 SEQ IDNO:7 的蛋白，相比于 SEQ IDNO:2 的蛋白，其在 124、138、139、221、222、260、261 位置的氨基酸由1、1、V、1、L、P、I變為L、L、L、1、Q、L后，抑菌活性、抑病毒活性沒有變化(p< 0.05)。因此，本領域的技術人員可以通過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸來獲得本發明蛋白的衍生蛋白。
【權利要求】
1.一種基因，其特征在于，所述的基因編碼如下的蛋白質: a)氨基酸序列為SEQID NO:2的蛋白質； b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白質； c)在a)或b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有a)中蛋白質活性的蛋白質。
2.如權利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為SEQID NO:1。
3.一種蛋白，其特征在于，所述的蛋白由權利要求1所述的基因編碼的，包括有: a)氨基酸序列為SEQID NO:2的蛋白質； b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白質； c)在a)或b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有a)中蛋白質活性的蛋白質。
4.如權利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列為SEQID NO:3—7中任一項。
5.一種重組質粒，其特征在于，所述的重組質粒用于表達權利要求3所述的蛋白。
6.一種轉化體 ，其特征在于，所述的轉化體為轉化或轉染有權利要求5所述的重組質粒的菌株或細胞。
7.利要求I所述的基因在制備亞單位疫苗中的應用。
8.權利要求3所述的蛋白在制備用于病害防治的制品中的應用。
9.權利要求3所述的蛋白作為飼料添加劑或抗菌劑的應用。
10.一種具有免疫和/或抗菌效果的制品，其特征在于，所述的制品包含有權利要求3所述的蛋白或權利要求1所述的基因，其中所述的制品為飼料添加劑或抗菌劑。
【文檔編號】C12N15/12GK104004765SQ201410249584
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月7日 優先權日:2014年6月7日
【發明者】沙珍霞, 陳亞東, 曾艷, 向晉松, 路飏, 陳松林, 公光業, 王天姿, 邵長偉 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所