樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種腫瘤疫苗，特別是一種針對癌干細胞的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
【背景技術】
[0002]常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療及化療等。腫瘤疫苗為上述治療方法以外的另一種治療腫瘤的方法，是透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。
[0003]樹突狀細胞(dendritic cell)是公認最能表達抗原的細胞,會將抗原分解后呈現給可以發揮免疫效應和殺傷功能的T細胞，令免疫系統產生反應。樹突狀細胞腫瘤疫苗是攜帶腫瘤抗原信息的功能性樹突狀細胞，能激活專一性T細胞產生免疫反應，發揮抗腫瘤效應和免疫記憶功能。
[0004]現有技術中的樹突狀細胞腫瘤疫苗，都是以腫瘤細胞為標靶，即透過裂解腫瘤細胞所得到的抗原，并將該抗原負載到患者的樹突狀細胞上，但如此得到的樹突狀細胞腫瘤疫苗用于治療癌癥，往往不能解決腫瘤復發的問題，主要原因是未將腫瘤中的癌干細胞全部殺死，而造成癌組織死灰復燃的生長，甚至經由極少數的癌干細胞驅動腫瘤的形成。

【發明內容】

[0005]本發明的一方面涉及一種樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，包含下列步驟:(a)對一腫瘤組織進行原代分離和培養得到腫瘤細胞；(b)以流式細胞儀自腫瘤細胞篩選具有特定細胞表面抗原的癌干細胞；(c)將步驟(b)所得到的癌干細胞照射放射線；(d)分離樹突狀細胞；(e)將樹突狀細胞與(c)步驟所得的癌干細胞共同培養，得到混合樹突狀細胞和癌干細胞的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
[0006]根據本發明的一實施例，其中腫瘤組織為神經膠質瘤。
[0007]根據本發明的另一實施例，其中癌干細胞為神經膠質瘤干細胞。
[0008]根據本發明的再一實施例，其中特定細胞表面抗原為⑶133及⑶15。
[0009]根據本發明的又一實施例，其中放射線劑量為lOOGy。
[0010]本發明的另一方面涉及一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，為一樹突狀細胞和一癌干細胞混合而得。
[0011]根據本發明的一實施例，其中樹突狀細胞為自體樹突狀細胞。
[0012]根據本發明的另一實施例，其中癌干細胞為自體癌干細胞。
[0013]根據本發明的另一實施例，其中癌干細胞為CD133陽性細胞，特別是神經膠質瘤干細胞。
[0014]藉此，本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法可用于各種離體腫瘤組織進行樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備，特別是神經膠質瘤，而所制得的樹突狀細胞腫瘤疫苗不僅具有毒殺腫瘤細胞的能力，更對于癌干細胞具有特異性的毒殺作用，以解決以腫瘤細胞為標靶的腫瘤疫苗仍存在化學治療和放射性治療后腫瘤耐受性提高，而復發率高和轉移率高的問題。且本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗因為自體癌干細胞和自體樹突狀細胞，對于日后治療的免疫排斥性低，免疫的全面性和特異性也更好。
[0015]上述
【發明內容】
旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此
【發明內容】
并非本揭示內容的完整概述，且其用意并非在指出本發明實施例的重要/關鍵組件或界定本發明的范圍。
【附圖說明】
[0016]為使本發明知上述和其它目的、特征、優點與實施例能更明顯易懂，對【附圖說明】如下:
[0017]圖1為神經膠質瘤干細胞的單層細胞培養及神經球培養的顯微照片圖。
[0018]圖2A為比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于CD133陰性神經膠質瘤細胞毒殺作用的流式細胞儀結果圖。
[0019]圖2B為比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于⑶133陽性神經膠質瘤細胞毒殺作用的流式細胞儀結果圖。
[0020]圖3為比較例和本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于神經膠質瘤干細胞毒殺作用的顯微照片圖。
[0021]圖4為本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗對神經膠質瘤干細胞毒殺作用的顯微照片圖。
[0022]圖5為本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗對神經膠質瘤干細胞毒殺作用的量化圖。
【具體實施方式】
