.0119mg，Ca/P質量比為1.688 ;實 施例2測得結果為，lmgPLGA-CaP中鈣元素含量為0. 02374mg，磷元素含量為0. 014647mg， Ca/P質量比為1. 621 ;實施例3測得結果為，lmgPLGA-CaP中鈣元素含量為0. 0431mg，磷元 素含量為〇. 〇276mg，Ca/P質量比為1. 56。
[0059] 實施例8 :HPV疫苗佐劑劑量優化實驗
[0060] 取實施例1制備得到的CaP-PLGA微球懸浮于lmL的pH= 5、lOmMPBS緩沖溶液中， 得到濃度分別為20mg/mL、6mg/mL和1. 6mg/mL的CaP-PLGA微球懸液；取HPV溶于lmL的pH =5、10mMPBS緩沖溶液中，得20ug/mL的HPV抗原溶液，將兩者等體積混合，吸附過夜，得 到2mL吸附有HPV抗原的CaP-PLGA懸液，即為HPV疫苗組合物。將以上制備得到的不同佐 劑含量的HPV疫苗組合物分別以每只小鼠每次注射100μL的劑量免疫BALB/c小鼠，采用 Merck公司的Gardasil鋁佐劑作為對照。免疫程序為免疫兩針，間隔四周，每只小鼠每次 注射0.lmL，第0天初免后，在第28天以相同的免疫劑量加強免疫，且初免后2周、4周，以 及加強免疫后1周采血樣檢測抗體應答水平和細胞因子水平。結果如圖7和圖8所示，結 果表明，不同微球量之間中和抗體無明顯差異，但與Merck組Gardasi1錯佐劑相比，400μg PLGA-CaP+1μgHPV組可以誘導與其相當水平的中和抗體水平；且400μgPLGA-CaP+1μg HPV組結合抗體水平顯著高于 80μgPLGA-CaP+1μgHPV組和 1000μgPLGA-CaP+1μgHPV 組，說明PLGA-CaP佐劑的優化劑量為400μg/dose，HPV與PLGA-CaP佐劑的優選比例為 2. 5μg/mg〇
[0061] 實施例9 :磷酸鈣與PLA聚合物的復合顆粒的制備
[0062]將100mg的PLA溶于20mL的二氯甲烷中作為油相（0)，配制lmL的0. 1M的氯化鈣 溶液作為內水相（W1)，配制1. 0%的PVA溶液作為外水相（W2);將0. 2mL的內水相（W1)加 入到油相（〇)中，通過均質乳化方法制備初乳W1/0,將初乳液加入到60mL的外水相中制備 預復乳液（W1/0/W2)，將此預復乳液采用快速膜乳化的方法反復壓過膜制備得到粒徑均一 的水包油包水的復乳液（W1/0/W2);然后向此復乳液中添加0.lmL的0. 05M磷酸氫二鈉溶 液，利用固化過程中內外水相的溶質擴散使內外溶質在乳液界面處接觸反應結晶析出，從 而制備得到CaP-PLA微球。圖9即是制備得到的PLA-CaP微球的SEM(冷場掃描電鏡）照 片，直徑約為1ym。
[0063] 實施例10 :以PLGA-CaP為佐劑，加纖維二糖，吸附HPV蛋白的抗原組合物制備
[0064] 將實施例1或2制備得到的PLGA-CaP微球懸浮于lmL的pH= 5、含lOmMPBS緩 沖溶液中，得20mg/mL的CaP-PLGA微球懸液；將纖維二糖溶于lmL的pH= 5、含lOmMPBS 緩沖溶液中，得到〇. 1M的纖維二塘；取HPV溶于lmL的pH= 5、含lOmMPBS緩沖溶液中，得 20ug/mL的HPV抗原溶液，將三者混合，吸附過夜，得到2. 5mL包含有纖維二糖且吸附HPV抗 原的PLGA-CaP懸液，即為HPV疫苗組合物。
【主權項】
1. 一種具有佐劑作用的復合顆粒，其特征在于該復合顆粒為粒徑分布在lOOnm~ 100μm之間的磷酸鈣與聚合物組成的復合顆粒，其中磷酸鈣是Ca與P摩爾比為0.1-5 : 1 的化合物或混合物；聚合物為帶負電，且zeta電位最小至_30mV的直鏈或有支鏈的聚合物、 均聚物、生物聚合物、共聚物,或其混合物；復合顆粒的zeta電位范圍是-5mV到+30mV。2. -種疫苗組合物，包含佐劑和抗原，其特征在于抗原與佐劑的比例為0. 01-80μg/ mg，所述佐劑包括如權利要求1所述的復合顆粒，所述抗原為HPV蛋白。3. 如權利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于HPV蛋白吸附于復合顆粒表面，以粒徑 分布在lOOnm~100μm之間的納微球形式存在。4. 如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物包含小分子免疫佐劑CpG、 MPLA、咪喹莫特、Polyl:C中一種或幾種的組合。5. 如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物所述抗原HPV蛋白為HPVL1 蛋白、HPVL2蛋白、或HPVL1+L2蛋白。