[0023]本說明書揭露內容提出一種樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法，其自腫瘤組織分離腫瘤細胞，并進一步篩選癌干細胞，再將癌干細胞照射放射線后，與分離好的樹突狀細胞共同培養，得到混合樹突狀細胞和癌干細胞的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
[0024]本發明前述所稱的「癌干細胞(cancer stem cells, CSCs)」是腫瘤組織中存在極少量且具有自我更新能力(self-renewal)和分化潛能(differentiat1n potency)的細胞，癌干細胞并具備放射線抗性(rad1resistance)和化學抗性(chemoresistance),為腫瘤在接受放射線治療或化學治療后，呈現阻抗性的臨床現象，是造成癌癥病患對于治療產生抗性、腫瘤容易復發，以及轉移的重要關鍵。
[0025]本發明前述所稱的「多形性膠質母細胞瘤(gl1blastoma multiforme, GBM)」是神經膠質瘤(gl1ma)中的惡性星狀細胞瘤，為惡性腦腫瘤中最嚴重的一種。傳統治療多形性膠質母細胞瘤的方法為手術、放射療法和化療，但因多形性膠質母細胞瘤的浸潤性非常高，所謂「浸潤性」是因大腦中的膠質細胞為神經系統中的組成單位之一，提供支持、供給營養、維持環境恒定及提供絕緣等功能，故神經膠質細胞會緊緊包覆住神經軸突，由于軸突很長，如果神經膠質細胞發生癌變，癌細胞會順著軸突蔓延至遠方。因手術無法切除癌細胞遙遠浸潤部分，所以術后容易造成殘瘤，術后需再輔以化學及放射治療，但又因存在具放射線抗性和化學抗性的癌干細胞，治療后復發率相當高。
[0026]本發明前述所稱的「CD133」是一個具有5個跨膜區域的糖蛋白，首次于成體血液、骨髓與胚胎干細胞中分離出的CD34陽性前體細胞中被辨識，而被視為造血干細胞的標志，而后CD133更被認為是血癌、腦癌、視網膜母細胞瘤、腎臟癌、胰臟癌、前列腺癌、肝癌、髓母細胞瘤以及神經膠質瘤的癌干細胞的細胞表面標志。CD133陽性的增生和自我更新能力更勝于一般的腫瘤細胞，且具有致腫瘤性(tumorigenicity)與球體形成(sphereformat1n)等癌干細胞的特性。
[0027]下文提出多個試驗例來說明本發明的某些方面，用以有利于本發明所屬技術領域中普通技術人員，可在不需過度解讀的情形下完整利用并實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明范圍的限制。
[0028]試驗例1:神經膠質瘤干細胞的分離與培養
[0029]收集多形性膠質母細胞瘤組織，先以生理食鹽水清洗并將其剪碎，再以木瓜蛋白酶分解系統(Worthington B1chemical)試劑盒將細胞打散。將已打散的多形性膠質母細胞瘤細胞以干細胞培養液[添加B27補充液、10ng/mL表皮生長因子Epidermalgrowth factor, EGF)和 lOng/mL 喊性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growthfactor, bFGF)的神經細胞培養基(Neurobasal_A medium)]再懸浮至少6小時，使多形性膠質母細胞瘤細胞再表達細胞表面抗原。加入接有PE或APC的⑶133和⑶15抗體(MiltenylB1tec.1nc.)于上述已打散的多形性膠質母細胞瘤細胞中，以標定⑶133和⑶15細胞表面抗原，并以流式細胞儀(fluorescence-activated cell sorting, FACS)或磁珠來篩選同時具有CD133和CD15細胞表面抗原的細胞，此即為神經膠質瘤干細胞。將篩選出的神經膠質瘤干細胞培養于干細胞培養液中，并置于37°C含5% C02培養箱內。
[0030]試驗例2:神經膠質瘤干細胞的鑒定
[0031]本試驗例以體外和體內試驗進一步得確認所篩選到的細胞為神經膠質瘤干細胞。于體外試驗，以限制稀釋法(limiting dilut1n assay)、基因表達分析及Western印跡法分析細胞特性。于體內試驗，將所篩選到的細胞經由皮下注射(subcutaneous inject1n)和將細胞注入原發位置(orthotopic inject1n)來鑒定篩選到的細胞的致腫瘤性。
[0032]試驗例2-1:限制稀釋法
[0033]將神經膠質瘤干細胞進行神經球培養，先將3 X 106的活細胞接種于6公分細胞培養皿，再將球形細胞分離并稀釋后接種于96孔盤中，每個孔含有0.2mL干細胞培養液，而細胞的稀釋范圍為200至1細胞/孔，之后每2天會再加入0.025mL的干細胞培養液于每個孔中直到第7天，并計算每1孔形成至少1個神經球所需的細胞數量。該分析法于神經膠質瘤干細胞分離的第0天時即測試，以確認所篩選到的細胞是否具有癌干細胞特性。
[0034]參照圖1，為神經膠質瘤干細胞的單層細胞培養及神經球培養的顯微照片圖，可見神經膠質瘤細胞培養于含有胎牛血清的培養液中，細胞貼附于細胞培養皿上，且細胞型態為向外伸展，當照射放射線時，神經膠質瘤干細胞開始聚集，而神經膠質瘤細胞的型態未改變，細胞與細胞的間仍保有距離。而以干細胞培養液培養神經膠質瘤細胞時，神經膠質瘤細胞仍貼附于細胞培養皿上，但神經膠質瘤干細胞則形成球狀，當