6. 如權利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物所述HPV蛋白包括但不限于 1 ~4,6, 7,10,11，16,18, 26 ~29, 31，33, 35, 39,49, 51，52, 56, 58, 59 和 68 型之一的HPV的 VLP、五聚體或多聚體。7. 如權利要求1所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法為A方法或B方法： A方法：用含鈣離子的水溶液為內水相（W1)，PLGA溶于有機溶劑為油相（0)，將所述內 水相與油相按1 : 1-50,優選1 : 2-10體積比混合，制成油包水型（W1/0)預乳液，將此預 乳液按1 : 1-50,優選1 : 2-10體積比加入含表面活性劑的外水相（W2)中，攪拌，制得W1/ 0/W2型預復乳液，將所述W1/0/W2型預復乳液反復通過濾膜得到尺寸均一的W1/0/W2型乳 液，將W1/0/W2型乳液固化，過程中按Ca:P摩爾為0. 1-5 : 1的比例加入包含磷酸根離子 的溶液混合，洗滌、干燥后制成PLGA-CaP復合顆粒； B方法：將PLGA溶于有機溶劑為油相（0)，含表面活性劑的溶液為外水相（W)，兩相按 1 : 1-50,優選1 : 2-10體積比混合，制成水包油型（0/W)預乳液，將所述W/0型預乳液反 復過膜得到尺寸均一的0/W型乳液，將0/W型乳液固化，洗滌、干燥后制成PLGA顆粒，然后 先用包含鈣離子的水溶液與PLGA顆粒混合，再按Ca:P摩爾為0.1-5 : 1的比例與包含 磷酸根離子的水溶液混合，洗滌、干燥后得到PLGA-CaP復合顆粒。8. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的鈣離子鈣 離子為羥基磷灰石、無定型磷酸鈣、磷酸三鈣、磷酸八鈣、磷酸氫鈣、四水合硝酸鈣或氯化鈣 等可溶性鈣鹽，或者為它們的混合物。9. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的磷酸根離 子為磷酸氫二銨，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉和正磷酸中之一或其混合物。10. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的油相為 為乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或上述至少兩種以上的混合物。11. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的含有表 面活性劑的外水相（W2或W)為含有0. 001-10%的PVA水溶液，其醇解度為87~90%，聚 合鏈節數為1700-1750 ;或為含有0. 001-10 %的PVA-PEG混合水溶液，PVA與PEG的質量百 分比為 20-80 : 30-90。12. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的混合方 法包括但不限于通過均質、超聲或攪拌方式。13. 如權利要求2、3、4、5或6所述的一種疫苗組合物的制備方法，其特征在于該方法為 將復合顆粒作為佐劑溶于緩沖液體系，HPV蛋白作為抗原溶于緩沖液體系，將兩緩沖液體系 混合，配制成含有HPV抗原的微球懸液，制得HPV疫苗組合物。14. 如權利要求13所述的一種疫苗組合物的制備方法，其特征在于該方法緩沖液體系 為磷酸、硼酸、Tris、HEPES或MOPS緩沖液，pH值范圍4-10。15. 如權利要求2、3、4、5或6所述的疫苗組合物在制備治療或預防HPV病毒感染藥物 中的應用。
【專利摘要】本發明公開一種關于HPV病毒的新型佐劑疫苗，及該疫苗的制備方法。具體而言，本發明的新型佐劑為PLGA-CaP復合顆粒，該佐劑疫苗PLGA-CaP復合顆粒能夠對體內免疫產生應答，屬于開發高效的HPV蛋白疫苗組合物。
【IPC分類】A61P31/20, A61K47/04, A61K39/39, A61K47/34, A61K39/12
【公開號】CN105363029
【申請號】CN201410393066
【發明人】楊小杰, 張世艷
【申請人】張世艷, 楊小杰
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月12日